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南京农业大学学报 2003,26(1):107～110JournalofNanjingAgriculturalUniversity伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列分析1,2111113黄伟坚,姜焱,陈德胜,芦银华,张雪莲,陈溥言(11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095;21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005)摘要:应用PCR方法从PRVSH(上海株)病毒培养物扩增了gG基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。结果表明,扩增的gG基因片段长1719bp,包含一个1491bp的开放阅读框(ORF),在起始密码子上游有TATAAAA盒,在终止密码子下游有AATAAA的poly(A)尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。gG具有膜蛋白的结构特点。关键词:伪狂犬病毒;gG基因;PCR扩增;核苷酸序列;氨基酸序列+中图分类号:S852165911文献标识码:A文章编号:10002030(2003)01010704Cloning,sequenceanalysisofthegGgeneofPseudorabiesvirusSHstrain1,2111HUANGWei2jian,JIANGYan,CHENDe2sheng,LUYin2hua,113ZHANGXue2lian,CHENPu2yan(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseDiagnosisandImmunology,MinistryofAgriculture,NanjingAgricUniv,Nanjing210095,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniv,Nanning530005,China)Abstract:ThegGgeneofPRVSHstrainwasamplifiedbyPCRtechniqueandclonedintopcDNA3,moreover,itwassequencedbySanger′ssequencingtechnique1TheamplifiedDNAfragmentwas1719bpincludedanORFwhichencodedaproteinof496aminoacidswithacharacteristicsofTATAAAAboxinupstreamandAATAAApoly(A)indownstreamofcodon1ComparedwithgGgeneofRicestrain,thehomologyofnucleotidessequencewas9711%,however,becauseofinsertsordeletioninthenu2cleotidessequenceofORF,thehomologyofthededucedaminoacidsbetweenPRVSHstrainandRicestrainwasonly8716%1ThegGwasoneofmembraneproteins1Keywords:Pseudorabiesvirus;gGgene;PCRamplification;nucleotidesequence;aminoacidssequence伪狂犬病毒(PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。PRV基因组为长150kb的线性双链DNA分子,可编码70～100种蛋白质。其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免[1]疫有密切关系。糖蛋白G(gG旧称gX)是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外[2]的糖蛋白,可刺激机体产生抗体。gG与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG对病毒[3]免疫原性的影响比缺失gE要小。但对gG在PRV的生命活动过程中的作用了解甚少。在有些α2疱疹病[4]毒中,如HSV21中已发现gG在病毒侵入细胞过程中有重要作用。在BHV1中影响病毒在宿[5][6]主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡。gG具有很强的抗原性,且在自然界没有发现gG缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057)3 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。通讯作者Correspondingauthor,E2mail:aid@njau1edu1cn©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net ·108· 南 京 农 业 大 学 学 报 第26卷失的野毒株。因此可以利用gG作为疫苗株的缺失标志蛋白,用血清学方法鉴别野毒株感染或疫苗株免疫猪。为深入了解gG的结构特点,构建gG缺失株,建立gG血清学鉴别诊断方法,对PRVSH(上海株)gG基因进行克隆和序列测定,并从核苷酸和氨基酸水平上进行了分析比较。