伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定与TK基因的克隆和序列分析

《伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定与TK基因的克隆和序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河南农业大学硕士学位论文伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定与TK基因的克隆和序列分析姓名：刘红亮申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：卢中华;李文刚20030601致谢在读硕士学位的三年中，导师卢中华教授在学习和生活中给予了多方帮助，教诲和鼓励；在论文课题的设计和完成过程中，李文刚博士给予了悉心指导，在此表示衷心的感谢。非常感谢导师组崔保安教授，王川庆教授、王泽霖教授在学习和工作中给予的指导和帮助。导师们严谨的治学态度，开阔的知识视野，敏捷的科学思维，对事业孜孜以求的精神，将使我受益终生。在三年学习生涯中，我还有幸得到了王自振教授、王亚宾副

2、教授、杨霞老师、陈丽颖老师、晁瑞平老师、张红英老师、金钺老师在学习、工作和生活中给予的帮助。同时非常感谢郑州牧专王永强博士、唐桂芬老师在技术和工作中的帮助和指导。感谢河南农业大学研究生处和牧医工程学院各位领导和所有老师的关怀和支持。在三年的学习和生活中，同窗赵朴、黄娟、刘岩、朱沙、胡涛、巩霞，罗俊以及师弟郑杰、李艳伍、王彦斌等给予了热心的帮助，在此一并表示感谢。感谢我的故友吕建华、李春华、王彦强、刘建军、李华民、坦然、粟学芳、陈迎松、窦高峰等，他们在物质和心理上给予了我极大的帮助和支持，帮我走过这三年的读书生涯。最后，感谢我的父母、兄嫂和姐

3、姐，是他们把我培养成人，给我攀登的基石；感谢我的妻子和小儿，他们给了我生活的乐趣和前进的动力。型堕窒些盔堂!!塑堕主堂些丝壅摘要从郑州某养猪场～患病小猪的脑和脾、肾等内脏内，我们分离到一株病毒。接种到BHK细胞株后，该病毒能产生典型的细胞病变(cpE)，感染的细胞融合，形成合胞体。采用固定病毒、稀释血清的方法进行中和实验，证明该病毒株能被猪伪狂犬病毒(PRV)的阳性血清所中和，其中和效价为1：107，对照伪狂犬病毒株鄂A株中和效价为l：209。用Reed．Muench法测该病毒的TCID。滴度为10‘“／o．1m1。用该病毒肌肉注射成年健康

4、家兔，能引起家兔嘶咬注射部位，四肢麻痹等典型的伪狂犬病症状。以上试验证明该病毒确为伪狂犬病毒。根据OeneBank公布的伪狂犬病毒的TK基因序列，我们设计了一对引物，然后利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增其TK基因，TK基因克隆到pGEM-T-Easy载体后，利用PCR技术，酶切反应技术进行鉴定后，再送到大连宝生物公司进行测序。测序结果显示，我们得到了TK基因的完整序列，该基因长945bp，编码315个氨基酸。利用DNAStar软件将分离毒株的TK基因序列与IA株，KOR株的TK基因序列进行比较发现，同源性均为97．3％．这说明TK基因是

5、较保守的，我们同时发现在分离株的ATG下游第706，第924个核苷酸处有单个碱基的缺失，在第848个碱基处有13个碱基的缺失，造成第236个氨基酸后的氨基酸序列变化，与对应两序列同源性下降，均为75．9％。氨基酸序列发生变化，但该毒株的毒力并没下降，此结果说明，无论是开发PRV的TK基因缺失苗，还是开发以TK基因缺失为基础，以PRV为载体的基因工程多价苗，缺失第706个核苷酸以后的序列，可能得不到理想结果．在试验中，我们提出了PRV基因组提取的新方法，为猪伪狂犬病的快速诊断提供了一些帮助，该方法同时可用于其它病毒基因组的提取：我们得到了完整

6、的TK基因，为研制猪伪狂犬病的TK基因缺失基因工程苗做好r基础工作，同时也可由此出发，开展以PRV为载体的基因工程多价苗的研究；TK基因序列分析的结果，对于进一步研究胸苷激酶上氨基酸的功能位点有～定帮助，对于确定构建TKI缺gb．载体时应缺失的位置有点意义。关键词：伪狂犬病、病毒、分离与鉴定、聚合酶链反应、TK基因、克隆与序列分析型!!r!型塑窒些盔兰!!!!塑主望些生墨一————1．文献综述1．1伪狂犬病简介伪狂犬病(Pseudorabies．PR)是由(Pseudorabiesvivtls，PRV)引起的多种畜禽和野生动物的传染病，以发

7、热，奇瘁(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状。1902年，由匈牙利学者Aujeszky首选报道。1910年，Schniedhoffer证明本病由病毒引起，1935年shope氏阐明猪在该病的传播中起重要作用【I’2～1。该病已成为猪的主要传染病。1．1．1PR的临床特征PRV可以感染多种动物，家畜中以猪、牛最为严重。猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、繁殖障碍、生长停滞、及高死亡率。临床上按猪的曰龄一般可分为三个感染阶段：首先，哺乳仔猪感染症状最为典型、均出现神经症状，麻痹、衰竭、死亡，死亡率几乎达100％；成年猪多不出现明显临床症状，呈隐性经

8、过，多表现为咳嗽、打喷嚏、体温升高等，死亡率在2％左右，妊娠母猪感染后主要表现为流产、死胎、产弱仔和木乃伊胎，公猪则引起睾丸炎。病理变化特点主要是脑膜炎和败血症。近年猪伪狂犬病的