猪乙型脑炎病毒SH0601株基因组序列分析及全长cDNA的构建

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文章编号：1002-2694(2008)02-0140-05猪乙型脑炎病毒SH0601株基因组序列分析及全长cDNA的构建郑浩，余丹丹，孙志，高飞，袁世山摘要：目的对務源乙型脑炎病♦SH0601株进行全序列测定与分析•以了解该株病毒的遗传特征•并构建全长cDNA克隆•方法将精源JEVSH0601株基因组RNA分5段进行RT-PCR并克隆入pCRII-Blunt-TOPO和pBluescript載体中.测定了全长cDNA序列.根据cDNA克隆障切图谱分析•将5个片段先后克隆入pBluescript中构建JEV全长基因组cDNA.根据E爰白基因序列对SH0601株进行了遺传分型。结果序列分析表明，SH0601株基因组全长10977nt,与GenBank中的Beijing-1、P3、SA14和SA14-14-2株基因组全长相比•在3'NTR的10701nt处多一碱基“G”・与上述4株病聲的全长核昔酸的同源率都达97.2%以上•而与国外猪源分海株KV1899和JEV/sw/Mte/41/2002全长核昔酸的同源率仅达8&7%•但SH0601株与6株病毒的全长氨基酸同源率均达97.0%以上.以E畫白基因序列对SH0601作进化分析•该分离株属基因型ID型.结论SH0601株属于乙型脑炎病毒基因皿型・在离拷贝质粒pBluescript中可构建稳定的乙型脑炎病毒全长cDNA克隆.关律词：乙型脑炎病廿$病序基因组；全长cDNA克隆中图分类号:R512.3文献标识码：AGenomicsequencingandcDNAcloningofJapaneseencephalitisvirusSH0601strainIsolatedfromporcineZHENGHao,YUDan-dan,SUNZhi,GAOFei,YUANShi-shan{DepartmentofAnimalInfectiousDisease«ShanghaiVeterinaryResearchInstitute♦ChinaAcademyofAgriculturalSciencetheKeyLaboratoryofAnimalParasitologyChineseMinistryofAgriculturenodeletionofSH0601sequencewasfound«whileaWGHwasinsertedin10701bpof3’NTRofSH0601♦and97.2%nucleotideidentitywasdetectedamongthem.However•thesimilarityofnucleotidesequencebetweenSH0601andKV1899Email：shishanyuan@hotmaiLcom作者童位：中国农业科学洗上海*医研克所•动物伶染擠防治研克宣，上海200232litisVirus,SLEV）和Kunjin病毒构成乙型脑炎血清群⑵。JEV基因组是一单股正链RNA,约11 kb,仅由单一开放阅读框翻译，编码3种结构蛋白（C、prM、E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）〔"。我国是乙型脑炎的高发区，对JEV的研究多集中在人源株，而人感染大多是猪群中JEV经蚊传播引致的。因此，防制猪乙型脑炎病毒是预防人乙型脑炎的重要一环，也有助于提高养猪业的经济效益。本文以一株猪源JEV为研究对象，分析该株病毒基因组特征，并构建全长cDNA克隆，对了解我国JEV的遗传变异状况、开展猪JEV的防治具有重要意义，同时也为建立JEV反向遗传操作系统、研制新型兽用疫苗奠定基础。1材料与方法1.1毒株JEVSH0601株•为猪源分离病痺•由上海进出口检验检疫局李树青研究员提供.经亂脑传代2次，冻存于-7or・1.2菌株与质粒大肠杆菌TOP10感受态细胞•购自北京TIAGEN生物公司；pCR-BluntH-TOPO和pBluescript,ln-vitrogen公司产品.1.3主要试剂SuperScrip严口ReverseTranscriptase*购自Invitrogen公司）PfuUltra™HotstartHigh-FidelityDNAPolymerase•购自Stratagene公司RNaseH,购自NEB公司；TRIzoLInvitrogen公司产品iNuclease-FreeWate.Am-bion公司.小值质粒快速提取纯化试剂盒•上海华舜生物工程有限公司"卜僮DNA片段快速回收试剂盒•北京博大泰克生物基因技术公司.1.4引物合成比较GenBank中公布的JEV全基因组序列，以P3株（U47032）为参照序列，将全基因组分成五个互相重叠片段•用PrimerPremier5.0软件设计引物.引物委托上海桑尼生物公司合成，序列见表1.