3株鸭源呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞致病性研究

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1、华中农业大学硕士学位论文3株鸭源呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞致病性研究姓名：余爱花申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：胡薛英2012063株鸭源呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞致病性研究摘要本研究分别将本实验室先后分离鉴定并保存的3株(HP09318株、HP080421株、HP081122株)鸭源禽呼肠孤病毒(DuckReovirus，DRV)人工感染鸭胚和鸭胚成纤维细胞(Duckembryofibroblast，DEF)，运用细胞培养技术、光镜、电镜、RT-PCR、ELISA等多种研究方法，分别对感染鸭胚成纤维细胞后，病毒的增殖情况、细胞的病理变化、TNF．伍表达水平进行系统

2、的研究。人工感染鸭胚结果显示：3株DRV经绒毛尿囊膜途径接种于9--一lld鸭胚，胚体在3--一6d内全部死亡，胚体发育不良，个体偏小，全身皮肤出血，肝脏表面可见黄白色坏死点。3株DRV接种于DEF的病理变化：24h开始出现细胞病变，表现为细胞变圆，细胞内出现空泡，部分细胞发生溶解，48h病变加重，大量死亡细胞悬浮于培养基中，其中可以见到悬浮的巨细胞。细胞经H．E染色后，镜下可见细胞呈拉网状，部分细胞坏死，核碎裂，并且可见含有多个细胞核的巨细胞。在细胞质中观察到嗜酸性的包涵体颗粒。将细胞制作超薄切片，在透射电镜下观察，感染细胞出现大小不一的囊泡，可见板层样结构，细胞质中可观察到

3、病毒颗粒。3株DRV在DEF中的增殖规律：在接种病毒后12h、24h、48h、72h和96h分别收集细胞、细胞培养夜以及两者的混合物，应用荧光定量RT．PCR方法检测病毒含量，结果显示，接毒后12h三者中病毒含量均较低；24h三者病毒含量都呈上升趋势，而且细胞与混合物中病毒含量最高；48h细胞与混合物中病毒含量相比24h下降，而细胞培养液中病毒含量达到最高；48h，--96h三者病毒含量呈降低趋势。3株DRV病毒感染DEF后TNF．d含量变化：应用ELISA方法检测其蛋白水平，结果显示接种后12h对照组中TNF．0【的含量高于接毒组，24h以后对照组与接毒组中TNF一0【含量均

4、呈增加趋势，且接毒组高于对照组，96h检测接毒组中TNF．a含量下降低于对照组；荧光定量RT-PCR方法检测其mRNA表达水平，结果显示DEF在接种DRV后24h'～48hTNF．amRNA表达水平明显上调，96h后TNF．a基因表达水平下调。结果表明：本实验室分离保存的3株鸭源呼肠孤病毒可以在DEF中成功复制增殖，并致使细胞产生明显的病理变化，被感染细胞透射电镜下可观察到形态一致病毒颗粒。3株DRV感染细胞导致接毒组与对照组细胞中TNF．Gc表达水平存在明华中农业大学2012届硕士研究生学位论文显差异，3株DRV感染DEF后，病毒的增殖、病毒所致细胞的病理变化与细胞中TNF．

5、a表达水平三者之间呈正相关。关键词：鸭源禽呼肠孤病毒；细胞培养；病毒增殖；TNF-alI3株鸭源呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞致病性研究Abs仃actInthisstudy，duckembryoandDuckEmbryofibroblast(DEF)wereinfectedwiththreevirusstrains(HP09318strain、HP080421strain、HP081122strain)isolatedinOUrlaboratory．Theproliferationofthevirus，pathologicalchangesandTNF—acontentchange

6、swerestudiedusingcellculturetechnology，lightmicroscopy，electronmicroscopy，real—timeRT—PCRandELISA．Theresultsareasfollows：Theresultofartificialinfectionofduckembryo：9～11dayoldduckembryoweregivenallantocherioninjectionofthreeDRVstrains．Theresultshowedthatembryoproperdiedinthreetosixdayswithsym

7、ptomsofdysplasia，hemorrhage，andyellowish-whitenecroticspotsonthesurfaceofliver．PathologicalchangesofDEFinfectedwiththreestrains：TheinfectionofmonolayersofDEFwithDRVcausesacytopathiceffect(CPE)at24hourpostinfection(hpi)．theinfectedcellsmanifestround