广西狂犬病野毒株N和G基因的克隆与序列分析

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广西大学硕士学位论文广西狂犬病野毒株N和G基因的克隆与序列分析姓名：南松剑申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：余克伦;罗廷荣2003.5.1 彦庙大学硕士毕业论文!广西狂犬病野毒株N和G基因的克隆与序列分析摘要本试验从广西南宁、隆安和巴马分离到三株狂犬病毒野毒株，分别编号为119、GXLA和GXBM。对三株的N基因和119、GXBM株的G基因进行了RT—POR扩增、克隆和测序。将测序所得结果和收集到的国内外已发表毒株相应基因进行了核苷酸和推定氨基酸的序列进行比较分析。三株野毒之间核苷酸同源性较低，N基因分别为：89．1％(119／GXBM)。89．7％(119／GXLA)，89．4％(GXLA／GXBM)：G基因为86．7％(119／GXBM)，表明广西各地分离毒株之间存在较远的亲缘关系。比较N基因推导氨基酸序列同源性，分别为：97．8％(119／GXBM)．97．8％(119／GXLA)，99．1％(GXLA／GXBM)，表明N基因同义变异较多，其编码蛋白(NP)一级结构很稳定。将两株野毒株119、GXBM与人用疫苗3aG株和兽用疫苗ERA株的G基因进行了核苷酸序列比较，同源性介于82．7—84．O％之间，推定氨基酸同源性在88．o一91．6％之间，差异非常明显。三株野毒与减毒株CTN之间的N和G基因同源性均高于与3aG、ERA株的同源性。19和GXBM株G基因推定氨基酸均有37、319两个糖基化位点，重要的抗原位点及致病性相关位点基本没有变化。，f实验结果对狂犬病的分子流行病学、致病机理的研究及基因工程疫苗开发是十分重要的。了／关键词：狂犬病病毒G基因N基因同源性一序列分析 广曲{王犬蠢野毒攘靠和多基糖蝻竞玲与寿列分髓·南松铷三CLONINGANDSEQUENCESANALySISOFNGENEANDGGENEoFWILDRABIESVIRUSSTRAINSlSoLA蕈EDlNGUANGXlABSTRACTInthisstudythreewildstrainsofrabiesviruswereisolatedfromNanning，LonganandBamaofGuangxiandweredesignatedas19，GXLAandGXBMrespectively．Thenucleoprotein(N)geneofthreestrainsandglycoprotein(G)geneof19、GXBMwereamplifiedbyreversetranscription—polymerasechainreaction(RT—PCR)，respectively．TheRT-PCRproductswereclonedintopMD18一Tvectorandthensequenced．ThesequencesofNandGgeneandtheirdeducedaminoacidsequenceswerecomparedandanalyzedwiththatofsomeotherrabiesvirusstrainspublishedpreviouslyintheworld．ThenucleotidehomologyinNgeneamongthreestreetstrainswere89+l％(119／GXBM)，89．7％(119／GXLA)and89．4％(GXLA／GXBM)andinGgeneamongtwostreetstrainswere86．7％(119／GXBM)．whichweredifferentandobviouslylowTheseresultssuggestedthatgeneticrelationshipinthreestrainsisolatedfromdifferentplaceofGuangxiisratherdistant。ThehomologyofdeducedaminoacidsequenceofNgeneamongthethreestrainsare97．8％(119／GXBM)，97．8％(119／GXLA)and99．1％(GXLA／GXBM)respectively． 彦庙大学硕士毕业论文!TheresultdemonstratedthatthereweremanysynonymousmutationsinNgeneComparisonofthesequenceofnucleotideanddeducedaminoacidofGgeneof19andGXBMwiththatof3aGandERAvaccinestrains，thehomologiesofnucleotidewererangedfrom82．7％to84．O％and88．0％to91．6％，homologiesofaminoacidhasbeenshowed91．0％，88．8％，90．5％and88．0％，respectively．However，thehomologiesofGandNgenebetweenwildstrainsandattenuatedstrainCTNaremuchhighAccordingtothededucedaminoacidofGgene，therearetwoglycosylationsitesinstrain19andGXBMatposition37and319．ThereisfewchangeinimportantneutralizingantigenicepitopeandinsomeantigenicsitesrelatedwithpathogenicityTheresultsinthisexperimentareveryimportantforfurtherstudyondevelopmentofgeneticengineeringvaccineagainstrabiesandontheinvestigationofmolecularepidemiologyofrabiesvirusKeywords：Rabiesvirus；Ngene；Ggene；homology；sequenceanalysis 彦．西大警硕士毕业论文月U舌狂犬病(Rabies)，又称“恐水症”，是由狂犬病病毒(RabiesVirus，RV)引起的一种人畜共忠传染病，同时也是历史上记载最早、最可靠的病毒病【l、2】。世界上关于狂犬病的最早记载见于公元前2300年以前美索不达米亚的埃什努纳法典【3l。而在中国古籍中关于狂犬病的最早记载见于《左传》，距今已有2500多年【4】o18到19世纪，狂犬病一度在欧洲流行，在人群中造成极大的恐慌。1885年，法匡I微生物学家巴斯德在实践中摸索出了将狂犬病病毒致弱用来生产狂犬病疫苗的方法“、“，为从根本上解决狂犬病的预防和控制奠定了基础；1903年意大利学者内基在感染的神经细胞内发现了狂犬病病毒包涵体一内基氏(Negri)小体，可应用于狂犬病的早期诊断研究。20世纪40年代丌始将有效的狂犬病疫茁大量应用于狗：1985年成功地将狂犬病病毒适应于细胞中增殖，细胞培养茁rf臻完善；近年来，随着基因工程技术的发展，对其病毒基因组结构和所编码蛋白功能有了更深入的认识，从分子水平上研究狂犬病病毒的流行病学、遗传变异等特点，以及通过不同病毒重组研究其致病机理成为新的热点，各种新型基因工程苗或者口服疫苗的丌发也十分活跃。1、当前世界上狂犬病流行概况目前，狂犬病仍是一种广泛分布于世界各地严重威胁人畜健康的传染病，根据因际兽医局编印的《动物健康年鉴》【6】’在有疫情报告的176个国家和地区rh1989年有狂犬病疫情上报的达105个国家和地区，其中非洲有42个，亚洲24个，美洲23个，欧洲16个，说明发病的主要在亚非拉发展中国家。也有资料显示全世界人狂犬病例的98％以上都集中在皿洲，每年估计共有约6万例，其中印度就占约5万例，中国居第二位。IU：界卫生组织(WHO)1992年的不完全统计表明世界上仍有87个国家和地区存在狂犬病疫情，全世界每年被动物咬伤而注射疫苗的有560万人。有专家“1认为，口前本病在全球流行模式大体有三类：l、在一定的地理范围内消除了人畜狂犬病，如日本、冰岛、挪威、新两兰和澳大利弧等；2、在野生动物和家畜中仍有流行，而人的病例已极少见，如荚l司剃多iJtiI】f．kI!_{|家：3、在人和动物中均有流行，见于大多数发展中图家，j￡r咋|】度羽I我吲最为严重f留J·来身cog：)。我国在1949年之前各地皆有狂犬病流行，此后，狂犬病被列为二类传染病加以管制：1951年曾开展过一次全国性的灭狗活动，狂犬病发病率大幅度下降；但70年代以来， 广西狂犬病野毒株刀和多基园曲克隆与序t,1分析·南松剑一2图1世界狂犬病分布情况Fig．1Situationofrabiesintheworld病例数逐渐上升，1979年死于狂犬病的人数达4227；1987—1989年，每年报告的病例在5200以上；90年代以来开始下降，95年达到最低报告数量，仅200例”1；但97年开始网升，97年比96年回升39．6％”7，这主要与近年来养犬数量增加、贯彻免疫不彻底等有关19、““。从分布地理来看，狂犬病几乎遍布全国各省，严重地区主要在东、南部如河南、山东、江苏、贵州、广西、四川等省区，青海、西藏至今无疫情报告。2、流行病学狂犬病是一种自然疫源性疾病，人和各种温血动物均可感染，以肉食目的犬科和猫科动物最为易感”1。在发展中国家，如我国等，带毒犬是人畜狂犬病的主要传染源；但在世界其它地方，野生动物是主要病毒宿主，例如，欧洲主要是狐狸，北美主要是浣熊和臭鼬。而且，世界各地，蝙蝠和野生动物病例报道逐年增多佃2、3·来自CDC)。图2野生动物狂犬病流行情况Fig．2Rabiesinwildanimals 彦西大肇硕士毕业论文一3图3蝙蝠狂犬病发生情况Fig．3Rabiesinbats除犬外，由蝙蝠(包括食虫、食果蝙蝠)“”和鼠⋯1等，将狂犬病传播给人类的报道屡有发生。近年来，家犬隐性感染趋势也比较严重，有些犬外观健康，但体内和唾液中却携带有病毒，如广东省1992年的犬带毒情况调查，平均带毒率为17．7％““。狂犬病的传播大多数是通过患病动物的咬伤而感染，经消化道、抓伤、舔拭和触摸伤口、母体胎盘和呼吸道等非咬伤性途径的传播也见诸报道。另据河南某地报道”“，当地犊牛发生的狂犬病均无犬、猫咬伤史，可能与当地鼠类的活动密切相关。一‘般农村狂犬病发病率高于城市，这可能与农村养犬数量多，且多为放养，缺少驯化，预防接种难以实施，群众防疫意识淡薄有关，同时边远山区疫苗不到位，被犬咬伤后的处理不及时等因素造成狂犬病患人数也高于城市。但随着城市家庭“宠物热”的兴起，其潜伏危险也不容忽视。据统计“⋯，人被狂犬咬伤后，发病率为70％左右；发病的潜伏期长短不一是狂犬病的一个重要特点，一般5—55天，但文献报道最长者有达33年。这与感染途径及严重程度有关。有报道““野生动物咬伤较犬咬伤病程短，恶化快，病死率极高，几乎达100％。3、诊断I⋯：破感染后病}垃沿神经|flJ心化播，且潜伏册长短不⋯，无瘸iliJfit'，ii!⋯现，ⅢI』发病则迅速恶化，给狂犬病早期诊断带来一定的困难。免疫荧光试验(FAT)是WHO推广的一利，方法，我国也将其列为首选方法：王振海“”等曾采用问接免疫荧光技术(IFA)对抗体动态变化进行检测取得了很好的效果；由于其 广西狂犬病野毒株韶和乡基因的克隆与序I,1分祈·南松剑一4具有高度的特异性和敏感性，有着很大的发展前途；Perrin等“”将酶联免疫吸附试验用于病毒抗原的检测，建立了快速酶免疫诊断技术。Nieholson发展了间接ELISA法，具有很好的灵敏度和重复性且操作简便。近年来，单克隆抗体技术在狂犬病研究上取得很大的进展，美国和加拿大处于领先地位，他们一般将其应用于毒株的鉴定：另外，张茂林等制备了可应用于强弱毒株鉴别的单克隆抗体。罗廷荣曾制备出35株针对G蛋白的单抗，并用于抗原性的分析”⋯：PCR技术于1990年首次应用于鼠脑内狂犬病毒的检测，Tordo等人用于狂犬病的诊断研究“3。罗廷荣建立的NestedPCR方法可检测到0．8pg的病毒RNA，并可区分出狂犬病毒相关病毒，具有很好的敏感性和特异性，并将其初步应用于病毒在小鼠体内移行动态的分析”o’。4、病毒的分子生物学研究狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，狂犬病病毒属(Lyssawirus)”1。成熟的病毒颗粒形态似子弹状，外包脂质双层囊膜，膜上有糖蛋白(G1ycoprotein，GP)构成的具有血凝性质的刺突(spikes)，双层囊膜的内侧为基质膜蛋白(MatrixProtein，MP)，内部为呈螺旋对称的核衣壳，由病毒RNA及和包在它外边的核蛋白(Nucleoprotein，NP)组成，在核衣壳内还有两种蛋白，一种是大转录蛋白(LP)，一种是磷酸化蛋白(Phosphoprotei[IS，NS)，和RNA相互作用，一起形成有活性的核糖核蛋l刍复合物(Ribonucleoprotein，RNP)，负责病毒RNA的转录和复制f田秒。圈4狂犬病毒结构模式图Fig．4Structuremodeofrabiesvirus以往，根据血清学和抗原关系，用单克隆抗体将狂犬病毒属分为4个JfIL清型，l缸清l 痿商大学硕士毕业论文i型为经典狂犬病毒(Rabiesvirus)，2、3、4型为狂犬相关病毒，代表株分别为拉各斯蝙蝠病毒(Lagosbat)、莫科拉病毒(Mokolavirus)、杜梅海格病毒(Duvenhagevirus)””。在核酸水平上可将狂犬病毒分为6个基因型，前四种基因型与4种血清型相对应，后来从欧洲蝙蝠分离得到的狂犬病毒(EBLI、EBL2)被列为基因5、6型““。狂犬病病毒基因组由11928—11932个核苷酸组成，为单链、不分节段负股RNA，由基因组的3’端至5’端，依次排列着N、NS、M、G、L等病毒的全部5个结构基因，每个基因山3和5端非编码区以及中间的编码区构成，长度分别为1424、991、805、1675和6475个核苷酸，分别编码病毒核蛋白(NP)、磷酸化蛋白(NS)、基质膜蛋白(MP)、糖蛋白(GP)和RNA聚合酶大蛋白(LP)。另外，在N基因的3端之前有一段58核苛酸(其他弹状病毒为48个)的不翻译先导序列，在N-NS、NS—M、M—G和GL基因问分别有2、2、5和423个核苷酸的间隔序列，G—L间的核苷酸间隔序列是一个伪基因。31馆y印。RabiesGenome。一期■瞒鼬≥G叠L5{{”种'$∞1675¨，b】■k“illms“图5狂犬病毒的基因组结构Fig．5RNA8enomeofrabiesvirus捌渔驺(：7垤吵全长450个氨基酸，c端Ser389为磷酸化位点。NP在病毒复制过程中与基因组RNA紧密结合成核糖核蛋白(RNP)，保护核酸免遭核酸酶的破坏。在弹：帙病毒l={_·，NP还与转录和复制的调节有关。在成熟病毒粒子中NP是构成核衣壳螺旋对称结构的主要成分。用单克隆抗体分析，NP有3个空间位置明显区别的抗原位点Nl、N。Nu|，N，、N川分别与374—383和313—337位氨基酸的伸展有关，NP多肽上还发现一些辅助性淋巴细胞(HelperT—lymphocyte，Th)表位，其中404—418刘鼠有保护作用⋯1。Nf)是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，对中和抗体的产生也具有促进作用。NP还能抑制狂犬病毒在细胞问的传播和在细胞内的繁殖“⋯。由于NP基因高度保守且高效表达不仅可用J：枪洲狐犬炳球感染，也作为分予和抗原性比较的对象而广泛用于犯犬病谁分类研究·I，。目前，NP抗原性及其基因序列已作为狂犬病毒分组的重要依据。另外，NP也广泛用于狂犬病流行病学研究，用抗狂犬病毒NP单抗进行狂犬病毒抗原变异研究显示，不同宿主、地理范⋯、爆发时问，抗原性常常不同”“。 广西狂犬赢野毒栋韶和多基国的克隆与序到分析‘南松剑!鹚翱静芭爵旨(ASP)由297或303个氨基酸组成，有高度亲水性，其结构的一个重要的特点是磷酸化。NSP与LP相互{乍用孛句成了完整的转录酶活性，在瘸毒RNA的转录积复铡中起主要俸援[23]，NSP可与LP、RNP共网组贼30一35圈螺竣状续构的毒粒核心部分～一核衣壳，核衣壳具有全部转荣帮复铡活性，具有感染性；NSP也显示了狂犬病毒耩特并性抗原反应。煮强溜爵傍(期哆是狂犬病毒最小的结构蛋白，在病毒形态形成中起着重要作用，它出202个氨基酸组成，构成病毒的表碾抗原，在核衣壳和囊膜之间起黄连接作用，并可能对病毒糠蛋囟起簧固定作用。