两株猪源日本脑炎病毒的分离鉴定与编码区序列克隆分析

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1、万方数据SichUanAgriCU1tUra1UniVersityDISSERTATl0NSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEIsolationandidemificationoftwoJapaneseencephalitisvirusfromswineandcodingsequenceanalysisByShiShuangyanDirectedbyProf．WenXintianProf．CaoSanjieProf

2、．WuRuiYa’anSichuanMav2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生豁刁破格Ⅻ，彩年6月f≥日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的

3、规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：君双艳导师签名：)D／勿年石月7≥日＆p／够年厶月f2日万方数据摘要日本脑炎(Japaneseencephalitis)，又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本脑炎病毒(Japansesencephalitisvirus，JEV)己3I起的一种人畜共患性传染病。JE

4、V主要的传播媒介是库蚊，对多宿主具有致病作用，人是其终末宿主。JEV不仅引起严重的公共卫生问题，且可引起其扩大宿主猪的繁殖障碍，对畜牧业造成很大损失。中国是乙脑高发的国家。近年来，我国的畜牧业，特别是养猪业高速发展，增加了乙脑监测的难度和发生的风险。本试验从猪流产胎儿脑组织样中分离到两株乙脑病毒，对其生物学特性进行系统的研究；克隆了二者编码区序列，与GenBank中其他毒株比较，进行了分子生物学的分析，为乙脑在中国特别是四川省的预防和控制提供分子流行病学依据，丰富了乙脑研究的素材。1两株猪源日本脑

5、炎病毒的分离鉴定采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对从四川各地采集蚊样及猪流产死胎样本进行JEV的病原检测，检测阳性的样品脑内接种5日龄乳鼠，2批采自大兴的流产胎儿样品均在接种第3代后4天明显表现出沉郁、拒乳、抽搐并消瘦，第5天衰竭麻痹，最终致死。发病乳鼠的脑组织取出，研磨离心处理后接种BHK．21细胞，在第4天细胞开始出现变圆、回缩并从细胞层脱落的细胞病变现象。细胞上连续传代时细胞病变稳定出现，到第15代后细胞病变趋于提前，在第4天CPE近90％。本研究对两株病毒的生物学特性和理化性质进行

6、了分析，并采用琼扩试验、间接免疫荧光检测、RT-PCR以及中和试验对所分离的两株病毒进行鉴定，结果显示：两株病毒均为RNA病毒，对乙醚和氯仿敏感，在pH3．0条件下病毒失去感染活性，对胰蛋白酶敏感，60。C}j[1热60min、100℃加热2min均可使其灭活。RT-PCR反应可以扩增出JEVprM．C保守区段的特异性片段，琼扩试验和间接免疫荧光检测均呈阳性反应，均可被阳性血清中和。确认分离到两株JEV，并命名为SCYA201201、SCYA201202。万方数据2编码区序列克隆分析设计8对引物，

7、将JEV基因组分为8段进行PCR扩增，将扩增片段克隆后测序，测序结果显示：SCYA201201株、SCYA201202株的开放阅读框10296nt，编码3432个氨基酸，二者之间单核苷酸和氨基酸相似度99．9％，两株病毒之间在C／prM区段有2个氨基酸的差异，E蛋白有1个氨基酸差异，共3个氨基酸不同。以登革病毒为外群，选取国内外具有代表性的JEV基因序列进行E基因和prM基因的系统发育进化树分析，两株病毒均为基因I型JEV。与来自不同国家和地区、不同宿主的I型和III型JEV毒株编码区序列进行相似

8、性比对，结果表明：SCYA201201株与其中的I型JEV的核苷酸相似度≥97．7％，与I型JEV的氨基酸相似度≥98．3％；SCYA201202株与其中的I型JEV的核苷酸相似度≥97．8％，与I型JEV的氨基酸相似度>／98．4％。2分离株高度同源，所有蛋白中只有3个氨基酸的差异，关键位点E138位均为谷氨酸Glu(E)，E176位均为异亮氨酸lie(I)，E279位均为赖氨酸Lys(K)，两分离株具有噬神经性强毒分子特征。3JEV分离株生物学特性的初步研究蔗糖．丙酮抽提法提取