*1全基因组RTPCR引徇Table1RT-PCRprimersforcompletegenome引物名称引物序列（5,—3，）在参考序列中位置（nt）PrimerNameSequence(5'—3')Location(nt)PJEFPagaagtttatctgtgtgaacttcttg1-26PJER2666cagtctagtgacagatctgactccg2642-2666PJEF2164ggcacaaagctggaagcacgc2164-2184PJER5609atggattggggcatttgagtc5589-5609PJEF4656gacaccaccacaggagtctaceg4656-4678PJER7380tggegaccattccgtcaacaac7359-7380PJEF7114cgctggcctcaateaactcac7114-7134PJER9123etccaagccacatgaaccaa9104-9123PJEF8912ageagtgttcgctgaacagaatc8912-8934PJER10976agatcctgtgttettcctcaccacc10956-10976PJEF1/T7gtaatgcggccgctaatacgactcactatagagaagtttatctgtgtgaacttcttgPJER10976/Kpnaggggtaccagatcctgtgttcttcctcaccacc*引物名称中第4位字母“F”表示上游引物・“R”表示下游引物.斜体字母为酵切位点，下划线为T7启动子序列.1.5病SRNA的提取取含JEV的服脑0・lg・加lmlTRIzol试刑•于经DEPC水处理灭菌的碾磨器中•将其碾碎，参照TRIzol使用说明书，提取病奉RNA・RNA以Nu・clease-FrceWater涪解，保存于一70C・1.6JEVSH0601株基因组片段的RT-PCR参照Super-Scrip严nReverseTranscriptase产品说明书•以每个片段的下游引物为RT引物，每个片段的RT反应体系20卩1・包括引物lpl»Nuclease-FreeWater5卩1,dNTP（2・5mmol/Leach）2小vRNA5pl•混匀・65€水浴5min・随后迅速置冰上冷却•稍加离心使溶液至管底，加5XFirst-StrandBuffer4R和0.1mol/LDTT2R,混匀，42*C水浴2min.加“1SuperScript™DRT,混匀，42C水浴50min.反应结束后70*C水浴15min灭活，置于冰水冷却，加加RNaseH.37€反应20min.合成cDNA保存于一20€・PCR扩堆参照PfuUltra™HotstartHigh-FidelityDNAPolymerase产品说明书进行.每个PCR体系50卩1・包括10XPfuUltraHFReactionBufffer5pl・dNTP（2.5mmo!/Leach）4pl,PfuUltra™HotstartHigh-FidelityDNAPolymerase1.2川・上、下游引物各lMl（5Mmol/L）,cDNA2门・补充水至50m1.按常規PCR条件扩堆•退火温度和延伸时间以毎对引物的Tm值及其扩堆片段的长度作出相应调整.1.7RT-PCR产物的克隆和克隆质粒序列测定RT-PCR产物以博大泰克小fitDNA片段快速回收试剂盒回收，冥体操作按产品说明书进行.扩堆的二、三、四和第五片段克隆进pCR-Bluntn-TOPO.#照说明书，每个反应体系6卩1,包括：回收产物4.4R、Sahsolution1M1和pCR-BluntU-TOPO1mU22V连接30min.转化TOP10感受态细胞.第一片段经SacI許切后连接入pBluescript.转化TOP10感受态细胞・ 细菌培养温度降至28C.聘切鉴定阳性质粒•委托上海英骏生物公司进行序列测定。1.8全长eDNA的构建应用PJEF1/T7引物•将第一片段5'端引入T7序列；应用PJER10976/Kp”I引物，在第五片段3,端引入Kp”I酶切位点.根据每个质粒的序列•利用DNASTAR中的MapDraw软件绘制毎个质粒的限制性内切師師切图谱.经过适当的酶切•将5个质粒中的JEV片段在pBlucscript中拼接成一全长eDNA克隆.1.9序列分析应用DNASTAR中的ScqMan软件，将测得序列进行拼接•获得的结果登录GenBank,同时以Gen-Bank中已发表的国内JEV株P3%Beijing-1.SA14.SA14-14-2和阖外猪源分离株KV1899JEV/sw/Mic/41/2002序列作为参照•分析SH0601株与它们在核秆酸用列上的同源性•并分析病常朿要蛋白E蛋白氨基酸替代状况.利用CLUSTALX中的neighbor-joining（NJ）方法将SH0601株序列与GenBank中乙型脑炎病毒株序列作多帝比对和进化分析•根据Shirish和Pradeep建立的方法心,以TreeView软件绘制进化树.2结果2.1RT-PCR扩增利用设计的5对特异性引物，经RT-PCR扩增获得了5个片段（见图1一4）,其大小分别为2666bp、3446bp、2725bp、2OlObp和2065bp,与预期大小相符。图1第I片段电泳图Fig.1TheelectrophoresisresultofNo.1fragment1:MarkerDL15OOO；2：No.1fragment2.2全长eDNA的构建将5个片段克隆入pBluescript和pCR-BluntU-TOPO后（见图5）,根据所含片段的序列绘制质粒的酶切图谱。按图6所示构建全长cI）NA。全长eDNA质粒以EcoRV酶切鉴定，如图7所示，Ec。RV可将全长质粒酶切成长分别为1914bp、2568bp、4311bp和5065bp的4个片段。