在它的1和72残基之闻有～个主要抗坂决定簇，89—107氨基酸片段骞若明显黢琉水蛙可以锚定蛋自进入瘸毒囊默中。对与狂犬瘸嗣殿魍永泡。隧口簇炎病毒(VSV)豹磷究提议，鹾爨自从瘀毒膜疼翻转震型核农壳螺旋的趱核”“。粥i爵考(，掰移形成病毒表面突起(Spike)，是一种跨膜糖蛋白，其阅读框氏1575个核萤酸，编码前体肽链全长为524个氨基酸，氨基端的19个残基是疏水性的信号肽，起始新生强白穿过粗黼内质网；戏熟的糖蛋囱只含505个残基，分为膜终区(1-439位氨基酸)、跨膜区(440—461)和膜内区(462-505)“⋯。糖蛋自的主要作用包捂诱导中帮接体豹产生，刺激T纲嚣毽作用产生纲慰免疫，负责病毒与细嚣缱濮受体(留前认为是乙酰疆碱受棒，AchR)鹩结合㈥，决定着病毒毒力太小，另外，萜鬣自还具有m凝(HA)、缩胞融合和免疫溶解(IL)律甭洙“。由予其变异性较大，也j"j：病毒株抗原性的区分。所以，在结构及免疫水平上都难狂犬病病毒蛋i，．1『mi7}究最多的⋯个。糖蛋白刺激机体产生中和抗体依赖于其三维结构的维持，不同的毒株其糖基化位点的数嗣和位霰不完全相同，但均具有319位糖基化位点，适当的糖基化对于GP的表达是最重要的。“1。糖蚕自上会有至少3个功能抗贩位点分别为G：、G针、G。，G。是(；P最主要驰抗歇区，位于簿300—357位区段，GH位予第34-200区段，含鹾个主要区域24—42翻198—200靛氨基酸。“。禧矮自抗器性变化经常是国G¨上34—42、147、184和198—200及f谕hVq330340和357能氨慕陵残j毒瀚改变所致。已商学辑”’利用陵I})s对狂犬痫病毒瀚抗舔结构雨l功能进行了分析。对狂犬病毒的致痫性起关键作用的氨基酸有糖蛋白G⋯位点上的Lys330、Ar9333等，当被其他氨基酸取代时将会导致磁力减弱或谯失。“。然而高度致神经痫变的Mokola株却 疹滞大警颈士挚韭鲶文二在333位有一天门冬氨酸残基。最近的研究表明，除了333位精氨酸外，GP还存在着其他与毒力相关的重要结构，此外，GP本身有细胞簿活性。爿李蠢瑟蠡曾弦尹9囊2142令氨基骏组成，是狂犬瘸毒最大粒缝款蛋白，为痰毒转录和复制中不可缺少的RNA多聚酶，起潜催化作用。其引导区域为重要，含有病毒多聚酶静结合位点，RNA合成的起始信号敷及新生斡RNA经N蛋自惫凌静寤动信号等。“。5、狂犬蠛毒的分子流行病学毳开究随着分子生物学研究的迅速发展，各图在核酸水平上对狂犬病病毒进行了大量的流露瘸学疆究。嚣运溺瓣方法主要有溺单霓隧抗髂按术、核羧杂交、i鬏fP]经辫凌分辑或嚣对RT—PCR扩增的核替酸片段进行序列测定比较等。Bouthy””通过{|l{|定狂犬瘸瘸毒耩中静翼有{弋表经抟瘸鸯株N基辩瓣序列将其区分为6个撼因型。Smith等“⋯分机了来自ti；!=界各地87个病毒分离物的N撼因区域200bp的核j】!=1=酸序列，认为现在流行予许多圭l亟区的狂犬瘸病毒和源于欧洲的经疑毒株、疫菌株有较高的网源性，丽在野生动物中分离的病毒大多与犬携喾豹病爨有关，提示犬携带的病毒可能散布到野生动物巾。hrai等“”对11个狂犬病毒分离株测序后与已知的91个狂犬病毒N基黢的裹变区序列逑行了毙较，诞明狂犬痰病毒骥有一是螅地域鹅动物穆嚣分匆特征。Sacramento等。“测定了在法国流行的12株不同宿主和地区的病毒分离物的假基因v的序到，发理虽然吝野露椽之阉骞极强豹阉源攘，毽它们与疫萤株闼麴茇筹蠢麓达14％。NadinDavis等。”1对来自加拿大安大略省的病毒分离株N旗因进行了研究发现其无宿主特异性，霭有爨显的缝区特辩性。Wurner等嘲对埃塞俄魄甄翁健藤带毒犬瀚繇液帮躺橇体分离秘进行分子生物学研究，发现尽管分离物之删酶切片段相似性较大，但与Pv和CVS毒株差异较大，表明狂犬瘸流行其有一定的地域链特征。近年米，我国也开始了病毒的分子生物学和分子流行病学方面豹硬究。自宪鹤等“6’”1研究表明中国人膈疫苗株3aG株和街毒株CGX89-1的G獭自氨基酸同源性仅为89．5％，已商骥要静差别：钱爱东等‘”对中謦不嗣来源狂犬痍瘸毒辩毒拣G基因主要功旋区迸季亍了序列分机发现中国不同来源狂犬病病毒的G基因同源性较低，比较的4个野毒株的糖鉴亿倥矗矧主要弱湃导巾霹l抗体尹：生虢捩毅凌定簇波某些甄基酸疼li陵铁fftiiiI{l爨鼗吲存在亲缘关系较远的狂犬病野毒株，甚至存在基因型的茇异；钱爱东“”3对无毒疫茁株SRV9G基鞠主要功能区遗行了序弼分轿并与己发装静狂犬瘸病毒SADBl9椿的稻应序列进行比较后发现主要抗原聪内的几个重要氨基酸(如333位精氨酸等)发生了变异，糖丛 广西狂犬离野毒株韶和多基园蟾克玲与序列分{I}·南松剑!化位点也改变；唐青等㈨1对我国四株狂犬病毒糖黻自基因进行了序列分析和位点比较发现决定毒力的Ar9333，在减毒株CTN发生了Glu替换，箕它毒株均为Ar9333，所}t较的毒株均存谯3t9位糖基化位点，此外37位糖基化位点也相对保守：GP两个主要抗暇表位：GII的氨蔡酸构成完全一致，GIH只在一麴减毒株中发生与毒力密切相关碱基的替换：徐葛林等””对中国19个狂犬瘸病纛街毒N基因进行了序列分析后发现可将中国狂犬病病毒衡毒分为4个缀群，各缀问的同源性为83．45％～88．62％。除广话地区分离的狂犬病病毒街毒彼此差异较大於，其余餐毒豹地理分毒与其N基因核羧廖捌差舅懿距离是密甥鞠关的，基本上可按其地理分布分为东、西二大组：古漓、王树声等“”对国内外19个病毒株(毯耩8橡广嚣毒)逮行了核营酸滓穰戆魄较努椽，谈为广嚣至少存在3令基霾鬻，存在有不同来源的病毒株。6、综合t隧防治措施及颥型疫苗的开发要想从根本上预防狂犬病妁发生，必须对犬、野生动物翻入实牙全霆豹综合预珑接施““。野生动物是狂犬病的主要储存宿主，狂犬瘸毒在野生动物中长期保存，并传播给犬，努生动物逸妻续臻入霉l起太强犬痣，控裁稻游灭辩生动物狂犬病对镲底潸灭狻犬瘸具有重要的作用。据报道““，在许多欧洲阑家自开展口服兔疫以来，1994年的野生动物狂犬瘸已经下降至l1989年靛20％pA下。犬在携带瘸毒和传耀本病上起着重要作用，是人类感染的最重要来源，在80多个狂犬病流行的国家里，犬是最危除的储主，人狂犬病的所有病蕊中99％以上是由犬传播瘸海引起的，接受黎露后治疗的人种90％以。．L是屑住存犬狂犬病流行地区，对犬进行全面监测、普及免疫，加强犬群管理怒消灭狂犬病行之有效的措施。程国外已经有两种疫苗在犬作为明服疫苗是行之肖效的，一种是v～RG(瘾苗～狂犬瘸糖蛋囟)，另～静是以SAG弱毒拣割蘩粒减毒活疫嫠“”；雹内蠲骚疫筵戆臻究毽王杰进行中‘”1，如狂犬病毒的无毒变异株——sAGl株的口服疫苗经实验对小鼠、野生动物等均安全有效，对穆菇建进艿臼骚产生孛秘挽体，秃不蹇反凌。预耱久狂犬瘸要尽鬣傲笺避免与犬、猫等动物密切接触，选择安全而免疫效果好的疫茁。但是，在我国要对人普及黎露蓠疆防免疫怒缀难骰骜静：徽荮暴露后伤目的及时处理和紧急免疫在治疗入狂犬病足卜分m婴的(最好联台应用免疫皿清)。开发安全、有效的狂犬疫苗无疑是消灭狂犬瘸不可或缺的。目前，人用狂犬瘸疫苗全部是灭活疫苗，精制鸡艇细胞萤漉度离、价格便寰受到了WHO麴黧视；出法蓬Merieux研究所研究成功的掇纯Vero细胞苗稳定、安全、免疫原性好，被w}IO推荐列为首选疫苗， 彦商大学硕士毕业论文一9是一一种有发展前景的高质量疫苗。在动物主要采用弱毒疫苗，如Flury株的HEP株、LEP株，R本的Rc一¨L株，我国80年代开始引进的ERA株等。另外长春生物制品研究所制备了aG株原代仓鼠肾弱毒佐剂苗，军需大学、长春生物制品研究所分别从SAD株和CTN一1株中筛选了犬用El服疫苗。由于传统疫苗具有一定副反应，或者存在着毒力反强的危险。进入80年代，随着分子生物学和分子病毒学的发展，狂犬病毒的基因组及其编码蛋白的结构和功能已基本清楚，狂犬病基因工程疫苗的研究成为一个热点。研究表明狂犬病病毒中的糖蛋白和核蛋白是诱导机体产生抗狂犬病病毒体液和细胞免疫的主要保护性抗原。亚单位疫苗是用病毒颗粒中的免疫原组分加上适当的免疫佐剂制备而成⋯，现已能够成功的用真核表达系统生产G蛋白、N蛋白，加免疫佐剂后接种动物可诱导对狂犬病病毒的免疫‘”。5“。如1990年，Prohaud等“”以杆状病毒为载体在昆虫细胞系中高效表达了N蛋白，将表达的核蛋白免疫小鼠后，可以诱生高滴度抗体。1984年Kiny等“”分别以痘苗病毒为载体，构建了狂犬病病毒糖蛋白的重组疫苗，在实验动物上取得了良好的免疫效果。1988年，Taylor“”等利用禽痘病毒和金丝雀痘病毒构建了重组疫苗，由于家禽逗和金丝雀逗病毒做载体具有非复制性，在细胞中不增殖，但狂犬病病毒糖蛋白长期持续表达、加工并被呈送到细胞表面；接利，动物后，既安全，又可保护动物免受致死性病毒的攻击，在狂犬病重组疫苗中显示了很好的发展前景。1990年，Prevec等研制了人5型腺病毒载体狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗，给小鼠、狗、狐狸、臭鼬等I二1服免疫后，均能产生高水平的保护性抗体，而且未见载体病毒复制。不失为控制犬及野生动物狂犬病的理想途径。1991年，Lodmell和Fekadu等分别以痘苗病毒、浣熊痘病毒作载体构建重组疫苗，免疫小鼠、臭鼬、猴等动物，均获得了满意的效果”““3。如今狂犬病毒G蛋白和N蛋白重组痘苗病毒口服疫苗均已有制品，在欧美被广泛应用于野生动物收到良好的效果。现在常用于活载体的病毒主要有痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、杆状病毒等，分别具有不同的优缺点”“57、”1。1990年Wolff和Feigner“”合作建立了基因直接注射技术，使核酸疫苗的研究成为一‘个热门课题。1994年，Xiang⋯1和扈荣良等””分别报道，用携带狂犬病病毒糖蛋亡I毓因的真核表达载体接种小鼠，能够诱导小鼠产生抗狂犬病的特异性免疫反应，并能抵抗狂犬病病毒的攻击。1995年Xiang等“”实验表明，CMV启动子控制下的G基因表达较SV40启动予控制下的表达水平要高得多，实验还证明DNA疫苗可诱导小鼠产生长期抗狂犬病 广螽杜走病野毒捧韶和多基园酶克玲与序列分谚·甫撺剑一10病海的免疫力，而不产生T细胞耐受和抗DNA抗体簿副反应。Ray锋“‘”1发现肌注实验小鼠获得对狂犬病衡海攻击的保护高于皮下注射。1983年Reagen等””茸先研究出狂犬病抗独特型抗体疫苗，取得一定的成功，但这种疫苗离临床应用还很远。有研究表明，臼细胞介素一2(IL一2)在狂犬瘸的免疫保护上起羲重要作耀。为了疆究糖蛋白中不冠默段载功能，Dietzschold和Macfarlan筹还分别制备和合成了糖循白的多肽疫菌，但兔烧效果不理想，原因是糖蛋白诱导中和I抗体的戆力还依竣予其爨爱二缀缝捣及三缀镶掬鹣完整拣。更赣～找款痰蔻褥是出狂尖瘸病毒T细胞免疫多肽抗原组成的合成肽疫苗，在体内多次免痰不会产生高水平的抗体，一型．受弼瘸毒黥攻击，就有耦次尧疫效应莘嚣免疫傈护佟蘑。虽然，应潮距离还摄远，偿英不良反应是新型疫苗中最小的。近年米，国内不少学者在新型痰茁的开发上也做了很多的工作并取得了一定的进展。已有学者克隆出G、N基因，用原核、真核细胞表达了G、N基因。1996年秦翠黼、金宁⋯等“”对狂犬瘸病毒糖鬣白基因在原被细胞中的表达进行了研究并获得了高效的表达量。这郡为研巷《适合我国狂犬病控测魏基滋重组瘦萤打下了基础。1992年，林枫等””构建了以瘦苗病毒天坛株为载体表达狂犬瘸病毒CVS株G缀白的委缌体，经皮下注瓣免疫客兔彝小鬣及溱鬻免疫艨藏均可诱导赢瀵爱中秘抗{奉鹣产生，并能抵抗致死剂量的多株狂犬病瘸毒的攻谢；但口服免疫狗未见抗体阳转，而划痕和肌肉兔疫可薅菇高滴寝的中和挠俸产玺。1993年，赵翼国等嘲缀建了袭达狂犬病病毒N蛋白的瘾茁病谳重组体。1995年，在此基础上又组建了共表达CVS棣G和N蛋白的痘黼病毒天坛株重组体，接种小鼠聪证明可产生高滴度的中和抗体并抵抗致死剂遗狂犬痫病毒CVS椿的攻击”1。慰荣嶷等掏建了狂犬病瘸毒6基因的PMTOIO／A+袭达及粒，体辨大量表达并纯化后给小鼠肌肉注射，在Zn2+的诱导下，可在小鼠体内表达G蛋白并刺激中和抗体的产生且糍嫖护小聚抵挠狂犬痰瘸毒CVS檬豹数壹。寇装良等遂糖建了转基霸小鼠，对浚病毒能形成免疫耐受。1996年，吴雷还构建了一株新的重组疫苗其能良好表达G蛋囱具有较好救中秘抗体诱静麓力，瓣CVS株攻击獒有免疫傈护力“8’。罗惩荣等应溺杼获病毒载体成功表达了狂犬病病毒糖蛋白，对利用羹组杆状病毒表达系统刀：发新的荨¨I=犬痫疫薅其有垂要的实戥意义㈨’。李萍等”2’褥建了狂炎瘸糖蛋盘DNA痰茁并对其免疫效梁进行了观察，发现能诱导低水平的中和抗体和记忆性B淋融细胞，并能保护小鼠抵抗Rv的攻击。2000年，张茂林等“”成功构建了狂犬病瘸毒糖蛋白的真核表达载体质粒，且发 彦l西大謦硕士毕业抡文旦现以CMV为启动子表达量高于以SV40启动予的表达量，并探讨了不同转染介质对小鼠免疫应答的影响。2000年，杨裕华等””人构建了狂犬病毒G蛋白两个主要免疫活性位点的重组质粒载体，为深入研究其免疫活性位点的免疫特性及基因免疫打下基础。2001年，李文辉””做了小鼠对表达狂犬病毒3aG株糖蛋白的重组复制缺陷型腺病毒的免疫应答的研究，认为其具有用做基因重组活载体苗的应用前景。2002年，张海等””构建了狂犬病病毒3aG株糖蛋白重组质粒对其体液免疫效果进行了检测，初步表明有预防和治疗狂犬病的潜在应用价值。2002年，李文辉等”71研究了联合运用狂犬病病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果，认为可克服它们单独使用时各自的缺点，能有效地诱导小鼠产生抗狂犬病毒特异免疫。7、本研究的目的意义在国内外学者的不懈努力下，我们对狂犬病病毒的分子生物学、分子流行病学的研究、新型疫苗的开发都已取得了很大的进展；但是，除少数几个岛国之外，世界范围内的狂犬病仍然存在。特别是病毒宿主范围广、潜伏期长，健康动物隐性带毒严重，致病机理相当复杂，都为狂犬病的控制和消灭带来了很大困难。在我国地理范围广，养犬多，普及免疫困难，野生动物带毒情况不明，人的发病率还很高。多年来，广‘西一直是我困狂犬病的高发区和老疫区之一，且被认为从1995、1996年来，疫情有不同程度的回升，严重的危害着人民的生命安全，造成了很大的经济损失”“7“⋯[表1、2]。另外，在我国各地分离到的野毒还很少，对野毒的分子流行病学、致病机理方面的研究还很欠缺，真正投入使用的新型基因工程疫苗还没有。大量收集我国各地毒株进行研究是十分必要的。表11996-2000年7月我国狂犬病倒敦增加的省区及病例的分布Table1Distributionstatusofrabiesatincreasingprovinces 广西狂犬病野毒株宠和多基因的克隆与序列分析·南松剑一12表2广西1989—2000年疫情发展动态Table2Changeinepidemicsituationofrableeinguangxiin1989—2000本研究，对从广西不同地区采集到的三株狂犬病毒N基因和其中的两株的G基因进行了RT—PCR扩增，将扩增出的完整N、G基因进行克隆和测序；并与收集到已发表的国内外毒株进行序列比较分析，找出其核苷酸和氨基酸序列的差异，以期了解广西地区狂犬病病毒野毒株的遗传特点、进化规律和抗原结构特点。将为我国狂犬病病毒分子流行病学、病毒致病机理等方面的研究提供科学的依据，为开发适合广西的新型疫苗打下良好的基础。 痿滞大擎磺主擎韭跨文里1．材料1．1病毒1．1．1ERA疫蓥撩1．1．2野簿{19椽GXLA株GXBM株1．23~4周龄小自鼠1．3试帮及配稍材料与方法广烈大学兽缀院惠赠。2000年分鬻垂南宁淡孛重毽痰犬脑缀织：2003年1月分离自广西隆安一皎人犬2003年3舞分离魏广嚣巴马一发瘸犬。购自广西中医学院试裁CaCl2．H20酵母提敬物胰蛋白胨大肠埃希氏工程菌DH5aM—MuLVReverseTranscriptaseRNAsin40u／／．tldNTPMix0．5u／glMa呔eff天DNA辩i磁珏IEcoRITaqDNApolymeraseAgarosel509PstIBam}{lpMDl8-TvectorRNA撼提试蓑鑫PCR产物纯化试剂盒来源美尉AMRESCO公司大逐宝生物公司大逡宝生物公司本试验室保存MBIFermentasUSASangonMBlSangonSpanishTak剁．a公司Takara公司上海生工上海华舜臻箨基：A、I—B培养基的配制：胰瑕白胨(bacto—trypone)酵蹲提取秘(bacto—extract)NaCl10．0g5．0g10．0g 广曲狂犬病野毒株彩和多基因的克隆与序列分析·南松剑一14加1000ml灭菌去离子水，调PH至7．2，15磅(121℃)高压灭菌20minB、LA培养基的制备：在LB培养基中加入琼脂，使之浓度为1．