1 材料和方法111 实验材料猪PRVSH株、兔肾传代细胞株(RK13)、大肠杆菌DH5α株、质粒pcDNA3由南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室保存。pGEMTeasy载体及连接试剂购自Promega公司。112 主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR反应试剂、DNAmarker均为大连Takara公司产品,DNA胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。113 病毒的培养和模板制备接种适量PRVSH株种毒至RK细胞中,待80%细胞病变后收获,冻融3次;低速离心去除细胞-1碎片,上清液加入终浓度为1%的SDS、100μg·mL蛋白酶K,50℃水浴1h;用酚/氯仿混合物和氯仿各抽提一次,上清用无水乙醇沉淀DNA;待DNA干燥后溶解于适量灭菌双蒸水中,作PCR模板。114 引物设计与合成[2]根据GenBank上发表的Rice株gG基因序列设计一对引物,并在5′端分别加上EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点。包括完整的gG基因及部分非编码序列,由大连Takara公司合成。引物序列为:gG1:5′CGGAATTCTTTGATCCCGTCCGCCGCCCTTC3′;gG2:5′GCTCTAGACCCGGTAAGCAAG2GCCGTAC3′。115gG基因的PCR扩增和回收-1PCR反应体积50μL,依次加入2×GC缓冲液25μL,dNTP混合物(均为215mmol·L)-18μL,引物gG1和gG2(20μmol·L)各1μL,LATaq酶015μL,双蒸水1215μL。模板DNA先在沸水中煮10min,冰浴冷却后取2μL加入PCR系统中,先在95℃预变性240s,再按95℃50s,64℃60s,72℃150s进行35个循环,最后一次循环72℃延伸10min。取8μL经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,分子量大小符合的PCR产物用胶回收试剂盒回收。116 基因的克隆和序列分析纯化的PCR产物按Promega公司使用说明与pGEMT2easy载体连接,总体积10μL,4℃过夜。转化DH5α大肠杆菌感受态细胞涂布于加有氨苄青霉素的平板,培养14～16h;挑取菌落培养,抽提质粒,用EcoRⅠ酶切筛选阳性质粒。用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切出117kb的克隆片段,插入pcDNA3的相同酶切位点上,得到重组质粒pCgGsh,送大连Takara公司测序。得到的gG序列用DNAStar生物软件与Rice株的gG基因进行核苷酸和氨基酸水平比较。2 结 果211PCR扩增和克隆结果从PRVSH株病毒培养物总DNA中扩增出一图1PRVgG基因PCR扩增和重组质粒pCgGsh酶切结果条约117kb的产物,符合设计要求。产物连接到Fig.1PCRproductandenzymedigestionofpCgGsh1.PlasmidpCgGsh;2.pCgGshdigestedwithEcoRⅠandpGEMT2easy载体后,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶XbaⅠ;3.PCRproductofgGgene;41DL2000切,切出的117kb片段克隆到pcDNA3质粒,得到重组质粒pCgGsh(图1)。©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net 第1期 黄伟坚等:伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列分析·109·212gG基因核苷酸序列分析经测序,克隆的gG片段长1719bp,G+C含量69141%,包含一个1491bp的开放阅读框(ORF),在起始密码子上游有一个TATAAAA盒,在终止密码子下游有一个AATAAA的poly(A)尾。该片段与Rice株相应片段的同源性为97161%。在gG编码区内,SH株与Rice株有19个核苷酸不同,而且在687～696位缺少9个核苷酸,在786,1001和1018位各插入1个核苷酸,在895～896位插入2个核苷酸,在1119～1120位缺少2个核苷酸,这些插入与缺少导致了突变与移码(图2)。图2PRVSH株与Rice株gG基因核苷酸序列比较Fig.2ComparisonofthenucleotidesequencesofthegGgenebetweenSHstrainandRicestrain(Note:(1)S:Shanghaistrain;R:Ricestrain(2)“1”代表相同的核苷酸;“”代表缺失的核苷酸。“1”denotesidenticalnucleotides;“”denotesdeletednucleotides1)213 氨基酸序列分析PRVSH株gG基因推导的氨基酸序列与Rice株相比,不仅长度减少2个,只有496个氨基酸,而且同源性仅有8716%,差异较大。这主要是由于在1001和1018位各插入一个核苷酸,导致氨基酸序列图3PRVSH株与Rice株gG基因氨基酸序列比较Fig.3ComparisonoftheaminoacidsequencesofgGgeneofSHstrainandRicestrain(“1”代表相同的氨基酸;“”代表缺失的氨基酸;下划线代表糖基化位点。“1”expressedidenticalaminoacids;“”expresseddeletedaminoacids;underlineindicatedglycosylationsites1)©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net ·110· 南 京 农 业 大 学 学 报 第26卷328～373位中有43个与Rice株不同,出现插入突变。