鸭tlr4基因的克隆及其功能初步研究

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1、现代农业产业技术体系建设专项(CARS．43．3)江苏省高校自然科学基础研究面上项目(07Km230138)资助SupportedbyEarmakedFoundforMordemAgro—industryTechnologyResearchSystem(CARS一43—3)andNatureScienceBasicResearchofProvincialCollegesandUniversitiesAffiliatedtoJiangsuProvince(No．07KJB230138)扬州大学动物科学与技术学院2013年6月黄正洋：鸭TLR4基因的克隆及其功能初步研究

2、鸭TLR4基因的克隆及其功能初步研究姓名：黄正洋导师：赵文明副教授专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)中文摘要Toll样受体(Tolllikereceptor，TLRs)是一种介导天然免疫和获得性免疫的病原模式识别受体(Patternrecognitionreceptors，PRRs)，能识别表达在病原微生物上的高度保守的病原相关分子模式(Pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs)，并将信号向下游传递，启动和调节机体的免疫反应。目前TLR4已成为TLRs家族之中研究最热门的成员之一。TLR

3、4作为动物疾病易感性相关的候选基因，小鼠等生物上存在TLR4基因的可变剪接体，TLR4功能又如何，目前尚未见有报道。已被广泛认可。且最近研究发现在猪、绵羊、而在鸭上是否也同样具有可变剪接的形式，本研究通过克隆、鉴定鸭TLR4基因及其可变剪接体，利用qRT-PCR分析各可变剪接体在鸭组织及在LPS刺激鸭胚成纤维细胞前后表达变化，确定主要剪接形式。并构建pcDNA3．1+-TLR4过表达载体，瞬时转染到鸭胚成纤维细胞，利用polyI：C和LPS模拟病毒和细菌来建立病毒和细菌感染模型，探讨TLR4信号通路中IL．1p、IL6和MHCII等相关基因表达变化，研究旨在初步探明

4、鸭TLR4基因可变剪接形式的存在性，及阐述主要剪接形式的结构和表达特征，初步阐明TLR4基因在鸭抵抗细菌感染和病毒感染中的功能，为今后研究禽类天然免疫奠定基础，同时也为培育天然抗病鸭品种提供基因资源。1．本研究利用RT-PCR和LD．PCR技术，获得了鸭TLR4基因CDS序列以及DNA序列全长，结果发现，duTLR4基因长为2532bp，包含3外显子和2内含子，并获得鸭TLR4基因一种新的可变剪接体(TLR4b)，长为3367bp，经鉴定其剪接形式为跨内含子剪接。2．采用qRT-PCR检测两种可变剪接体在各组织中的表达，结果发现在胸腺、肺、脾脏、肝脏、肾脏等组织中，

5、TLR4a基因的表达量都远高于TLR4b。通过构建LPS感染鸭胚成纤维细胞(DEF)模型，利用qRT-PCR方法检测TLR4a、TLR4b基因在空白组、LPS感染处II扬州大学硕士学位论文理组不同感染点的mRNA表达量，结果表明，TLR4基因的表达主要以TLR4a为主，且在LPS抗原刺激后，DEF细胞中TLR4amRNA表达量总体表现为先上升，后下降，而TLR4b表达总体变化不大，表明TLR4其功能主要取决于TLR4a。3．为了进一步探讨duTLR4a功能，构建了pcDNA3．1+-TLR4真核表达载体，瞬时转染入DEF，经LPS和polyI：C刺激后，qRT-PC

6、R检测结果显示，在LPS和polyI：C刺激12h内，IL．1p、IL6和MHCII表达量都升高，且具有时效关系。为进一步验证TLR4a在抗病毒感染中作用，通过构建PolyI：C感染雏鸭活体模型，利用qRT-PCR方法检测TLR4amRNA不同组织中的的表达量，结果表明，在podyI：C等抗原刺激后，肺、脾脏等组织中TLR4amRNA表达量总体表现为先上升，后下降。实验结果进一步证实了duTLR4不仅在机体抗细菌感染发挥作用，而且在抗病毒感染过程同样发挥了重要作用。关键词：鸭；TLR4基因；可变剪切体；基因功能黄正洋：鸭TLR4基因的克隆及其功能初步研究Molecu

7、larCloningofTLR4anditsFunctionalAnalyseinDuckM．S．Candidate：ZhengyangHUANGAdvisor．WenmingZHAOMajor*AnimalGenetics，BreedingandReproduction(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009)AbstractToll·likereceptors(TLRs)areonekindofpatternrecognitionreceptors(PRRs)