5％，高压灭菌后，倒制固体平板。质粒提取试剂：A、溶液I(配制200m1)：材料：葡萄糖50mMolnis—Cl(PH8．0)25mMolEDlA(PH8．0)10mMol方法：取葡萄糖1．982g双蒸去离子水160ml0．5mol／Ledta4ml1molTris．Cl5ml以去离子水定容至200ml，高压灭菌15min，4℃保存B、溶液II：NaOH(10Mol／L)2ml双蒸去离子水80mlSDS(10％)10ml用去离子水定容至100ml，现用现配，室温保存C、_}；if液IIJ：乙酸钾(5M01几)60Mol冰乙酸11．5ml双蒸水28．5ml混匀后于4℃保存D、5Mol乙酸钾：配制200ml取乙酸钾98．14g双蕉去离予水160．0ml搅拌溶解后，定容至200mlE、3Mol乙酸钠(NaAe)(pH5．2)：配制500ml取乙酸钠(CH3COONa·3H20)204．1g 彦西大孥硕士毕业论文里双蒸去离子水200．0ml用冰乙酸调pH值至5．2，用双蒸去离子水定容至500ml，高压灭菌后4℃保存。感受态细胞的制备(CaCl2法)①从一80℃取出菌种，在解冻前，迅速用接种环挑取一环划线接种于LB平板上(迅速把菌种放回．80℃保存)。②37℃培养18～24hr。③取单个菌落接种于60mlLB，25℃、100rpm培养1～2d。④钡I]OD600值=0．87。⑤冰浴5min后转移到离心管内，4000rpm、4℃、5rain。⑥弃上清，加50mlMgCl2重悬，4000rpm、4℃、5min。⑦弃上清，加50mlCaCl2重悬。冰浴20min，4000rpm、4℃、5min。⑧弃上清，加12mI12．8％甘油溶液重悬。⑨分装EP管(100I．tl／管)，检测感受态细胞活力，．80℃保存备用。1．4仪器仪器来源冷冻高速离心机TOMYPMC一060旋涡混合器QL一901江苏省海门市麒麟医用仪器厂PCRSprintHYBAID电泳图象分析系统美国．BIO．RAD电泳仪DY一1上海医用分析仪器厂TH2一C恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂37。C恒温箱浙江绍兴手提式蒸气灭菌压力锅上海医用仪器厂TH2一C恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂1．5引物设计表3本试验所甩的B|钓Table3Primers"usedinm缸experiment 广曲狂犬病野毒株彩和乒基国的克隆与序到分析·南松剑一16注：0『物皆由J：海生丁合成2．方法2．1技术线路：收集到的犬脑组织0删m洲(RHN-I／RHN-2)得到刚性材料O小白鼠攻毒或BHK细胞培养病毒复壮和增殖(RHN-1／RHN-2，GPl／GP2)扩增山完整的N基因和G基因0同收纯化曰的基因pMDl8-T连接IU转化^‘肠杆菌臆哥杰纲晌DHEaO0抽提重组质粒DNA几||酶切、PCR鉴定妙阳性克隆[==>序列测定￡==>序列分析图6技术流程图Fig．6Flowchart 彦庙大学硕士毕业论文旦2．2犬脑组织及ERA疫苗株的处理取犬脑海马角组织1~2g，研碎，用Hanks5倍稀释，--20℃保存：取兽用ERA疫苗一瓶加入10mlHanks稀释，分装EP管，--20℃保存。2．3病毒RNA的提取(按UNIQ一5PCRProductPurificationKit说明书进行)①I跌病毒细胞培养液250gl，加入500p,1Trizol振荡混匀；②在混合液中放100p．1氯仿，振荡振荡30sec；③12000rpm离心5min后，取上清约450p．1转移到新的EP管；④)Jrl／k150111无水乙醇混匀后，转移到UNZQ一10柱里；⑤室温放鼍2min，然后12000rpm离心lmin：⑥取出柱，弃去废液，将柱放回收集管，加入450ulRwsolution室温12000rpm离心lmin，重复操作一次：⑦小心取出柱，弃去废液，将柱放回同一个收集管中，空离10000rpm1min。③取出柱放到无菌RNase．free1．5mlEP管中，在柱内膜中央I；HA,DEPC．H2035uI，37℃水浴2min：⑨10000rpm离心1min，弃柱，收集EP管内RNA样品。立即使用或．70℃保存。2．4犬脑组织阳性鉴定(RHN．1／RHN．2)2．4．1反转录eDNA的合成I参Promega公司说明书，具体方法如下，①取抽提好的RNA样品10“l于无RNaseEP管中，加入1glRHN一1(50pMol／91)，于PCR仪中70℃5min，90℃5min后，然后迅速冰浴5min。⑦再加入如下试剂：5XM—MLVRTaseReactionBuffer5．0uldNTPs(10pmol／}t1)2．0ⅢRNasin(40u)O．5“lM—MLVRTase(200u4t1)O．5ulDEPCH20(RNase-free)upto25．0Ⅲ④诵142℃反转录60min95℃5min。反应结束后，立即用于PCR或一70℃保存备用。2．4．2聚合酶链式反应(PCR)：配制50ul反应体系10×ReactionBuffer5．0p,ldNTP(10mM01)0．5ul 广蔷狂天病野毒稼露和乒基舀蝻羌隆与席携分辑·南松盎l堕—————————————m_——————_m—————————————————————————————_——————M———————————————————一弓}穆l(25pMol／≯1)1．0gl引物2(25pMol／p1)1．0rtlMgCl2(25mM01)3．0I-deDNA10，0灶lTaqDNA聚合酶(5u／91)0．5Hl无菌H20upto50gl反应程序如下；(1)72℃5min(2)94℃变性30see，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环(3)72℃5min反应结束后4℃保存。电泳黎定螽．20℃保存备弱。2．5小自鼠脑内攻毒实验和病毒分离将PCR检测为阳性的材料用Hanks液5倍稀释，取1ml样品加入青霉索(终浓度为1000u／mL)、链霉索(100mg／m1)，8000rpm离心10min，取上渣脑蠹接耱小岛聚，0．03ml／只。无蕊驳发瘸濒死麓小自甄魅缝织，萋秀秘，用Hanks5售舔释，一20℃绦存冬罔。2．6小鼠脑组织病毒RNA提取(同方法2．3)2。7强犬瘾毒N基嚣戆扩缮(RHN一3IRHN-4)2．7．1弓I物RHN一3的eDNA合成l方法同2,4．1步骤，加入l¨l的引物RHN一32．7．2写}物RHN-3／RHN．4酶PCR友瘦}组成同2．4．2，反应程序如下(1)72℃5min(2)94℃变性30sec，59℃退火lmin30see，72℃延伸1min30sec，35个循环(3)72℃5min反应结泰惹4℃傈存。2．8狂犬病毒G基因的扩增(GPl／GP2)2．8。1旋转录eDNA瓣台最j方法同2．4．1步骤，加入lul鹣弓l物GPl2．8．2引物GPI／GP2的PCR反应I组成同2,4．2，其反应程序如下 煮滞大擎硕士毕业诧文竺(1)72℃5min(2)94℃变性35sec，55℃退火1min30sec，72℃延伸lmin30sec，35个循环(3)72℃5min反应结束焉4℃保存。2,9毫溶及PCR产兹分掇称取琼脂粉0．8g，量取O．5XTBE液100ml，配成1％浓度。加热溶解，待冷到45℃左右缓骏。取PCR产物5“I加1Ⅲ溴酚蓝混匀加样。100伏电泳60min后，放入10mg／ml的溪亿乙锭(EB)溶液中染色10rainVA上，取密焉漂流lmin，在凝胶成像系统下观察并拍照。2．10PCR产物狡蠲牧(按照上海华舜胶阐收试剂盒说明书进行)2．10．1制胶秘电泳按照常规方法做l％的胶(O．5×TAE稀释)，加热溶解厢待冷却到70℃左右时，每lOml巾掇入8娜瓣LightBlueDye，冷却裂45℃志右惹键黢：将PCR产物用LightBlueLoadingDye6X稀释加样跑电泳；当跑至清晰区分出目的豢鞠杂带露，窃荻(篌尽羹薄)。2．10．2胶回收(步骤中离心速度均为9000g)①称胶，每iOOmg胶中加入300p,I的S1(-若<100mg，加灭菌水补至100mg)：③50℃水浴溶胶10min，颠倒混匀一次／2min；③转入吸附柱，离心30see，倒掉收集管中液体；④加入500}llwl滚(用蘸无水乙醇5馈稳释)，离心15see<室涅低予20℃时，先静溉1min)：⑤重复◇一次：⑥空离1rain：⑦德缀辫秘哮章入一干净的1．5ml的EP嚣中，柱吸附骥rp央期f入30ItlTl液，I纷咒lmin，离心lmitt；⑥立邵使弼或者．20℃保存备用。2．1l涟接： 广西狂犬病野毒株刀和步基因的克隆与序列分析·南松剑一202×Bufier4．0p．1PCR胶回收产物(或纯化产物)1．5ulpMDl8一T1．0talddH20upto10．0p．1混均后，于16℃连接4h：取“；后立即用于转化或于一20℃保存备用。2．12转化①取感受态细胞从-80℃冰箱取出，迅速放入冰浴中30min．：②将Ligationmixture轻柔加入，冰浴20min：⑨42℃热休克90see，冰浴5min：④JJJlA,1ml的LB培养基(预先37℃预热)，37℃，150～200rpm，1．5h培养。用无菌弯头玻棒铺菌器将200p．1菌液铺于含有如下试剂的LA培养平板上：Amp10mg／ml80plIPTG100mg／ml4plX—gal50mg／ml16gl⑤铺菌的LA平板于37℃平放2～3h，然后倒置培养16．22h。⑥将疑似阳性克隆的白色菌落选出，接到新的无Amp的平板中37℃。2．13筛选培养①选好白斑，并编好号②用灭菌牙签挑选白色菌落，=c-R／X,Amp+LB液内(2ml／管)，200rpm培养16h。同时川j接种环把白斑接种在LA平板上，37℃培养24h。2．14抽提质粒①1．5ml菌液转移入EP管中，10000rpm．离心5min，弃上清；②加200ulsolutionI振匀，加400ulsolutionII摇匀，再加300ulsolutionIII摇匀至沉淀：③12000rpm离心5min，取上消，转入一新的EP管；④加苯酚和氯仿(1：1)各250lil混匀，冰浴5min：⑤12000rpm离心5min，取上清转入一新的EP管中⑥加1000ul无水乙醇，1／10的NaAc，一20℃沉淀30min以上： 彦扫大譬硕士毕业论文型⑦12000rpm离心15min，弃上清；④用75％乙醇500ul冲洗沉淀1~2次；⑨37℃烘干，加35ul含RNaseddH20溶解。2．15酶切和PCR鉴定2．15．I取电泳初步鉴定为阳性的重组质粒用酶PstI和BamHI(pMDl8一T载体上T克隆位点两端分别存在这两个酶切位点)分别切割质粒上PsiI和BamHI两个位点(通过计算机查找被克隆株上N和G基因序列内没有这两个位点)。IOXK缓冲液1．0l-t1质粒DNA2．0lagPst10．2PgBamH10．2I．tgddH：06．6I-t1混均后于37℃温育2hr，后进行电泳分析。2．15．2PCR鉴定：反应体系同2．4．2，加入1ul质粒DNA，N基因克隆加入1ulRHN。3、RHN一4，G基因克隆加入1glGPI、GP2。反应程序对N基因克隆，同2．7．2方法，G基因克隆同2．82方法。2．16取阳性克隆测序和进行序列分析挑选已鉴定为阳性的克隆菌落接种于1mlLA培养基中：37℃穿刺过夜培养。由上海生物工程公司采用双脱氧终止法对重组质粒的外源基因片段进行序列测定。将测序结果与已发表的其他国内外已发表的全N、G基因进行同源性分析。2．17重组DH5。的保存①用牙签挑阳性菌接于LA液中②180rpm，37℃，摇约1211r。③取700gl菌液+300gl60％灭菌甘油生理盐水。④．70℃保存。2．18重组质粒的保存①1．5ml菌液转移入EP管中，10000rpm5min，弃上清。②7JHl00ulsolutionI振匀，力n200lalsolutionII摇匀，：再力H150ulsolutionIII 广曲狂犬病盼毒袜韶和多基园的克隆昂序列分钎·南松划～22猫匈至移￡淀。12000rpm5min，取上渣600#l，鸯馨500pl苯懿混匀。③12000rpm5rain，取上清500u1，加苯酚和氯仿各250ul混匀。12000rpm5rain，敬上清5∞pl，麴氯铸250pl溉匀。④12000rpm5rain，取上清400¨l，DnNaAc40lal，1000Itl无水乙醇混匀e⑤一20℃1h，12000rpm15rnin，弃上清，用75％7r一醇冲洗沉淀2次。37℃烘干后予．70℃保存。 磐扫大：擎硕士毕业论文翌二．实验结果2．1犬脑组织的RV阳性鉴定结果：』1jRHN—I／RHN一2对三份犬脑组织进行检测，得到的扩增片段与预期片段580bp大小一致，见图7；鉴定结果，三份脑组织均为阳性，见表4。表4病料来源及采集时间Table4sourcingandcollectingtimeofmaterials图7兰株广西野毒株PCR阳性鉴定结果电泳图Fig．7AmplificationproductswithprimersRHNI／RtlN2fromthreeGuungxiepidemicstrainsbyPCRM：Marker1：ERA株2：GXLA3：1194：GXBM2．2小白鼠脑内接种试验结果小白鼠在接种后11-16天，均出现典型的狂犬病神经症状，主要表现为消瘦、颤抖、后肢麻痹、共济失调和衰竭等，结果见表5。表5RT—PCR初步鉴定为阳性材料攻毒结果Table5resultsofinoculationtofourweekmice一料⋯式鬻ml接篡量鬻赃100％于临床症状()(只))119脑内0．035100第13天观察到有两只出现轻 广舞狂天病野毒椿彬和多基薅酶竞玲奄序醒夸辑·龠橼劁墅脯内0．035脑内0．035对J!({纽腑内0．0330搬数抖现象，同时歼始食欲下降，订神经症状，后肢脯痹，第二天死亡，第14天有两只出现相似症状，当天死亡，第15天，一只{_n现明艘神经疲状，当天死亡。第11天．观察iⅡ有两只出现上述神经症状后，籀二天死亡，14、15、16犬相继死亡3只。第1l天，有一只观察刮神经臻：淡，第二天死亡，第13、14天3只出现同样症状，拥继死c二，第15天1灵出璜症状，刍炎多乏亡=。观察1个月，米见任何异常2．3狂火病毒N基因的扩增、克隆攫定及序列分析2．3．1狂犬病毒N基因RT-PCR结果电泳图餍掰设计露龟括完熬N基因瀚零}耪RHN一3幂鬈RHN．4分溺扩增3傍已麴阳性瘸$；}所得cDNA片段与预期目的大小相等为1511bp，见图8。圈8RV—N基因RT-PCR结果电泳豳Fig．8AmplificationproductsofNgenefromelevenGgualgxlepidemicstrainsbyPCRM’Marker{：1192：GXLA3：GXBM∞0 彦扫大学硕士毕业论文翌2．3．2胶回收结果把三个毒株119、GXBM、GXLA株N基因RT—PCR产物经胶回收，电泳显示，得到很纯的DNA片段，分子量与预期一致，见图9。图9RV-N基因PCR产物胶回收电泳结果Fig．9GelExtractionofPCRproductsofNgene1：1192：GXBM3：GXLAM：Marker2．3．3重组质粒的酶切鉴定剥N基因重组质粒进行酶切验证，结果切出的两条带大小分别为2664bp和1539bp与目的带枉f符，见图10。圈10重组有N基因的质粒酶切鉴定电泳圈Fig·10IdentificationofrecombinantplasmidsdigestedbyrestrictionendonucleasesBamllI，PstIM：Marker1：1192：GXBM3：GXLA 广舞{王走病野毒裱露和彳基壤酶竞玲岛巷列分镄·南松盎g一262．3。4N基因重组质粒的PCR鉴定：对N{，￡因重组质粒进行进行PCR鉴定。所得片段大小与预期一致，为1511bp，初步签定重缀矮粒为戮性，觅鬻|l。瓣11N一嚣#e重魅痰靛PCR婺宠Fig．1IIdentificationofrecombinantplasmidsbyPCRM：Ma矗erl：1192GX{A3：GXBM2，3，5N基因核筏酸和推导氨熬酸序列对比经卜海生物工程公司用自动双向测序仪对119、GXBM和GXLA的N撼因进行了序列溅定，络采得到长凌为1353bp瓣霓整N攀嚣序捌，擦导爨氨綦骏序魂K发为450a＆。：懈NJI≮闪的核：『1酸和摊定氨基酸序列与收集到已发表的棚关海株刈jc,，j，州N的饮⋯睃霹l氨J玉簸序列对比翔F，觅潮12～13。图12N基因棱苷酸序列对比Fig．