2.3序列分析5个片段经测序拼结后，获得了SH0601株基因组全序列，其全长为10977bp,Gen-Bank登录号EF543861O基因组中核昔酸组成为：bp250图2第2片段电泳图Eig.2TheelectrophoresisresultofNo.2fragment;1:MarkerDL15OOOi2：No.2fragmentbp图3第片段电泳图Fig.3TheelectrophoresisresultofNo.3andNo.4fragment；1:MarkerDL2OOO；2：No.3fragment；3：No.4frag・mentbp2000100050010012图4第5片段电泳图Eig.4TheelectrophoresisresultofNo.2fragment；1:MarkerDL2OOO»2:No.5fragmentA占27.70%.G占2&40%、T占20.84%、C占23.06%。与国内分离株P3.Beijing-1和SA14及疫苗株SA14-14-2相比，核昔酸序列同源性在97.2%以上，不存在碱基的缺失，SH0601株仅在39 bp15000500025001000250图5克隆质粒电泳图Fig.5Theelectrophoresisresultofclonedplasmids1:MarkerDL15000；2：pJEVCli3：pJEVC2;4：pJEVC3pJEVC4；6：pJEVC5>7：pJEVNTR的10710nt处有一核昔酸“G”的插入。与国外猪源分离株KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002的基因组全序列相比•核昔酸序列同源性在8&7%以上,KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002在3，NTR的10395nt至10408nt处核昔酸缺失。SH0601株基因组结构分为3部分：5'端为95个核昔酸的5,端非翻译区(5，ZTR),随后为含10299个核昔酸的单一开放阅读框，最后以583个核昔酸的3'端非翻译区(3*NTR)结尾。在推测的全长氨基酸序列上，SH0601株与上述6株的同源性都达97.0%以上。2.4进化分析从GenBank中选取31株不同基因型的JEV,以E蛋白基因序列为基础作进化分析，并以西尼罗河病毒Mex03株序列作分类参照,构建进化树(图8)。如图所示，绘制的进化树与WangX_NTREncodingRegionNotIS«clBamHIAcllSacIIKpnljJEVCl-2■ypJEVpJEVC3^pJEVC4i-pJE584寺pJEVC3-4-5pJEVC5图6全长cDNA构建Fig.6ConstructionofthecompletecDNA图7全长cDNA质粒的EcoRVSI切鉴定Fig.7Identificationoffull-lengthcDNAclonesbyEcoRV1:Marker【)L2000；2:pJEV/1»3：pJEV/2i4：pJEV/3»5：pJEV/4;6：pJEV/5|7：MarkerDL15000和Alyssa建立的进化树具有相同的拓扑形株病毒分成五簇＞SH0601与我国JEV代表株P3、Beijing-1和SA14同属于JEV基因皿型。2.5E蛋白序列分析在E蛋白基因序列上.SH0601与P3、Beijing-1、SA14和SA14-14-2的同源性在96.9%以上，与KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002的同源率均为88.l^o但SH0601的E蛋白氨基酸序列与F3、Beijing-1、SA14、KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002的同源率都在9&2%以上，与SA14-14-2的同源性为97.2%。应用DNAStar中MegAHgn软件，按ClustalW法对7株的E蛋白氨基酸序列分析，氨基酸变异如表2所示。在重要的氨基酸位点⑻，如E138和RGD(EJ87.3M),SH0601与Beijing-1和SA14相同。3讨论我国自1935年首次发生JE流行以来•目前除青海、西藏和新疆外，其他各省均有JE流行。虽然我国先后对儿童实施计划接种P3株灭活疫苗和SA14-14-2弱毒疫苗，JE发病率明显下降，但我国JE发病率仍占全球发病率80%以上⑹。在JEV循环传播中，蚊虫是传播媒介，猪和水禽是中间宿主和传染源。我国现采取预防JE的主要措施是接种疫苗避免儿童暴露于JEV感染之下，而JEV仍存在于 GV002STM41—WMVS8M0I(Cbm)i—Jtma1JKTMa17npiWF»SAM(CteM)SAM-M-3(ChM)HKS2Mn(Chm)XEVMMMV30Q2KMWKVU»THTMmO(CtaM)w»-S8n.i»(Cbm)图8JEV的进化分析基因型见每个簇的左瑞，进化树的绘制以西尼罗河病毒E蛋口基因序列作参照o100次比较的自由可信值见每个分支上•进化树上只标明分析中使用的中国分离株.Fig.8PhylogeneticanalysisofJEVstrainsbasedonthepredictedEgenesequences.Phylogeneticgroupsaregivenontheleftofeachsubtree.ThetreewasrootedwithWestNileVirusEenvelopegenesequence.Bootstrapconfidencelimitsfor100replicatesareindicatedaboveeachbranch.ThestrainsonlyisolatedinChinaweremarked.