其他变化有:260～262位少Ala,Pro,Glu;在Val293→Ala,Ala296→Pro,Gly297→Ala,Asp298→Thr,299位多一个Gly,His303→Arg,Asp305→Ala,Va1425→Ile,其余核苷酸变化没有导致氨基酸改变。gG的5个N糖基化位点两个毒株一致,没有发生改变。在与蛋白质二级结构紧密相关的半胱氨酸上,10个半胱氨酸中有9个两毒株相同,SH株在369位比Rice株多1个半胱氨酸,Rice株在此位为组氨酸(图3)。3 讨 论对PRV的分子生物学研究着重于对影响病毒毒力、与病毒免疫及细胞内扩散的相关基因,已对gB、gC、gD、gE、gI、gM、gL、TK、PK等基因的结构与功能进行了较深入的研究,而对gG的研究很少。SH株gG蛋白氨基酸序列与Rice株相比同源性仅8716%,但两者N糖基化位点一样,半胱氨酸也基本一致,信号肽序列及裂解位点完全相同,表明PRV在进化过程中gG保持二级结构的相对稳定性,有利于其功能的发挥。推测gG对病毒的生命周期和病毒与细胞的相互作用有重要影响。gG是PRV的主要囊膜糖蛋白之一,虽然与病毒中和作用无关,但具有较强的抗原性,感染PRV的猪体内产生大量的抗gG抗体,可用血清学方法检出。gG蛋白已作为许多疱疹毒的诊断抗原,用于[7]疱疹病毒感染疾病的血清学诊断。加上缺失gG的疫苗株比缺失gE的疫苗株免疫效果更好,可以突[14]破母源抗体的影响。利用这些特性,构建gG缺失疫苗株,建立相应的鉴别诊断试剂盒,用于对PRV野毒株感染和疫苗接种猪的区别,将对我国最终控制PRV提供帮助。由于PRV基因组核苷酸序列G+C含量高达72%,gG基因G+C含量也达69%以上,不容易扩增,在用常规PCR方法未能稳定扩增gG基因后,我们采用LATaq酶、GC缓冲液、提高退火温度等方法,顺利地从细胞总DNA中扩增了gG基因。从测序结果得知,此法可取。SH株gG基因与Rice相比,核苷酸同源性高达9711%,而氨基酸同源性仅有8716%,且SH株gG氨基酸数比Rice株少2个。原因为核苷酸插入和缺失所致。最近,对湖北株gG研究也发现这个现[9]象。国内两毒株的gG与美国的Rice株氨基酸序列差异较大,是否预示PRV国内毒株向远离国外毒株的方向进化?如证实,则对今后国内PRV的免疫预防和诊断有重大影响。由于已测序的PRVgG基因太少,有待对更多的gG基因进行研究才能解释。参考文献:[1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版1北京:科技出版社,1997.1002～1003.[2]ReaTJ.TimminsJG,LongGW,etal.MappingandsequenceofthegeneforthePseudorabiesvirusglycoproteinwhichaccumulatesinthemediumofinfectedcells[J].JVirol,1985,54:21～29.[3]MengelingWL,BrockmeierSL,LagerKM,etal.TheroleofbiotechnologicallyengineeredvaccinesanddiagnosticsinPseudorabies(Aujeszky′sdisease)eradicationstrategies[J].VetMicrobiol,1997,55:49～60.[4]TranLC,KissnerJM,WestermanLE,etal.Aherpessimplexvirus1recombinatlackingtheglycoproteinGcodingsequencesisdefec2tiveinentrythroughapicalsurfacesofpolarizedepithelialcellsincultureandinvivo[J].ProcNatlAcadSci,2000,97(4):1818～1822.[5]NakamichiK,MatsumotoY,OtsukaH.Bovineherpesvirus1glycoproteinGisnecessaryformaintainingcell2to2celljunctionaladherencea2monginfectedcells[J].Virology,2002,294(1):22～30.[6]HartleyCA,DrummerHE,StuddertMJ.ThenucleotidesequenceoftheglycoproteinGhomologueofequineherpesvirus3(EHV3)in2dicatesEHV3isadistinctequidalphaherpesvirus[J].ArchVirol,1999,144(10):2023～2033.[7]AshleyRL.PerformanceanduseofHSVtype2specificserologytestkits[J].Herpes,2002,9(2):38～45.[8]FirkinsLD,WeigelRM,BiehlLG,etal.FieldtrialtoevaluatetheimmunogenicityofPseudorabiesvirusvaccineswithdeletionsforgly2coproteinsGandE[J].AmJVetRes,1997,58(9):976～984.[9]闵平,张楚瑜,潘兹书,等.伪狂犬病病毒蛋白G基因的结构分析及其原核表达[J].中国病毒学,2002,17(2):166～171.责任编辑:周广礼©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net