12ComparisonofuueleotidesequenceaboutNgene0frabiesvirus10203040506070⋯⋯⋯十一⋯一--+⋯⋯⋯+⋯⋯⋯÷一⋯～+一⋯⋯+⋯～⋯4lATGGAFGCCGACAAGAI”rGTATTCAAAGTCAATAATCAGGTGGl、C1、CTTTGAAGCCTGAGA7FTATCGTGGPV1．．．．．．．．．．．，．．．G，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．+．．．．．．，，．．．．．．．．．．．．．CVS1．．，，，．，．⋯．，．，．。．．，．．．。G．．CT⋯．．．⋯。。．．．+，⋯．．，G．．．．。。，．．．。．．．C．．3aG1．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．，，．SADIjl9I．．，．．，．+。．，．．。，．．+，．．G，．．⋯．．．⋯．．，，，，⋯C，．．，。，．+e，．，．，．．。7t叫、Nl，．．，．。．．，，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，，．．．．．．．，．．．．，C．．．．．．．．A．．．．⋯．．，．．1191．．．．。．．．．．．．．，．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．CC．．⋯．．C．．．．．．．．T．．。。GXI．^{。．，、．、。。，．，，，、．．+，，(；。。．．⋯⋯。，．。．，。．。．．，．⋯e．．。．．．．．A。．。，．e．．。。，。}。t；Xl{M 痿商式摹疆圭擎整论文一278090100110120130140～一⋯+一⋯⋯+⋯⋯⋯+⋯一⋯+——⋯⋯一+⋯⋯⋯+⋯⋯⋯+71ATCAATATGAGTACAAGTACCCTGCCATCAAAGATl叮GAAAAAGCCCTGTATAACTCTAGGAAAGGCHCCPV?1．。．．．．．．。．．⋯．．。。。。⋯，．。⋯。+G．。⋯。⋯，。．+。T．。，．．C．。C⋯．+G。。A。．C．。CVS71．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．。．T．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．+．C．．．．．G．．A．．C．．3aG71．，．．，．，．．．．．+．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．。．．．SADB197l，。．．．．+。，．A，．．．。A．。T．。G+．。。．．⋯．．e。．⋯G．．A．。。A。⋯C。．e。。。．．G。．A．。⋯CTN71．．G．．．．．．．．．．．A．．．．．A，．T⋯．．G．．C．⋯．G．．A，．TA．．．．⋯．．．．．．G．．．．．C．．i1971。．．，．⋯．，A。．．．．A，．T，．A．．．．⋯⋯，C．．．．．G。．A⋯A．．．．C．⋯．．．．G．．A．⋯GXLA71．．，+．．．．．。A⋯⋯．．．．．A．．T⋯⋯．．，C．⋯G．+A⋯A．．．．CT．C．．．．．G．．．．⋯．GXBM1501601701801902002i0一一一～～一一+一一一～～一一+一⋯一一一十～⋯⋯～一十一⋯一～～+一一一一一一一十一～一一一一～+141CGATTTAAATAAAGCATACAAGTCAGTTl丁ATcATGCATGAGCGCCGCCAAACTTGATCCTGACGATGl、Al’Vt41。．．C．．G．．C⋯，。。．。。．．A。．．。．⋯⋯，G⋯⋯AT。．。．．．．⋯。。．。⋯G．。T．。．．。．CVS141．．C．．G．．C⋯．．．．．⋯A⋯⋯．⋯．．6⋯⋯AT⋯⋯．．．．⋯．．．．C．．．．．．．．．3aG141．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．⋯．．．．⋯G．．．G⋯．。．⋯⋯⋯，．⋯A．．．．．．⋯．⋯+SADB19l《1，．．C．。．．．C．。G⋯．⋯⋯⋯．CC．G．．．G⋯⋯AT．．1⋯．。G．．G．⋯，G+．T．．．．。．0雕14iA．CC．G．．⋯⋯．．．．．⋯．．CC．G．．TG⋯．．．A⋯T．．．．．G⋯．．．．．．．．T．．．．．G11914IT．，C。⋯．C。。．．．．．⋯⋯⋯。CC。G．．TO+。⋯，AT。．T+，T．．G．。．．．。．。G，。Tt。⋯GGXLA141．．．C⋯．．C．．G．．e．．T．⋯．．．．CC．G．．TG．T⋯．A⋯T⋯．，G⋯．⋯．．．．T⋯．．GGXBM220230240250260270280⋯⋯⋯+⋯⋯一+⋯～⋯+～⋯⋯+⋯⋯⋯+⋯⋯⋯+⋯⋯⋯+21TG丁rccTATTTGGCGGCGGC从TGCAG荆TTGAGGGGACATGTCCGGAAGACTGGACCAGCTATGGAAPV211．。e．．，．．C．．+．．A．．A．。．．．．．．．。．C．．．．．+，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．++．，．．．．。、．．CVS211．．．．．．．．C．⋯．A．．A．．⋯⋯⋯C⋯．．．．⋯．G⋯⋯．⋯⋯．．．．．⋯．．⋯．．3aG211．。。．。。。．．．。。．．A。．．。．．+。．，，。．．．．。，．．。．．。．．．．。。，。．，，．．．．．．，。．。．．．．。．．．．。SADB19211．．．．+T．．C．．A．．A．．T．．⋯⋯A．．C⋯．．．．．。．．．．．C．．T．．．．．．．．．．AT．．．．C．．G．C’rN211⋯．，．．．C．．⋯A．．T⋯⋯．．A．．C⋯．⋯．AG．．．．C．．T．．G⋯⋯．．．．⋯．．．．．．119211．．e⋯．．C，．A+．A。。T。，，。．．。。A⋯。。C．．A，．．。。。．．C．．C⋯⋯．．。。勰。。。．。C，．G．GXLA211．．．．．⋯．．．A．．A．．C．．⋯．．．A．．C⋯⋯．．A⋯．．C．．T．．G⋯．．⋯⋯T．．．。．．GXBM290300310320330340350⋯⋯⋯+--⋯～一十⋯～⋯+⋯⋯⋯+⋯⋯～+⋯⋯一十⋯一⋯+281TCGTGATTGCACGAAAAGGAGATAAGATCACCCCAGGTTCTCTGGTGGAGATAAAACGTACTGATGTAGAPV281．．C．⋯．．．．．．⋯⋯．⋯．G⋯⋯．．．．AAC．．．．．A⋯．．⋯⋯G．．．．．．．．．．．．．．CVS281．．T．⋯．．．．⋯．．A．．．．C．．．⋯⋯．．．A^．．．．．G⋯．．．A．．．．．，．．．A⋯．．G．．3aG28i。T．，，．．．．。。．+，．。，，。，．．。+．。．．．．。．．，。．．+。．．，。．。。．．．．。．+。。．．，．。．．．。。，。．．．SAD111928I．．t．．⋯．⋯⋯．．⋯．C．．A．．⋯⋯T．A⋯．．．T．．A．．T⋯．．G．．．．．。．C．．、、、C’IN281．．C．．．．．．．．．，．．．．．，．．C．．。．．，。．T，．T．A⋯，．．T．．A．，．⋯．．．。⋯⋯．．。．．．．11928I。．t⋯C．．。．⋯⋯．。⋯．。A⋯⋯．．T．AC⋯，。T．．A．．C．⋯⋯⋯．．．，。．．。。．GXLA281．AT⋯⋯．⋯⋯G．．．．．C．．．⋯⋯．．C．A⋯C．．T．．T．⋯⋯．．．A，．⋯．．．．．．GXBM 广西狂犬病野毒株彩和多基因的克隆与序到分析·南松剑～28360370380390400410420一一一一一一一一一+一一一一一一一一一+一一一一一一一一一+一一一一一一一一一十一一一一一一一一一十一一一一一一一一一十一一一一一一一一一+35lAGGGAATTGGGCTCTGACAGGAGGCATGGAACTGACAAGAGACCCCACTGTCCCTGAGCATGCGTCCTTAPV351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．T．．．．A．．．．．A．．T．．．CVS351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．GA．．．．．．G．．．．．．．．C．．．T．．．．．．．．T．A．T．G3aG351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．SADB19351．．．．C．．．．．．．．G．．．．T．．．．．GT．．．．G．．G．．．．．⋯．．．GT．．．．．．．．．．．．．T．．CTN35I．．．T．．．．．．．．A．．．．．G．．．．．T．．．．．．G．．．．G．．．．．．．．，．．C．．TG．．．．．．．．．A．．T．．．119351．．．．．．．．．．．．．．．G．．G．．T．．．．．GT．．．．G．．．．．．．．．．．．．GT．．．．．．．．．A．．T．．GXLA351．．．．．．．．．．CT．．．G．．．．T．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．A．．T．G．．．．．．．A．T．．GXBM430440450460470480490⋯一⋯-+-⋯⋯一+一一一十⋯～一+一一⋯+一一一+⋯⋯⋯+421GTCGGTCTTCTCTTGAGTCTGTATAGGTTGAGCAAAATATCCGGGCAAAGCACTGGTAACTATAAGACAAPV421．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．A．．G．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．CVS421．T．．．．．．．．．C．A．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．A．．A．．．．A．．．C．．．．．．．．．．^．．3aG421．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．SADB19421．7r．．．．．．．．⋯．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．A．．．．．．．．A．．C．．．．C．．．．．．．CTN421．T．．．．．．．．T．．．．．．．．A．．．．．⋯．．．．．．．．⋯．G．．．．．．．A．．．．．．C．．．．．．．．．．．119421．．T．．．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．G．．．．．．．A．．．A．．C．．．．．C．．．．．．GXLA421．．．．．．T．A．．⋯A．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯G．．A．．．．A．．．．．．C．．．．．C．．．．．．．GXBM49l19l49l49149l56l56156l56156l500510520530540550560一⋯⋯+～一⋯+～一一+～一⋯+⋯一⋯+一一⋯+～一⋯+ACATTGCAGACAGGATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCTTTTGTTAAAATCGTGGAACACCATACTCT．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．T⋯．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．G．．．●●●●G．．．G．．TT．．．．．．．C．．C．．G．．．．．A．．．T．．．．．C．．．．．A．．G．．．．．A．．．T．．T．．．．．C．．C．．G．．．．A．．．T．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．GCI，VCVS3aGSADJ319C1'N119GXLAGXBM570580590600610620630～⋯一+～⋯一+一～一+一～一十一～一十⋯一一+～⋯一+AATGACAACTCACAAAATGTGTGCTAATTGGAGTACTATACCAAACTTCAGATTTTTGGCCGGAACCTAT．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．⋯．．．．A．．．C．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．CC．C．A．．C．．．．TC．．A．．TCsGDN9队附¨叫c雩趴∞¨似㈣ 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广蒋牡天焉杼毒镶韶和多基舀鳞羌玲毒序瑚分新·南豁盘}一30920930940950960970980⋯⋯⋯+⋯⋯⋯+⋯～⋯+⋯⋯～一+～⋯⋯+⋯⋯一一+⋯～⋯+CTGTTGGTCACGTGTTCAATCTCATTCACTTTGTAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGATCCCTAAATGC。。。。e．．．，。1．。．⋯。。。。．⋯．．。。．．．。．1．．⋯。。。C⋯．⋯。．．⋯．．．．}⋯．。．。．C．．，．．．．．T．．．．．．．．．．T⋯．．．．⋯．T．．．．．．．．⋯．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．T．A．．⋯．，．A．．．．．．TA。。．．⋯。．A．，．．．．．．．PVe￥S3aGSADB19eTN119GXLAGXBM9901000t0101020103010401050⋯⋯⋯十⋯⋯一+⋯～一}⋯⋯⋯+一⋯一+⋯⋯一+⋯⋯⋯+981AACGGTTATTGCTGCATGTGCTCCTCATGAAATGTCTGTTCTAGGGGGCTATCTGGGAGAG6AATTCTTCPV981S．，．．，．．．．．。，．⋯．。．．C。。。．．．．．G．．．．。．．．．．⋯．⋯。．．．T⋯．，．．．．．+．。．．．．CVS98I．．A．．．．．．．．C．．．．．．．．．．，．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．A．．G．．．．．．．．．．T3aG981．．．。．．。．．．．．．+．．．，．．。。。．．，．．．．，。。．。．．．+．．．．．．．．．．。．。．．．，．．．．+．，．。，．．．．SADB19981，．．．．。．．．．．C⋯．．．．．A．。C．．．．．G．．．．．⋯。，．G．．A．．．．．CT．⋯．．⋯．G．．T|．TCTN981C．．A．C．．．．．C．．T．．．．．C．．C．．．．．．⋯．．A．．．．．C．．A．．．．．．n⋯．．⋯．G．．T．．T119981．．。A；。．⋯。．C⋯．，。，．C，．C。．，。。G．。。⋯⋯．，G；．A⋯．，e1．，。；C,-．⋯．G，。T。。TGXLA981G．．A⋯⋯．．C．．⋯．⋯．．C．．．⋯⋯．．⋯．．．T．．A．．．．．．T．．，．．．．．．．G．．．．．GXBM10601070108010901100i1101120⋯⋯---+一⋯⋯+⋯一⋯+⋯一⋯十～～⋯一十⋯～一+⋯一⋯+1051GGGAAAGGGACATTTGAAAGAAGATTCTTCAGAGATGAGAAAGAACTTCAAGAATACGAGGCGGCTGAACPV105I．．A．．．．．．．．．．．．。．．．⋯．G．。．．．⋯⋯C．⋯．．．．．⋯．．．．．⋯T．．．．．．．．．．．．．CVS1051．．．．G．．．A．．．．．C．．．⋯⋯．．．．⋯⋯．．．⋯⋯．⋯．⋯．．⋯．．．．．．A．．．．．．．3aG1051．，．，。，．．，。，．，。。。。．。。．。．+。．。．。。，．。。，。．+。．，。．。+。．．。。。。。．．。，。；。．。．．．．．．．．SADB191051+．A．．G．．．．．G．．．．．．．．．．⋯．⋯．。⋯．⋯．．．．．．．⋯．．⋯．t．．．．．．．．．．GfI_C’FN105t，．A．．G．．A．．G，⋯⋯．．C⋯．．．．T．．G．．．．．A．．G．．⋯．．．G．．G。+T．．．．。A．．C．G．1191051。．。．．G。．．，．G，+．，．．。。．。。．。，．。．。．，．。．。。．．．，．．．．．．．．．．．。G。，T．．，．．A．。．．．GTGXLA1051．．A．．．．．A．．G．⋯．．．．G⋯⋯．．⋯⋯C．⋯．G．．⋯．．．G．．