鸭rig-ⅰ基因的克隆及其抗鸭呼肠孤病毒感染的功能检测

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1、分类号S852.6密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文鸭RIG-I基因的克隆及其抗鸭呼肠孤病毒感染的功能检测MolecularcloningofduckRIG-IgeneanditsfunctionintheprocessofDuckreovirusinfection王同淑指导教师姓名刘光清研究员（上海兽医研究所上海200241）吴润教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称预防兽医学研究方向兽医微生物学与免疫学论文答辩日期2015年6月2日学位授予日期2015年6月日答辩委员会主席刘永生研究员评阅人景志

2、忠研究员包世俊副教授2015年6月ClassificationNo.：S852.6Secrecylevel：ZeroUDC：Schoolcode：10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeMolecularcloningofduckRIG-IgeneanditsfunctionintheprocessofDuckreovirusinfectionPostgraduate:WANGTong-shugAdvisor:Prof.LIUGuang-

3、qingProf.WuRunSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:VeterinaryMicrobiologyandImmunologySubmittedTime:June.2015Address:Lanzhou,China,730070甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要摘要2011年太湖突发以鸭软脚，排白色稀粪为主要特征的传染病，发病率达40%，病死率达10%～20%，带给养鸭业较大的经济损失。其病原为呼肠毒病毒(DRV)，双链无囊膜,属于RNA病毒，至今

4、，关于该病毒的感染与免疫机制还不清楚。RIG-I识别胞质内的RNA病毒，很快启动多种信号级联反应，激活合成一系列细胞因子，如I型干扰素，起到抗病毒感染天然免疫的作用。RIG-I可辨识包括DRV在内的双链RNA(dsRNA)病毒。但是，其在抗DRV感染过程中的作用及其机制尚不清楚。本研究在克隆鸭的RIG-I基因的基础上，采用已建立的定量RT-PCR方法，结合其它方法，检测了鸭RIG-I抗鸭呼肠孤病毒感染的功能，为深入探究鸭的抗病毒感染天然免疫及DRV的感染机理等奠定了基础。1．鸭RIG-I全基因的克隆根据已发表的鸭RIG-I基因

5、序列，设计并合成了扩增樱桃谷肉鸭RIG-I全基因的一对引物。序列分析结果表明樱桃谷肉鸭的RIG-I全基因长2802bp，含有一个读码框(ORF)，编码933个氨基酸。鸭RIG-I基因具有RLR家族的典型特征，N端由两个半胱天冬酶活化和募集结构域组成，C端由RNA解旋酶，ATP结合结构域，RNA结合结构域和抑制结构域RD组成，RIG-I蛋白第806～929位之间是高度保守的结构功能域。序列比对分析结果显示，樱桃谷肉鸭RIG-I的序列与已报道的番鸭RIG-I序列同源性最高，为98.4%～99.8%，与鹅的同源性较高，为95.9%；

6、但与人、鼠、草鱼的同源性较低，分别为62.3%、61.5%、61.2%；与猪的同源性最低，仅为54.4%，表明RIG-I基因在不同种属之间存在很大差异性。2.DRV荧光定量PCR检测方法的建立将标准品质粒pET-30a-DRVδC（本实验室保存）定量后,10倍稀释,做8个稀释度，每个稀释度3个重复，系统自动生成标准曲线。本研究成功建立DRV标准曲线，相关系数R2=0.998，系统生成的回归方程为:Y=－3.458x＋42.19,最低可检测底物浓度为100copies/L。3.鸭RIG-I荧光定量PCR检测方法的建立我们扩增鸭

7、RIG-I基因，将其克隆到PEASY-T5载体上，测序正确后，将其定量后作为重组标准品质粒10倍稀释，做8个稀释度，每个稀释度3个重复，进行实时荧光定量PCR扩增反应，系统自动生成标准曲线，本研究成功建立鸭RIG-I标准曲线，相关系数R2=0.998，系统生成的回归方程为:Y=－3.327x+33.01，溶解曲线峰单一，最低可检测底物浓度为10copies/L。4.鸭RIG-I转染细胞对DRV复制的影响为了验证鸭RIG-I是否具有抗病毒功能，我们将duRIG-I转染DEF和DF1细胞，感染DRV后发现其均能增强I型干扰素和M

8、x活性，病毒滴度降低。本研究表明外源表达鸭RIG-I可发挥抗DRV效应。5.内源性鸭RIG-I在抗DRV病毒感染中的作用为了验证duRIG-I是否引起DRV先天性免疫，我们首先检测了鸭RIG-I组织分布，然后用DRV分别感染DEF和鸭，发现DEF感染DRV后duRIG-ImR