>2E爱白变异氨基酸Table2SubstitutionofaaofproteinEStrainE46E76E107E129El32El38El76E177E209E222E227E244SH06011MI.TpE1TRAPEBeijing-1ITLTsEITKAPEP3TMLApEITRAPESA14ITLTpEITKASESA14-14-2ITFTpKVAKASGKV1899ITLMsEITKSSEJEV/sw/Mie/41/2OO21TLMpEITKssEContinueStrainE264E279E306E315E327E351E366E388E397E408E439E447E473SH0601QKEAsVAGHLKGVBeijing-1QKEAsVAGYSKG1P3QKGAsAAEHLKGVSA14QKEAsVA(3HSKGVSA14-14-2HMEVsVA(3HSRDVKV1899QKEATVS(JHSKGVJEV/sw/Mie/41/2002QKEATVS(；HSKGV自然界中。水禽在远距离传播JEV具有重要意义.猪则是JEV的扩增器，在扩散JE流行中具有重要作用J®,而且我国人-猪关系密切.JEV在猪群中的循环传播可促进JEV的变异，增加环境中JEV的密度，使人感染JEV的可能性升高。因此，研究猪源JEV的分子流行学和采取措施防制猪JEV•不仅在养猪业上具有重要经济意义•更具有十分重要的公共卫生学意义。本试验采用高质量的反转录酶和复制酶克隆JEV基因组片段，避免基因组序列在操作过程中的突变。构建JEV全长cDNA克隆的主要困难在于JEV基因组5'端存在对宿主菌的毒性序列，在克隆过程中易于发生缺失⑴⑵。一般认为高拷贝质粒克隆JEV基因组更易于发生缺失〔⑴，但作者通过降低细菌培养温度，成功构建出全长cDNA克隆，为建立JEV的反向遗传操作系统、研制新型兽用疫苗打下基础。在序列分析中.SH0601株与P3.Beijing-1、SA14、SA14-14-2.KV1899、JEV/sw/Mie/ 41/2002的基因组全序列的同源性和E蛋白基因序列同源性相近，表明E蛋白基因变异率与全基因组变异率相近。不论是在全长还是在E蛋白，SH0601与KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002的核昔酸与氨基酸同源性均相差较大，表明JEV的核昔酸突变大多是沉默突变。E蛋白是JEV頌粒表面的重要糖蛋白，参与病毒与靶细胞吸附和融合，决定病毒的细胞嗜性和神经毒力，同时也是病毒的主要中和抗原仏⑶，分析E蛋白有助于深入认识病毒的生物学特性.JEV进化分析方法有两种:Chen建立的依据prM基因的240个核昔酸进行JEV基因分型和Shirish依据E蛋白基因全序列进行JEV基因分型⑺⑷。两种方法在JEV分型中存在差异，依据prM基因的240个核昔酸将JEV分成四个基因型，而E蛋白基因全序列将JEV划分成五个基因。由于prM基因的240个核昔酸序列较短，分析结果存在一定程度的可变性，而E蛋白基因用于进化分析被认为具有良好的代表性，近来成为主要的分析方法2⑺。李晓宇等利用前一种方法,Wang等利用后一种方法对我国不同时间.不同地点的JEV分离株进行分析，得出相近的结论，即我国在岀现JE流行后较长时期分离的JEV属于G皿，但近年来出现GIJEV⑹烁GIJEV大多是蚊虫分离株，而人源分离株属GM。SH0601根据E蛋白基因全序列分析属GM。不同基因型JEV流行模式不尽相同，GI和G皿JEV是流行株，GU和GN是地方流行株,GV至目前为止只有1952年分离的Muar株32门。我国已存在JEVGI和GDI的共循环，而GI并未在我国人群中流行，鉴于猪在JEV循环传播中的作用，了解猪源JEV的遗传背景，对预防JEV具有一定的指导意义。参考文献：Cl)EndyTP»NisalakA.Japaneseencephalitisvirus：ecologyandepidemiologyCJD.CurrTopMicrobiolImmunol*2002•26711】・4&RHollbrook*ADTBarrett.MolecularepidemiologyofJapaneseencephalitisVirusCJ〕.CurrTopMicrobiolImmunol>2002»267175-90.C3DThomasChambers.ChangSHahn>RicadoGaller*etal.Fla-vivirusgenomeorganization*expressionandreplicationCJ).An-nuRevMicrobio*1990*44：649-688・C4JShirishParanjpe*KBanerjee.PhylogeneticanalysisoftheenvelopegeneofJapaneseencephalitisvirusCJXVirusRe】996・42i107-117.C5)PradeepDUchihVijayaSatchidanadam.PhylogeneticanalysisofJapaneseencephalitisvirus>envelopegenebasedanalysisre・vealsafifthgenotype*geographicclustering*andmultipleintroductionsofthevirusintotheindiansubcontinentCJ).AmJTrapMedHyg.2001•65s242-25L〔6〕WangHY>Tomohiko#FuSH・etal.MolecularepidemiologicalanalysisofJapaneseencephalitisvirusinChinaCJJ.JGenVirol•2007•88:885-894.C7JPykeAT•WilliamsDT»DebraJ.Nisbet>etal.TheappearanceofasecondgenotypeofJapaneseencephalitisvirusintheAustralasianregionCJ).AmJTropMedHyg・2001>651747753.〔8〕LiuJJ>TsaiTH・ChangTJ.CloningandSequencingof8m・pletecDNAofJapaneseencephalitisvirusYLstraininTaiwan〔J〕・VirusGenes.2003•26t193-19&〔9〕PhanThiNga»MariadelCarmenParquet,VuongDueCuong*etal.ShiftinJapaneseencephalitisvirus(JEV)genotypecirculatinginnorthernVietnamtimplicationsforfrequentintroduc・tionsofJEVfrom.SoutheastAsiatoEastAsiaCJD.JGenVirol.2004>85：1625-1631.〔10〕MishinVP・CominelliF>YamshchikovVF.AminimarapproachindesignofflavivirusinfectiousDNA〔J〕・VirusRes.2001.81:113-123.Cl1)YamshchikovVvMishinV»CominelliF.Anewstrategyindesignof(+)RNAvirusinfectiousclonesenablingtheirsublepropagationinE.co"〔J〕・Virology»2001»281：272-280.〔12〕曾明.贸丽丽，俞永新.帑.乙型脑炎病逢活疫苗生产株SAu-】4・2的感染性克隆构建〔J〕.中华实验和临床病瞬学杂志，2005•19<9-11.C13^VratiS«AgarwalVtMalikP>etal.MolecularcharacterisationofanIndianisolateofJapaneseencephalitisvirusthatshowanextendedlagphaseduringgrowthCJXJGenVirol*1999>80：1665-1671.〔14〕ChenWR,TeshRtB*RebecaRico-Hesse.GeneticvariationofJapaneseencephalitisvirusinnatureCJD.JGenVirol,1990,71：2915-2922.C15^KunoG>ChangGwong-JenJ,TsuchiyaKR・PhylogenyofthegenusFlavivirusCJXJViroL1998*72>7383.C16DMangadaMNTakegamiT・MolecularcharacterizationoftheJapaneseencephalitisvirusrepresentativeimmunotypestrainJaGAr010.VirusRes>1999>59：101112.Cl7)ParanjpeS>BanerjeeK・PhylogeneticanalysisoftheenvelopegeneofJapaneseencephalitisvirusCJ^J.VirusRes#1996>421107-117.〔18〕李晓宇，宋宏，付士红，等.中国流行性乙型脑炎病毒分子生物学转性研究〔J〕・病毒学报>2004,20,200-209.〔19〕王环宇，付士红，李晓宇，尊.我国酋次分离到基因I乙型脑炎病SOX中华微生物学和免疫学杂志，2004,24：843-849.C20^)Woan-RuChen>RebecaRico-Hesse>RobertBTesh.AnewgenotypeofJapaneseencephalitisvirusfromIndonesiaQ^.AmJTropMedHyg>1992t47：6169.〔213DavidT・Williams*Lin-FaWang»PeterW»Daniels.Mackenx-ie.MolecularcharacterisationofthefirstAustralianisolateofJapaneseencephalitisvirus»theFUstrainCJXJGenViroL2000>811247P2480. 收橫日期：2007-05-28;修£1日朗：2007-07-23