G．．T．．．．．．．．．．．．TGXBM1130114011501160117011801190⋯⋯⋯一十一⋯～+⋯一～十⋯⋯⋯+--⋯⋯一+～⋯一+⋯～⋯^I≮ACAAAGACTGACGTAGCACTGGCAGATGATGGAACTGTCAACT鼹甚ACGACX；AGGACTACTTCTCAGGPV．A．．．．．．T．C．．．．．G．．．．⋯．．．．⋯C⋯．．C⋯．．．．．．，．T．．．．⋯⋯．T⋯．T．．CVS⋯．．．．．．．．．．．．．G．．．T．⋯．．．．．⋯⋯．⋯+．．．．。⋯T．．⋯A．．．．。⋯．．．C．。3aG··-·-，tt···，，，t⋯t·，⋯-．-t．⋯-⋯．．，⋯．。．+⋯．，．。⋯。．，⋯．．1'．．．．，SADBi9．A．．C．．．．．．．．．t⋯．．⋯⋯．C⋯．．．．．C．⋯．．．．．．．T．．T．．A．．．．．T⋯．C．．CTN⋯TG．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．C．．C．．G．．C⋯。，T．⋯．T．．．⋯．．T。．⋯．．．e。．119，A．．T．⋯．．．．．T⋯．．．．⋯．．．e．．C．⋯。C⋯．．．．．．．．T．．．．．A，．．．．T．．．．．C．。GXLA⋯．G．．．．．C．．TT．⋯．T⋯⋯．⋯C．．G⋯⋯．T⋯．．T．⋯⋯⋯．T⋯．．T．．GXBM．TTlT—tt—n～一Q一&一一m一&．．T，～tCt叭姒叭川蓍i⋯孚iⅢ2 彦西大学硕士毕业论文翌126l1261126l1261126l120012i012201230124012501260～一一+一一⋯+一一一+⋯⋯一十一一一+一⋯⋯+一一一--+TGAAACCAGAAGTCCGGAAGCTGTllATACTCGAATCATAATGAATGGAGGTCGACTG从GAGATCGCACPV．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．T．．TCVS．．．．．．．．．．G．．．．A．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．T．．G．．．．．．．．．．．．．．．．A．．A．，．．．．．T3aG．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．T．．．SADB19．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．G．．．．．C．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．CTNC．．G．．G．．G．．C．．T．．G．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．C．．．．．．．．．．A．．．．．．A．．i19．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．GXLA．．．G．．．．．G．．．．．T．．G．．．．．C．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．G．．．．．．．．A．．．．．．A．TGXBM1270128012901300131013201330一一一一一一一一一十一一一一一一一一一+一一一一一一一一一+一一一一一一～一一十一一一一一一一一一+一一一一一一一一一十一一一一一一一十ATACGGAGATATGTCTCAGTCAGlvrCCAATCATCAAGCTCGTCCAAACTCATTCGCCGAGTTTCTA^^CAAA．A．．T．⋯．C．．．．．．．TG．C．．．．．．．T．．C．T．．C．．．．．C．．T．．．T．．．．T．．．．．T．．．．13401350一一一一一+⋯⋯一+一1331AGACATATTCGAGTG^CTCATAA1331．．．G．．．．．．A．．．．．．⋯．1331．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1331．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．133I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1331．．．．．．．．A．．．．．．．G．．．1331．．．．．．．T．．．．．．．T．．．1331．A．．G⋯．．TPVCVS3aGSADB19CTN119GXLAGXBMPVCVS3aGSADB19CTN119GXLAGXBM图13N基因推导氨基酸序列对比Fig．13ComparisonofdeducedaminoacidseqenceofNgene10203040506070⋯⋯⋯+一一一十⋯～一十⋯⋯一十⋯～一十～一～+～一一+1MDADKIVI?KVNNQVVS[。KPEIIVDQYEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLNKAYKSVLSCMSA^KLDPDDvPV1．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．N．．．．．．．．CVS1．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．G．．．．．．N．．．．SADB191．．．．．．．RA．．．．R．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．G．N．．．．．．．3aG1．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．G．N．．．．．．．．CTN1．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．G．N．．．．．．．．119㈣mmm㈣㈣m．．T．．G．●■●T．．T．●A．●■●．T●．．TT●■●．．G●■●■●■．．C．●C 广画狂犬病野毒株彩和多基因的克隆与序列分析·南松剑一32717l717l712ll21l2112ll21l21128l281S．．S．SGNG．NGXLAGXBM8090100110120130140一一⋯十一一～+一一⋯+一一～+一⋯～+⋯一一+～一～+CSYLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGIVIARKGDKITPGSLVEIKRTDVEGNWALTGGMELTRDPTVPEHASLPV．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．R．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．CVSNL．．．RL¨．．．．L．．．L¨．．．．L．．．．N．R．．D．．．DD．．．．D．．．DD．．．．N．．．．．．SADB19S．．S．．3aGS．．．．．CTNA．．．119S．．．．．GXI．AS．．．．GXBM150160170180190200210～～⋯+～～一+～一～+～一～+～一～+一一～+⋯～～^VGLLLSLYRLSKISGQSI’GNYKTNIADRIEQIFETAPFVKIVEHHTLMTTHKMCANWSTIPNFRFLAGTYN．NPVCVSSADB193aGCTN119GXLAGXBM220230240250260270280～一1--+～一～+～一～+⋯～一+一～～+～一～+～～⋯+DMFFSRIEtILYSAIRVGTVVTAYEDCSGLVSFTGFIKQINLTAREAILYFFHKNFEEEIRRMFEPGQETALPVCVSSADB193aGCTN119GXLAGXBM290300310320330340350～～⋯+⋯⋯⋯+一～～+～一一+一～～+～_--一+⋯～一‘Vl’IISYI?llII?RSI—GI—SGKSPYSSN^VGIIVFNLIIIFVGCYMGQVJiSLN^1’V1AACAI，ItEMSVLGGYI．Gl!l_?Fl，V。+‘’‘‘’‘‘‘’‘‘’’‘。’4‘‘‘’’‘‘···-···········-．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．CVSSSADB193aGCTN“gⅢⅢⅢⅢⅢⅢⅢⅢ 彦．西大警硕士毕业i仑文塑28l281GXLAGXBM360370380390400410420一一一一一一一-+-一一一一一一----+----一一一一------+--一一一一一一+一一一一一一一一一+一一一一一一一一一+一一一一一一一一一+351GKGTFERRFFRDEKELQEYEAAELTKTDVALADDGTVNSDDEDYFSGETRSPEAVYTRIIMNGGRLKRSHPV351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．M．．．．．．．．．CVS351．．．．．．．+．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．、⋯．．，．．．．．．．．．M．．．．．．、．．．SADB1935IR．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．A．．M．．．．．．．．．．3aG351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．CTN351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．119351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．GXLA351．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．GXBM42l42142l430440450—-——————⋯——一+---一——√～————～——^一1RRYVSVSSNHOARPNSFAEFLNKTYSSDS，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．N．．．PVCVSSADB193aGCTN119GXLAGXBM对测序各株A、T、G、c含量进行了统计分析，A的含量最高，28．53％以上，其次为T和G，分别为25．78．27．27％年H23．2I．24．52％，C的含量最低，21．14％以下，见表6。表6各毒株碱基含量'rable6DNAStatistics单克隆抗体分析表明，核蛋白包括3个主要的抗原位点，能够刺激机体产生非中和抗体，对其主要抗原位点上的氨基酸进行了比较，发现抗原位点N。上的氨基酸在三株型f诲株均发生了变化，119在335位上Tha变成了Met，339位上GXI。^和(；XBM均JVal边成了Leu，推测这些变化会影响到核蛋白抗原性的变化。比较还发现两端的氨基酸变异较中间部分变异大，尤其是90～140位氨基酸变异二作常明显，可能是因为这些部位属于高变区的缘故。 广西壮太病野毒株韶和多基因的克隆与序列分析’南松剑一34鸯磺究认必NP是诱磬狂犬瘸缨藏兔疫静主要成分，1989年，Ertl等发现NP394—408、NP404．418、NP21．35楚Th缍施静主要表位，率研究对这些表位的氨基酸送行了窥察，发现与其它毒株稻院，三株野海株均没有改变。2．3．6N基因及推导氨基酸的同源性分析把三株狂犬痰毒N基因的核慧酸积撼导氨基酸序列分爨蝰与已发表懿浆些毒椿遴车子溺源性憋分援，见憋14～15。比较所攫《褥兰株广瑟野毒棒的核替酸藕雄导氨鏊酸嗣源往，孩瞢酸同源性在89，l～89．7％之阀，差弊碉漫，氮摹酸闻源性在97．8~99．1％之间，涎高于对应核苷酸的同源往。将三株野毒N基阑核苷酸和推导氨基酸序列与中国人用疫苗3aG株进行了比较，同源性分别界于84．9～86．8％和94．7—95_3％之问，具有一定的差异。将三株野海与CTN株进行比较，发现核鸯酸期氨撼酸同源性捆对均较赢，如GXLA和CTN核萤酸同源性达到95，O％，氨基酸羼源性达到99，3％，CTN橡系1983年分离爨中国济南，经过传代致弱绲到魄一拣翱定毒，出予其獒有缀好我兔疫琢程和安全往，正在发展其Vero缨嬲萤。将广西三株鹭毒秣与PV、CVS和SADB19等国外固定毒株进行比较核苷酸闹源性在86．1—88．3％之闻，氨基酸同源性在96．9固8．2％之间，较为集中。霉14务毒棘N箍困简棱替馥序列的筒潺畿F唔14ThehomologyofnucleotidesequenceaboutNgeneamongeightstrainsIPercentIdentity1234S6781-}92892．299．088386．187．887．71PV277蛋■{92．0i92．9{89．086．388087．62CV8岱38．4酯|—曛92．3}87．484．986．886．133aGC41．07．68．3l—i!．486．588，089．3瘁SADB伯∞513．112．214．212．g强___■l88．895．089．45eTNo615815．617．515．312．3i●■|89．．89．1611g7’3．613．415．013．46．311．2l■{89．47O×LA8{3．8{3g{518t3奄11．712，0⋯．7}■曛8G×国MI1'23l456}7l8； 震庙大华硕士毕业i仑文翌图15各毒株N基因闻氨基酸序列的同源性Fig．15ThehomologyofaminoacidsequenceaboutNgeneamongeightstrains∞C∞三oPerc81"1lIdentity12；3456781|■■97．8i99．194．997．396．997697．61PV2l■_l98．295．8976973982982CV830．91．8l_l95．39739739809803SAD日1g45．343i4．8_95．194．795395．343aG52．72．5l2．751l_l97．19939845CTN63．22．7；2．75．52．9■■■l978978611g7251．8l2．04．8|o7i2．2l_l9917G×LA8251．8l2．04．81．620．gli8G×日M12l3456782．3．7N基因的遗传系统树分析为了分析广西街毒与其它毒株在遗传进化上的关系，把N基因与收集到的已发表某些毒株核苷酸进行比较建立遗传进化树，见图16。山遗传树看到，基本上被分为固定毒和街毒两个大的类群，广西的几个毒株被分为一个群，固定毒在一个群，但其中CTN属于近期分离到的毒株，传代次数比较其它固定毒株来说较少，生物学特性上更接近于野毒株，也被归于野毒类群。图16N基因的遗传系统树Fig．16PhylogenetictreeonNgeneofrabiesvirus 广西狂犬病野毒株刀和多基因的克隆与序到分析·南松剑一362．4狂犬病毒G基因的扩增、克隆鉴定及序列分析：2．4．1狂犬病毒G基因的RT-POR扩增刖所没i,l一的包括完整G基因的引物GPl和GP2对119号和巴马株分别进行扩增所得cDNA片段与目的片段大小相等为1700bp，见图17。圈17RV—G基因RT．PCR结果电泳图Fig·17AmplificationproductsofGgenefromtwoGuangxiepidemicstrainsbyPCRM：Markerl：1192：GXBM2．4．2胶回收结果刈119、GXBM株G』燕囡RT—PCR产物进行胶刚收，获得较纯的DNA片段致，见俐18。图18RV—G基因PCR产物胶回收电泳结果Fig·18GelExtractionofPCRproductsofGgeneI：1192：GXBMMMarker 磐滞呋挚疆圣擎建l￡砭一372．4．3重组屡越的酶切鉴定划两株的G基|7；il重组质粒分别趔上行酶切验证，因为插入片段位旨两侧距酶切位点还有28bpr结梁溺-tt女的两条带大小分潮为2664bp和1729bp，与露舱带耗l锊，觅圈19。鬻19重嘏霄G基因辩蕨粒酶留箍定电辣鬻Fig·19ldenlificationofrecombinantplasmidsdigestedbyrestrictioneadotluc|easesBamlli，PstIM：Marker1：1192：GXBM2，4。4重缓质粒的POR鉴定：刈119、GXBM株灼Gj是堋煎纵质粒进行进行PCR熔定敏，分刖为1700bp，初步豁定重组质粒为Ⅲ性，见图20。嬲20tG-gene重组斌糙PCR鉴定Fi920：IdenfificafionofrecombinantplasmldsbyPCRM：MarkerI：1192．GXBM 广办狂天病野毒诛霄{口g基壤酶走玲骞巷裂参蟹-离松铷一38一—_—————^_㈣———————___——————__M—●————J_wⅧ——————_H___-—————H__-———————_-—————————●—————————————————一2。4．5毪纂爨孩簧酸稳推导氮基酸的序到对跑经lJ|海生物工程公司刷自动测序仪对119、GXBM的G基因进行了双向序列测定，缭聚徭到了编码狳爱自浆完整G蒸磷序确，长度为1575bp，箍等氨蕊羧序歹《长度为524aa。j阿J￡核：⋯酸和推导氨瑟睃序列与l恢尜到的已发表棚关毒株对应基网的核苻酸莉I氨纂酸序列对比如下，觅图2l~22。图2lG基因核营酸序列对比Fig，21ComparisonofnucleotidesequenceofGgene10203040506()7()7l717l7I7l707l7I7l⋯⋯⋯÷⋯～⋯一一+～⋯⋯一～+⋯⋯⋯一·}⋯⋯⋯+⋯⋯⋯^～⋯一⋯一}^7l、(；G”’cC’FCAGGC’1、CTCCTGTT’FGTACCCCTTC’FGGT'I’TTTCCATTGl、GT’FTTGGGAAA’FTCCC‘fA⋯Inr}1V．．．．．．．．．1、．．，TT．．⋯．．．．T．．．．．．．．G．．．．T．G．，．．。．．．C．．．．．G，．．．．C．．．、(：VS一1}．．．．．．+．．。．．eI’．．．。11、．．．+。．C．+．，．．C．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．C．．．．(；+．．．．C．．．．1、IUl’Y．．．．．A．．．．f’r．．C．．．．．．．．．．．G．．．nT．．．．．．．C．．．．．．．：{}lG。，．．．，．+．，，．．．．．．。．，．．．．．+。。，．。．．。。．。．．。．。。．。。．．。。．．．．。．e．，．．。．。．。．．。．ERA．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．SADB19．．．．．．．．．TA．．．．Tr．．c．．．．．．．．，．．．．G．．．．T．T．．．．．，，。C．．．．．．．．．．．1，(；．。．A．C+。。。‘}A，．、．．f；‘}，．，，．．．。。。7．。。．．．，．．。．．．1、一⋯。．⋯C．．．。。，，。。．．。．．．。e’’N．A．．．．C．A．．．‘r．．．．．．G．．．．C．．A．．C．．C1、．G．．．．．．．C．．．．．．．．C．．C．CNX8511．．．A．，+．C．．A．．．．．T．．⋯．．．G．．⋯C．．^．．C．。CT，G．．．。．．．C⋯。．．，．．．。C。．C．CNX8601．．．．．+．．．．．A。。C．．T．．．，．．．．．．．．．．．．．+，CCA．。．，，．，．．．．．，．．．．．．．．．+．e．+．．CGX89-1．．^．．。．．．．．TT．．．．．．G．．．．．．T．．．．．．．CT．G．．．C．．C．．．．．．．．．．C．C．119⋯．。⋯．．，A。T．．．TT．⋯．。，T．．．，．，。．A．．。．．C一1．G+CA．。。．．e⋯．，。．．．．．C，，．．(；XBM80901001101201：i0一一一一～一一+一一⋯一一一十～一～一一一一÷一一一一～～～～一+一一一～一～一+一一～～一一一一{一一一一一⋯一一ACACGA7FACC^GACAABCF’FOG7FCCCTGGAGCCCGA’fTGAC^1、^CATCACCrC^GC’rGCCCAAACAAT+rl，V．．．，．．．．．．．．．G．A．．⋯．。．．，，．．。．．．T．⋯．．⋯，。C．．T．．．．．．．．，r、．．．．T．CCCVS-ll一。．．．．，．．．．，，．．．A．。。．．．．．．．．⋯．．．’r。⋯．．TAI磕CA．．T，，+，。．，+t．．，．羊．。Cel?hjrtv．．．．．．，，．CA．，．．．．．．．．．．．．．．C．T．．。．．．．T．．．．．_r，，．．．．．．：{：t(；～。，．。．．．．。’I、。，+．．，．。．．．．．。，．、．+．．．．。．．，．，．．。．。。。．，。．．，++，．，+．．．，，．。．．，+ERAC^．。．．⋯．．CA，．。，．．。．。，．A．．C．．．．．^．A．(：、．．、．A．A．．C．，．．．．，A．．．．．C．T．，A。，．．。．．．A，T．．．．．．C。．T．。。。，．C．．彳TC，．．．．|1．。C，+。．，、t．C．．．．．’l’T．T．．Tt．e。。e。。T160170180190200～一一一一一十一一一一一⋯～+一一一一一～一一÷一一一⋯一一一{一一～一一一一一一#一～一一～一．SADI{19．{’(，C翻、NCNX85lI．(’NX88{11．C(；X89～】、119ef；X8埘 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窟商大学硕士毕业论文4_3910920930940950960970+一一一一一一一一一+一一一一一一一一一+一一一一一一一一一十一一一一一⋯一+一一一一一一一一一十一～一一一一一一一+一一一一一一一一一910GATGCACTAGAGTCCA’FCATGACCACC从GTCAGTGAGTTTCAGACGTcTCAGTcATTTAAGAA从C”GPV910．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．CC．G．．．．．．．．．．CVS—iI910．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．G．．．．．．．．．．Flury910．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3aG910．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．ERA910．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．SAD919910．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．PG910．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．TC．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．CCG．．G．．G．CTN910．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．C．．．．．．．．T．．．．．C．．G．．．．．C．．G．．G．．G．．．CNX8511910．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．C．．．．．．．．T．．．．．C．．T．．．．．C．．G．G．，G．．．CNX8601910．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．C．．⋯C．．．C⋯．．．⋯．．．．C．．G．．G．，．．．．CGX89一l910．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．C．．A．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．C．．G、，G．．G、．C．L19910．．C．．．．．G．．．A．T．．T．．．．．．．．A．．⋯C．．．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．G．．G．．G．．A．GXBM980990i0001010102010301040+～一～+～⋯～+～一～+一一⋯+一一一+一～一+～一～980TCCCTGGGTFTGGAAAAGCATATACCATATTCAACAAGACCTTGATGGAAGCCGATGCTCACTACAAGTCPV980．．．．A．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．A．．．．．．．．．．G．．T．．．．．．．．．．．．．．CVS一11980．．．．．，．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．G．．T．．．．．．．．．．．．．Flurv980．．．．C．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．T．．A．．．．．．．．．．．3aG980．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．ERA980．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．SADB19980．．C．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．T．．A．．．．．．．．．．．PG980G．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．G．T．．．．．．．．．．．．A．CTN980．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．T．．．．．⋯．．．A．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．A．．CNX8511980．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．T．．．．．⋯．．A．．．．⋯．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．A．．CNX8601980．G．．．．．C．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．G．．T．．．⋯．．．．．．．．A．．CGX89—1980．．．C．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．⋯．．．．．．G．．T．．．．．．．．．．．．．．A．．119980．．．．．．．．．．．．．．．G．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．A⋯．．．．．．．．G．．T．．．．．．．．．．T．．AGXBM1050106010701080109011001110+～一～+～一～+一一～+⋯⋯一--+⋯一～+⋯⋯～^～一一1050AGTCAGAACTTGGAATGAGATCATCCCTTCAAAAGGGTGTTTAAGAGTTGGGGGGAGGTGTCATCCTCATPV1050．．．C．G．．C．．．．．．．．．．．．．⋯．C．．．．．．．．．⋯．G．A．．．．．．A．．A．．．．．C．．．．．．．CVS—111050T．．．G．C．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．C．．．Flurv1050．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．，．．．．．．．．．G．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．3aG1050．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1iRA1050．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．SAD11191050．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．PG1050G．C^．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．C．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．C．．．^．．．．．．．．．CTN1050．．．C．G．．．．．．．C．．A．⋯．．．．C．．T．．．．．．．C．．．．．．．．．．⋯．．．．A．．．．．．．．．．CNX851l1050．．．C．G．．．．．．C．．A．．．．．．．．C．．T．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．CNX8601 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广西狂天病野毒株刀和多基因曲克隆与序列分析·南松盎Ⅱ一4819119l19126126l26126l26133133l33133l33133l33133l：{3lE．NNK．KGKRPST．．．DD26l27i28I29130i3Il321D．．DK．D．．DFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSIiLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAlJYK11．．．．．．F豫．．．．．．LH．L11．RTINP．．．．．．．PG33I34135i36I37138139l+～～一十一～⋯+～一一十⋯一一十⋯一一+⋯～一+⋯⋯一SVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLVSSVIPLMHPLAQ．．D．．．．．．．．．．AL¨LCVS—11SAD．B19ERA3aGPGF1uryI，V119GXBMcgx89CNX8511CNX8601CTNCVS—11SAD．B19ERA3aGPGF1uryPV119GXBMcgx89CNX8511CNX8601C‘rNCVS一1lSAD．B19ERA3aGPGli】t11-y40l41l42143144145l46l+⋯一⋯+一～一十⋯一一+～一⋯+一一⋯+一⋯～+一⋯～401DPSTVFKNGDEAEDFVEVItLPDVIIERISGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCWRRVNRSEPl、PV401．．．．．．D．．．．．．．．．．．．．．．KQV．．．．．．．．S．．．．．．M．V．．MI．．．．M．．．T．．C．KAGA．SI119401．．．．．D．．．．．．．．．．．．．．．KQ．．．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．M．．．．．．C．KA．A．SIGXBM．-．．VTV-E．_．_．HH．HL．H川H川川Ⅲ眦一一Ⅲ川川．．S 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广两耩犬病野毒替露和多基薅秘走玲每彦程分麟·索壮铷一50——————————————_—————————————_————————H———————_——————————————————H”—————————_—————————————一一衷8糖羲化位点个致羁他蹩翌!!!!基!竺!!鹜!!!望竺i!!!竺!!g!￡!!!!鎏!i!!!!堡!毒株个数—1丁—百—嚣扩1等星期F—汀rj磊—猫可—一研究表明狂犬痫具有至少三个抗原决定簇，分别为GI(34～200)、aII(34～42、198屯OO)、Gl{l(330~357)，GP的抗原性交他零豢怒出菰原决定簇菜些位点熬改变造成，本研究对三个抗原决定簇内的重要位点进行了比较发现仅有GXBM332位氮基酸变异为Ile，说弱备辫毒橡撬覆犍交纯不鬻链，冕裘9。表9各毒撩恚要撬嚣e霞熹上豹费e基蘸Table9AminoacidsonantigenicsitesofGP在抗原决定簇上某些熏要位点氨基酸的变化不但会影响到抗原性的变化，而且会改交簿株静致瘸往窝潦力。磷究中对凌定病毒簿力麓死个重要往点送行了跑较，除CTN舞，两株野毒株来见变化，结果如下，见表10。袭10岛教病性棚关重要饿点的氮熬藏比较结果TablelOaminoacidsinsitesrelatedwithpathogenicity翌G+++++～P++十++}雨¨涸¨¨冀羔嚣誊～3一R}卜十十十+再¨H¨¨锢¨一K++++++||8{A固+++++塑R++十+++、：：：Ⅲ一R++++++一m西K麟毯KK一两¨¨¨¨¨¨惫出撼一舛～N“+十+十十万¨¨¨¨¨¨一G++++++一。普黧纛一 彦．哥大葶硕士毕业_}仑文12．4．6同源性分析把两株狂犬病毒G基因的核苷酸和推导氨基酸的序列分别与已发表的某些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性分析，结果见图23-24。比较所测得的两株野毒以及已发表的CGX89．1(1989年在采集自广西一疯犬脑组织)间的核苷酸和氨基酸同源性，发现核苷酸同源性差异非常大，在86．7～87．4％之间，虽然氨基酸同源性高于对应核苷酸的，但也具有明显的差异，在94．卜94．7％之间；两株野毒与宁夏的两株同源性高于与CGX89—1的比较结果。将测得各野毒株序列与各疫苗株分别进行了比较，ERA株是兽用疫苗株，经比较可看到现用疫苗3aG株和ERA株与三株广西野毒株之间均发生了较大的变异，如核苷酸同源性分别在82．7～84．0％和82．9～83．9％之间，氨基酸同源性分别在88．0～89．5％和90．5-91．6％之间；三株野毒株与CTN株之间的同源性无论在氨基酸和核苷酸水平上均较与3aG株和ERA株比较结果要高。与国外几株固定毒株比较，核苷酸同源性在83．1～83．4％之问，氨基酸同源性在89．5—91_8％之间。狂犬病毒糖蛋白前体包含524个氨基酸，前19个氨基酸为信号肽区，成熟糖蛋白包含505个氨基酸，分为膜外区(20-438aa)、转膜区(439-461aa)和膜内区(462～505aa)，对应核苷酸位置分别为，信号肽编码区(1～57)、膜外区编码区(58～1371)、跨膜区(1372-1440)和膜内区编码区(1441-1575)，根据以往的研究，膜外区是最主要的功能区，决定着毒株的抗原性、致病性等，相对也最保守，膜内区最容易变异。本试验对其也分别进行了比较，在野毒株之间相比，在各区核苷酸的变异性差别不是太大，氨基酸变异性差别明显；野毒株与固定毒株之间相比，无论氨基酸和核苷酸水平上，差别都很明显，膜内区同源性非常低，结果见表11。 广西杜犬病野毒株霄和乡基因的克隆与序到分析·南松剑一52表11G基因不同区段核苷酸和推导氨基酸序列同源性比较Table11Comparisonofnucleotidesanddeducedaminoacidhomologiesofdifferentsegments!!垒：!竺!!!!!罂!!!：一一一——同源性119／GXBM／119／119／119／GXBMGXBMCGX89·1(100％)GXSMCGX89-lCGX89-1ERA3aG／ERA／3aG／ERA／3aG注lnt(nucleotide)．．核苷酸aa(aminoacid)：氨基酸圈23各毒株G基因间核苷酸序列的同源性Fig．23ThehomologyofnueleotidesequenceaboutGgeneofthirteenstrainsPercentIdentity12345678910"12131{■—l89590191398．198191684284184283183．31PV2116啊■_i93188．8B9089189．1829B3983983．48328342CVS一11310873■■匪e9389．eB99e9．58388418398358353Flur，49412311．8狙匪gO．991．199484283283284082782．943aG51g12211．29．8l■I99．591．284084183g8298315ERA∞C619120110g70．5l_91．38418438438428328326SADB1g79112011506g59．4i■一84383383384182882g7PG兰81832011871e318．618418．2曩■■l87．1盯193．387686．78CTN凸918518718419．81e．618219．614．6_l99988．3876907gCNX85111018518718419818．618．219614．601■■e8387690．710CN×86011118419418618618718．31857113113．1}_l87486911C6X89．11219q19719．220320019720．213e’4．O14．0141{■■86712119131g61951922021g．919．720215110210．114．8№1l■■13OXBM123456789l佃"l1213 震庙大学硬士毕业论文翌图24各毒株G基因推定氨基酸序列问的同源性Fig．24ThehomologyofdeducedaminoacidsequenceaboutGgeneofthirteenstrains∞C∞兰凸Percen¨dentity123456789'0111213'|_i91091292291891889388696496689990791．61PV29．6|一；94．194．795．492289．991291．088889．391821193g361i_|94194594．59168959079058808849123G×BM483561■■{94．794793g893918916895901924cgx8958747575．5曩■|100o92790592．29209039079265CNX851168747575．50．0l_l927905922920903907926CNX8601711．6838964767．6■■87．48958938768859037OTN812410g11311510210213,8；■■88、0盯、88708749038CVS．119379．31008．78．311．3131l_|99089590．190．g9SAD．B19加359610289858．511613．31．8_甄38999071ⅡERA1110g12213111310．410413614．311．311．5l-l98．7893113aG121011512710610101251381061091．3l_|89．912PG13898．7g3817．87810．4g810011．510．9■_l13FMy'23456789101112132．4．7G基因的遗传系统树为了分析广西街毒与其它毒株在基于G基因的遗传进化上的关系，把G基因测序结果与收集到的已发表某些毒株核苷酸进行比较建立遗传进化树，结果见图25。可以看到，象基于N基因的遗传进化树一样，也可分为固定毒和街毒两个大的基本类群(CTN例外)。在街毒这一大类群内，三株广西毒株差异明显，分属于3个小的分支上，其中GXBM和宁夏的两株在一起，CGX89—1与CTN株在一起，119单独一支，说明广西各地毒株亲缘关系较远。图25G基因的遗传系统树 广西狂犬病野毒株刀和多基因的克隆与序列分析·南松剑一54表12所引用各狂犬病病毒株说明Table12Introductiontorabiesviruscitedinthisexperiment毒株来源有关情况PV美国1965年从全美动物传染病中心获得，源于路易·巴斯德株CVS美国国际标准攻击毒株，路易·巴斯德株的美洲分支ERA美国兽用疫苗株，SAD的派生株Flury美国1939年，分离自佐治亚州一被疯狗咬伤女孩脑SAD美国兽用疫苗株，1935年，美国阿拉巴马州犬脑PG(aG)中国北京固定毒株北京株CTN中国济南减毒固定毒株，1983年分离自中国济南一只疯犬3aG中国北京固定毒，中国人用疫苗株，来自于北京株CGX89-1中国广西野毒株89年分离自中国，‘西一条疯狗CNX8511中国宁夏野毒株，85年分离自被犬咬伤人脑组织CNX8601中国宁夏野毒株，86年分离自被犬咬伤人脑组织 彦商大孥硕士毕业i仑文箜三、讨论3．1病料来源及三个毒株的阳性鉴定本实验采集到的三份犬脑材料，分别来自广西南宁、隆安和巴马，编号为119、GXLA和GXBM。其中119是2000年本试验室采集到多份外观健康犬脑组织进行检测后，得到的一份阳性材料：GXLA是2003年1月份采集自一出现神经症状并连咬4人的犬：GXBM株是2003年3月份采集自一咬人犬，该犬当时未表现神经症状。本课题首先对三份犬脑组织进行了PCR检测，结果皆能扩增出特异性目的带：然后，将三份材料攻毒小白鼠，均出现神经症状，10～16天发病死亡，采集小鼠脑组织，重新用PCR鉴定，得到目的带，确定为狂犬病毒感染。实验中用到三对引物，RHNl／RHN2和RHN3／RHN4已经有报道【8”，两者均是根据比较狂犬病毒N基因或两端保守区域序列设计而成，前者扩增片段小，具有很好的敏感性和特异性，是理想的诊断引物，罗廷荣等曾用来配合其它引物进行Nested．PCR检测，发现能检测到O．8pg的病毒RNA[201，且不能扩增出其它弹状病毒科成员：后者可扩增出完整的病毒N基因，在本实验中经使用，对疫苗株和野毒株都非常好用，重复性好。GPI／GP2，在罗廷荣等提供的G1／G12基础上稍做改变，可以扩增出完整的G基因，由于G基因变异性较强且片段较大，需要很好的摸索反应体系和条件，实验中笔者对引物浓度、M92+浓度和退火温度都做了梯度摸索，发现反应体系浓度和退火温度对PCR的效率影响是非常大的。另外，RNA操作重要的是要防止RNA酶的污染问题，移液枪头和EP管消毒是致关重要的，对于RNA抽提的操作要非常小心，当保证材料中病毒RNA不受污染且含量较高的时候，扩增片段也较亮。3．2PCR产物的纯化和克隆PCR产物纯度和亮度对于保证连接的顺利成功是很重要的，本实验中用了胶回收试剂盒来进行PCR产物的回收和纯化，笔者在回收时，对于用在紫外线下切胶和在胶内加入亮兰避开紫外线进行直接切胶作了比较，发现后者更容易与载体进行连接；另外，回收产物的纯度对于连接的效率影响也是非常大的。本研究中用了TA克隆法来进行直接连接，原理是PCR产物在Taq酶的作用下，双螺旋分子3’末端会自动加上一个腺I瞟呤A，制备好的载体，在插入位点有一个3’T突出端。一般T载体都包含有M13正、反向引物位点，方便测序和鉴定。在实验中发现，TA克隆快速且效率高。感受态细胞比较脆弱，其活性是影响转化成功的关键，所以最好不要用存放太久的感受态细胞，转化 广赫社犬病野毒株筇和歹基因的克脊与序列分析·南松到堑过程中涉及感受态鳞魏静搽俸也要小·Ii,，翔热入连羧物，热休克等搽于#。当簿选自色菡落进行培养的时候，尽量防止污染其它杂菌，有利于抽提的质粒DNA纯度的提高。实验对三株野毒的N基因和冀中两株的G基因进行了克隆和序列分析，另外一株的G艇因正待克隆。3．3重组膜粒的鉴定本实验对重组质粒采煺了PCR和酶切疆靴鉴定方法，照RIYN3锺tHN4和GPl／GP2引物分别对N、G基因重组质粒进行PCR扩增得到了与连入的N、G基因大小相等的片段，泌鳃重缀矮粒为辍经。PCR方法比较方便、恢速，虽在PCR纹一t一次反应藏可鏊定多个克隆的质粒DNA。缀奁找鏊瓣冀‘段豹痰甥酶强港，发褒嚣熬藿西N、G鹭不含BamHI翻Pstl，所以本研究选用了BamHI和PstI进行酶切鉴定，浆定结果目的片段会增加28bp，i面PMDl8--I、j；iljl“琢来的2692bp缩短为2664bp豹载体大片段。酶切蘩定实验结采符合要求，这一结果再次说明目的艇因已克隆成功。3．4序列比较及同源性分析3，4．{N篓因疼联跑较及溺源经分耩以往的研究表明，狂犬病毒N基因高度保守且离效表达，因此常被用于RV的分类、诊辫和流行瘸学谲查吲。对119、GXBM、GXLA三袜的N灏因测序结采和PV、CVS、3aG、SADBl9、CTN铸毒株谶行了序列比较，核苷酸阍源性最低为84．9％，最高为990％。广西兰株之嗣比较同源性分剐为89．1％、89．4％、89．7％具有一定的差异性，比较发现，GXLA与CTN[431株核萤酸固源性高达95．O％，丽CTN是1983年分离the争嗣济南的一豫野毒，后经传代减弱固定下来，说明广西各地分离毒株亲缘关系相对来说是较远的。比较申还发现，N基因勰端交舅瞧较中耀更大，雄测鬟予毫变嚣。广两三株N基因均与3aG株存在较大的核苷酸和推定氨瀑酸同源性差异，推测广硼鹭毒撩可怒秘运离疫蕊株方离演纯。对三株狂犬病毒N基因相应氨基酸序列和其它鸯株进行比较后发现，变化比较明最鹣都能集t|{程90～140位之潮。各毒株之问氨基酸同源性远商于核：潆黻的嗣源一m盈{．i株坐f镯之间氨旗酸同源性分别为97．8％、97．8％、99．1％，说明序歹}j中核萤酸多为嗣义变异，表明N蛋白～级结构是很保守的。遗传树分析发现所比较各毒株，基本可以分为两个大嬲类群：固定毒_：}fl街毒，三株广程野毒株在一个瓣，CTN瞧属予露定毒，但分凌年 爱’再文擎疆土荜蓥i卺交翌代较近，在遗传糕上疆示帮GXLA索缘关系较迓，接测广蘧各地毒攥闻可熊存在较复杂的背景来源，这一点有待分离更多的毒株进行研究。【8342】3．4。28蒸因彦列跑较及瓣源性分梧G基因全长1575个bp，编码524个氨基酸，前19个属于信号肽，成熟蛋白包含505个氨麓酸，怒一静簿貘耱蛋囱，分为膜静区、跨膜送秘貘内区。禳搽以往的研究，G基因容踢变异，在狂犬病毒5个编码蛋白的基阑中是最不稳定的；但是，GP是唯-N激机体产生中和抗体的蛩臼，且与致病悭、嗜神经性有关，另外，GP还与血凝活性、细胞融合和免疫溶解有关[86-88l，所以国内外对其研究在狂犬病毒各蹑白中怒最多的，多集中在致病机理和新型疫苗的开发方面。将119和GXBM株G基围分别与收集到的国内门外发表器毒拣序列进嚣了比较分援，爨源牲最低的仅为82，7％。广嚣三栋野毒之越核替酸同源性则集中在86—87％左右，氨基酸同源性均略高于94％，具有明显的差异，’龅明野毒橡G基嚣靛交雾嬖妻较大，在猛犬瘸毒蚤开放阙读毽中是最容易交磐麓。足撩霞定毒之间核替酸同源性一般都达89．0％以上，高于好毒之间的比较。魄较发袋罄蠲瘦麓ERA株和两株广西辩毒G基困的棱营酸稆氨薅酸同源性均较低，前者分别为82．9％和83．1％，后者分别为90．5％和91％，人用疫苗3aG株和两株广骶野毒G基因核菅酸同源性分别为82．7％和82．9％，推导氨基酸同源性分别为88．O％和88．8％，也很低，两且同源性螺低予与CGX89，l的比较结果，艇以，有可能在免疫压力下，爨毒向远离疫苗毒方向演变，但魁既然重谣抗原位点上的氨基酸鼹示没大的变化，所以【兑明观j|l疫l钱株列j“l必”臻拣挺移《魄鼹护性还是缀好款。越传树分析发现，也可以分为固定毒和野毒两个大的基本类群，，“西三株在野谶类饕t争_!；{二分在3个支系上，巴马栋窝宁爱兹嚣掾秘31矮予一支，CGX89。l建窝CTN称在一起，l19单独属于一支。这些也一定程度上说明了广话各地毒株来源复杂，推测可能与广西餐照农村藩欢养犬，犬贸易频繁，另外广西遗签边境、圭氇理位置较复杂有关。N基因和G基因序列比较不同在于前者核瞢酸和推定氨綦酸同源性均比质者赢，另外，丽者推定氮基酸闻源性非常高，这与以往研究的两基因编码蛋自的各自特点相符合。3。5与抗原性和数病性捆关区段或位点的分毫蓐3．5．1N基因抗原性相关区段及Th细胞表位的分析过去震攀亮隆抗体分撰，N基邋掰编谒缀自包含三令鏊本瀚抗艨位点，N、N。Nm，N。、和Nm分别与374～383和313～337位氯基酸伸展有关。在N。上几个野毒株均来 广番器太藕野毒撼韶和多基国醇竞玲喜序魏分辑·南豁剑一58发生变异，只有3aG株的322和327分别被Ile和Ser取代；而在N，上，119的375位氨蘩酸被Met取代，而GXLA、GXBM和CTN三株的379位氨基酸被Leu取代，推测这些变化一定程度上会改变其抗原性。分析可以看到，所蠢毒拣389位磷酸化位媾4镰均没有改变，都为Ser，也说明了N旗因的桐对保守性。有研究报道，394、一408、404—418秘2l～35位氨基酸楚辕助瞧T漤巴缨照疆h)熬主要裘霞，鼙霹强在转交诱蟹产釜特异缝Th细胞，也可产生体外免疫反应，对鼠具有～定的保护作用【851。比较这些区段氨基酸发理，只有3aG拣瓣23整瓣Ala、401使嚣Oly、407位弱Ala荦彗PV株静410位的lle与其它毒株不同，几株野毒株没有变化，3aG株产生3个不同的氨基酸，可能一定程度上会影响囊箕缁穗凳痰作薅和裁激瓿{奉产生中移抗{奉的能力。3．5．2与G基因抗原性和数病性相关区段或位点的分析G基闲全长524个氨纂酸，楚病毒与细胞受体结合的结构，能够唯一刺激机体产生巾国／抗体，破：狂犬病毒致病和免疫方西都起罄重要的作用。N端i9个氨基骥残基是信号胎，其有疏水性，可以其实新生蛋白质穿过粮面内质网。成熟的GP共包含505个氨丛酸残基。比较发现，不嗣毒拣糖基纯位点数冀积位鼹不一群，逆较务毒栋均具有37、3t9位糖鉴化位点，且119株和GXBM株仅有这两个糖基化位点，一定的糖攀化有利于病毒蛋囟翁表达。已经证实的GP抗原位点主要有3个，Gt、G。G。，GⅢ是主要的抗原位点，位于300-．357区段，G2大约位予34-200区段，GIf至少包含两个主要的抗原表倪：34．42和198-200I爱段。比较巾发现，决定抗原性的各主要抗原表位如34—42、147、184、198．,200、330-340和357等在各野毒椿上几乎都没有发生改变，仅GXBM株在332位上被I取代，表明两株广两野毒株抗原性变化不明显，但也有研究认为熏要抗原位点上一个氮基羧黩改变就可以澎咖到其抗原性的变化，所以仍认为现用疫苗对广西野撵提供的保护性是很好龅。狂犬病毒具有高度的嗜神经性，研究表明，狂犬病毒在机体内的细胞受体是乙酰胆碱受体(AchR)，与缀合襻缀受俸秘关魏嚣毅集中褒189．-214位‘叛90l，经分祈与享}|l经毒素的30-56区段(㈣0JOCDG～FCSRGKRIDLGCAATCPKVKP鱼)$葛度丽潦，神经海素上主要静嗜神经谊点如3l、33、37、38、39等与狂犬瘸毒相关位点Aspl90、Rhel92、Argl96、Glyl97和Lysl98等的氨基黢完全⋯致，浇删j。豫分离毒株有着较强的嗜神经性，这点从小岛鼠攻簿结果可着的出来。 震商炎举硕士毕业论文59矫究中笈现与致病毪翱关靛重螫位点‘”l如333镣氨基酸仅CTN栋为Gin、Flury拣为Gly而两者都是减弱固定毒，其它均为Ar9333；Lys330、11e338等致病相关位点均没有改变，谎鞠分离到的几株广谣野毒均属于强毒株；普用疫菌株ERA株和SADBi9来自同⋯毒株，但后者是弱毒株，在此几个位点氨基酸相同，说明存在其它与毒力相关的结构。 广西狂犬病野毒株刀和步基因的克隆与序到分析‘南松剑一60四．结论1．本实验收集到的三株狂犬病毒野毒株，分别来自广西的三个不同地方；一株来自外观健康犬，两只来自咬人狂犬，经RT-PCR检测和小白鼠攻毒实验，证实皆为阳性。2．实验中对三个毒株的N基因和其中的2个的G基因进行了扩增、克隆和鉴定，确定得到了五份阳性克隆。3．对N基因进行了序列对比、同源性和系统树分析，广西流行毒与其他固定毒之间核苷酸同源性差异明显，N基因推定氨基酸同源性较高，说明N基因核甘酸同义变异较多，NP一级结构较为保守；系统树分析显示分为固定毒和街毒两个基本类群，广西三株野毒被分为一群。4．对G基因进行了序列对比、同源性和系统树分析，两株野毒株之间核苷酸和推定氨基酸均有一定的差异，说明广西区内存在亲缘关系较远的毒株；与两个疫苗株ERA和3aG株相比较，核苷酸和推定氨基酸同源性均较低，但既然重要抗原位点上的氨基酸变化不明显，说明现用疫苗对广西野毒株提供的保护性还是很好的；系统树分析显示也被归于街毒和固定毒两个基本类群，广西三株野毒来源背景较复杂。5．N基因上重要的抗原位点在三株野毒均发生了变化，Th细胞表位没有变化，磷酸化位点Ser389在各毒株中均相同。6．G基因主要抗原位点没有发生变化，119和GXBMG基因推定氨基酸上均包含37和319两个糖基化位点，与致病性相关位点及嗜神经位点上的氨基酸均无改变。 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震．西大学硕士毕业抡文6Aunabletoinfectmotoneuronsinvivoandinvitro．JVir01，1998，72：273[34]Epidemiologicandhistoricalrelationshipsamong87rabiesvirusisolatesasdeterminedbylimitedsequenceanalysis．JInfectDiS1992Aug：166(2)：296—307[35]AraiYT，YamadaK，KameokaYeta1．NucleoproteingeneanalysisoffixedandstreetrabiesVirusvariantsUSingRT—PCR．ArchViro1997．142：1787—1796[：56]Sacramento，D．，Bourhy，II．＆Tordo，N．PCRtechniqueasanalternativemethodfordiagnosiSandtooleeularepidemiologyofrabiesvirus．MolCelIProbes1991，5：229—240[37]Nadin—Dayis，S．A．，Casey，G．A．＆Wandeler，A．IdentifcationofregionalvariantSoftherabiesviruswithintheCanadianprovinceofOntari0JournalofGeneralVir0109y199374，：829—837．[：58]n／arnel’cK，SchurrTG．FacadeM．Molecularcharacterizationofcarrielrabiesiso[aresVirusRes1996．4l：133—140．[39]钱爱尔侯世宽何昭阳等中国不同来源狂犬病病毒野毒株G基因主要功能区的序列分析病毒学报1998，14(3)：262—268[40]钱爱东侯1{；I=宽张茂林等狂犬病无毒疫苗株SRV9G基因主要功能区的序列分析中国畜禽传染病1997．19(6)：20—25[41]徐葛林LiKu吴杰等中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析病毒学报2002，18(1)：48—5l[d2]脚青，L订lianAorciari，CharlesERupprecht等我国四株狂犬病毒糖货白基闪序列分析Jfll化，_比较l{I囤螨i妊学2000．15(1)：22—33[4：{]占漓=F树声广‘西狂犬病病毒野毒株的分子流行病学分析中华实验和临床病毒学杂志2001，15(4)：335—339[44]景怀奇摘泽1998年美国国家公共卫生兽医学会(NASPHV)关丁动物狂犬病控制纲要删wR1998，47(RR一9)[45]StohrkMelslionFx，OralVaccinationofwildlifeinEurope：successandsetbacksoverthelastFifteenyearsInthirdInternationalSysnposiumonRabiesCotrolWuhanChiaaSepl5一15。1996俞永新人和动物狂犬病防治研究进展中国人兽共患病杂志1998．14(4)：5660张德礼朱关榀狂犬病新型疫苗的研究动向农牧产品开发1994，1：43—44WunnerWtl，DietzscholdB，CutisPJ，etalMoleculargeneticsofplantsandanimalS，1983，20：467—478 ——一．￡兰兰苎壹墅±竺!塑笙墨望竺查!兰查型!：翌：竺竺竺～64【49]PrehaudC，FlamandA，CoulonPetalInvasionoftheperiplleralnervoussvstemof8d“lt“icebytheCVSstrainofrabiesvirusanditsavirulentderivative^v01／盯，口，1989．63：3550—54[50JMorimotoK，Niy-j，KawaiASyncytiumformationisinducedinthemurine“。“。obl8stomacellcultureswhichproducepathogenictypeGproteinsoftherabiesVirus．Virology1992，189：203—216[51JA。‘oisM，MassonE，BarratJeta1．EfficacyofthreeOralRabiesvaccinebaits1“。h。redfox-^comparisonVet．Microbi01．，1993，38(1—2)，】67—172．[52jPintoRM，BoschA，Bish。pDH．Structuresassociatedwiththeexpressi。nofrabies”1。“88‘。“。t“。algenesininsectcollsVirusRes，1994，31(1)：139一145[533Ki。“yMP，LatheR，DrillientR，eta1．Expressi。n。frabiesvirusglyc。一口r。teinfromarecombinantvacciniavirus．Nature1984，312L：163一】69[54]Tayl。rJ，TrimarchiC，WeinbergR，eta1．EfficacysttIdJI、srecombinantvirus．Vaccine1991，9(3)：190—193．[553E8posit。，J·J·，Knight，J．c．，Shaddock，J．11．eta1．Successful。I．alrabieswmcinationof。8。oo“swithracoonpoxvirusrecombinantsexpressingrabiosviru8glycoprotein．Virology1988，165：313—316[561DeMartinilJc，Bickl。J{M·Br。die，SJ，etalRacc。。np。xvirusrnhlLjjvirus91yc。Dr。teln。。。o⋯binantvaccineinsheep．ArchVirol1993，133(1-2)：211—222[57]1'“y】。’，J·，R·weinberg，B．Langueteta1．RecombinanLfowlp。xvirLlsjnducingprotective1”⋯“nityinnon—avianspecies．Vaccine1988，6(6)：497—503，[58]T8yl。。，J·Meignier，B．Tartaglia，J．eta1．Bi。1。gicalandimmun。genicpr。Dertiesol8。8“8’yp。。一rabj。5。ecombinant，ALVAC-RG(vCP65)innon～avianspeciesvaccin。1995，13(6)：539—549[593WolffJAMal。neRwWilliamsPeta1．Directgenetransferint。m。usemuscleinvivoScionce．1990，247(4949Pt1)：1465—1468[60lo[vos,I⋯IJ”‘，urgc，iJ．，xi}lng，z．Q．。L}i【．GlyCosyl}lLi()11()I-HyllLIluljc【'11cIfH，Icell。pltopi。p。ptid。8influencestheirantigenicpotencyandconformationinas“98。lo。8tio“一8pecificmanner．Biochim．Biophys．Acta1994，1224：68—76．[61]xi8119，zQ·，spitalnikSL，ChengJ，eta1．IⅢmuneresp。nsest。nucleicacidvaccinestoRabiesvirus．Virol1995．209：569—579 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广两狂犬病野毒株澎和乒基姆砖克玲暑蓐列分辑·南松刹一66———————————————————————————————————————_——————_————————_—————————————————_——————一———————————一[77]李文辉张云隋建华等狂犬病毒糖蛋白基因重组腺瘸毒与同～抗原核艘疫茁的联合免痰研究中牮微生纫学和免疫学杂志2002，22(4)：403—406[78]麝青赵秀芹陶晓绶中国人间狂犬满流行瘸学近况分{!圩中华流行病学杂志2001，22(1)：8-10[79]曼秀玲扬小凑曼泰才等不躺类型绞赋狂犬瘸魅涮疾瘸控刳杂意2000，4(2)：109—110[80]章玲珠杨进业1996-2000年广。两狂犬病流行痫学调查分析广两预防医学2001，7(4)：2lO一212[81]NaotoI．，MakotoS．，andKanisak0．eta1．MdecularepigemiologyofrabiesinThailandⅪicr曲ial，immonol。1999。43(6)：551—559[82]闩宪鹤_i漓王树声等中国广西狂犬病毒野毒株(CGX89--互株)糖蛋自基闪核酸序列测定年11分析中华微生物学和免疫学杂忠1994，14(1)：10-15[8：{]}1i溯：E树声C．A。DeMatosC。C．等广嬲狂犬瓣病毒9}谢株嬲分。1漉{j病学分析中华实验和临床瘸毒学杂志2001(15)4：335—338[843SokolF，ClarkHF，WiktorTJ，eta1．StructuralphosphoproteinsassoseiatedwithtenRhabdovirusesJGenVirol1974，24：433[85】eelisE．Rabiesvirus—specificTcellhybridomas：identificatioofclassIIMc}卜restritedTeellepitopesusingsyntheticpeptides，Hybridoma，1989，8：263．[86]CoxJ．It．．DietzscholdB．andSchneiderL．G．Rabiesvirusglycopi·oteinlI．．Biologicalandserologicalcharacferization．Infect．1mmun．1997．16：754—759C87]Gaudin￥．，RuigrokR．w．I{．andKnossowM．f_ow-PtteonformationaichangesofRabiesvirus鲫ycoproteinandtheirroteinmembranefusionJ，virot，1993；67：1365—1372[88]MORIMOTOk，，Niy-J．andKawaiA．SyncytiumformationisinducedinthemurineneuroblastomaeellcultureswhichproducepathogeneictypeGproteinsoftherabiesvirusVirology1992，189：203—216Is9]BearG疆SchaddockJ珏，OuirionR，etaI+Rabiessusceptibilityandacetylcholinereceptor．Lancet1990，335：664C90】LentzTL．，WilsonPT，IIawrotE，eta1．AminoacidsequencesimilaritybetweenrabiesVirusglycoproteinandsnakevenomcuraremimeticneurotoxins．Science,1984，226：817[91]CoutonP，‘rernauxJp，FlamandA，etai。Anavirulentmutantofr8biesvir“sis 瘳t西文警硕±挚韭论文竺unabletoinfectmotoneuronsin￥ivoandinvitro。jVirol，1998，72：273 广西狂天病野毒株刀和多基园曲克隆与序列分精·南松剖一6S致谢值此论文完成之际，我首先要衷心感谢导师余克伦教投和罗廷荣教授在我三年求学生涯中给我的关心和指导，两位导师渊博的学识、丰富的实践经验、严谨的治学态度．宽厚仁慈的为人、以及对学生严格的要求都将使我终身受益。导师在我论文的选题、课题的避展和论文的撰写过程自始至终给予悉心的关怀和指导。三年的耕耘和收获无不凝聚着导师辛勤的汗水。三年采，传染病室陆芹章，黄伟坚，到芳、秦爱珍，温荣辉等老师给予了热心的帮助和支持．使我在学习和实验技能上得到很大的提高，在此对他表示诚挚的谢意。在此论文完成的过程中．还得到了同实验室吴显实，廖素环、陈义祥、韦友传，潘艳，冯励，熊毅等同学的鼎力相助，没有他们的帮助．这篇论文不可能顺利完成，我要对他们表示衷心的感谢。同时也感谢预防兽医学其他同学对我学习上的关心和生活上的照顾。幕后，我衷心感谢研究生处各位领导，老师及动科院所有的领导老师在我三年的学习和生活中给予的关心和支持。该研究为国家教育部“留学回国人员科研启动基金”资助项目。教外司留[1998]679号。