猪伪狂犬病毒（prv）糖蛋白gd基因植物转化和表达的研究

《猪伪狂犬病毒（prv）糖蛋白gd基因植物转化和表达的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

摘要本文以模式植物烟草为对象，研究了猪伪狂犬病病毒(PseudorabiesVims，PRV)糖蛋白gD基因在转基因植物中的表达。并在此基础上，以PRV糖蛋白gD基因和玉米胚乳特异表达启动子(GiobIlIin．I)构建的重组质粒pGLB-gD为载体，应用农杆菌介导法转化超甜玉米幼胚，成功获得了转基因植株；同时研究了根癌农杆菌浓度、共培养时间与温度对玉米转化率的影响。主要研究结果如下：1．利用叶圆片法，通过根癌农杆菌介导将PRV糖蛋白gD基因导入烟草叶肉细胞，经愈伤组织诱导、筛选、继代及再生，成功获得了再生植株。通过PCR分子标记、PcR．SoU【也em分子杂交确认gD基因已整合进烟草再生植株细胞的基因组中，经wbst啪一blotting杂交证明外源的PRv糖蛋白gD基因能在转基因烟草中正确表达。2．在26～28℃条件下，分别以0．3、O．6、1．O的菌液浓度(OD6∞值)浸染玉米幼胚5Inin，然后在22℃下进行共培养、恢复性培养和抗性愈伤组织筛选等过程，发现原菌液浓度在0D600值为O．5，感染浓度在O．3时，转化效率最高，抗性愈伤组织的形成率为23．7％。3．在原菌液浓度和感染浓度分别为OD600值0．5和013时。以22℃、25℃和28℃3个温度分别进行1d、2d和3d时间的共培养，分别统计幼胚抗性愈伤组织的形成率，结果显示，在22℃共培养3d的条件下转化效率最高，抗性愈伤组织的幼胚的形成率为24．6％。4．由根癌农杆菌转化玉米幼胚获得的转基因玉米植株，经分子鉴定、点杂交、Southem印迹杂交，确认PRV糖蛋白gD基因成功整合进玉米植株细胞的基因组中。关键词：烟草；超甜玉米；农杆菌；PCR检测：PcR_soutll锄杂交；wbstem杂交：点杂交；Soulllem印迹杂交 AbstractTakjngtobaccoasmetypeplant，thepresentthesisstudies血eexpressionofpseudorabiesvirus(PRV)glyc叩roteingDgeneintraIlsgeilicplantsandsetsupasetofmethodsforplallttr孤sfonnin岛transgenicplamscreemn＆】eafprote砸extractingandotherS；allthesemethodsh“elaidthegroundworkfortransgenicmaize．0nsuchabasiswetransformhyper-sweetmaizeimmatureembryowiththepGLB—gDplaSmidwhichwas叭1tbypGLBpla锄id，Globul¨promoterandPRV出ycoproteingDgenethoughmemediationofAgrobacteriumtumefaciens卸dsuccess删lyobtainthemmsgenjcp】a工lts，Thein丑uenceofAgrobact“umnunefaciensdenSity，t11e1eng血ofco—cul“Vationpefioda11dtempemtureonmmsfonnationratehasbeenstudiediIltheexperimem．Thefindingsoftheexperimemalstudyareasfollows：1．Bymeansof1eaf-disc廿卸sfomationme也od，tobaccoistransformedbyAgrobacteriumt啪ef-aciens，success如Ilyinducingca工ius；thecailusthrou曲secondarycuItivation静owsintoanindependentplanLPCRd或ection，PCR—sollthernhy城dizationandWestem坶蹦dizalionallprove恤tPIⅣ西ycoproteingDgenehasbeenintegratedintothetobaccogenomeandexpressedin也eri曲tway；thjsshowsthatPRVglycoproteingDgenecanberightlyexpressediIlplaIlts．2．Whenthetemperattlrestaysbetween26℃to28℃a11dtheOD600valueofthebact丽umsolutionarerespectjVelyO，3，O．6a11d1．O，themaizeimmatureembryoafter5minutesinfectionuIldergoesco—cultiVation，restorativecultiVationarldresistalltcalIusscreenjngat22℃．nisfoundt11at廿1emmsfornlationrateisthehighestandfomulationrateOfresistantcallusreaches23．7％、vhentheOD600Valueofmeoriginalbacteri啪solutionisO．5andinfectiondensityis0．3．3．The0D600ValuefororiginalbacteriumsolutiondensityandinfectiondensitybeingO．5and03，theresistantcaIlusfonnulationratcofimmatureembryoisbe洫gstudi。datt11etemperatllreof22℃，25℃and28℃forone，twoandthreedayseach．ht啪souttllatthetmsfonnationemciencyrategoeshighestat22℃forthreedays、vitlla24．6％f0咖ulationrateofresistantcallus．4．TransgenicmaizeplantSareobtainedwi也maizeimmatureembryothrought11emediatbnofAgmbacteriumtuIllef如iens．AninvestigationofthetransgenicmaizeⅡlolcculesthroughdothy晡dizationa11dSou也emblothy确di列ionguarallteesus血efactthatPRvglycoproteingDgenehasbeensuccessmllyincorporatedintotllemaizegenome．TT Keywords：TbbaccO；Hyper-swectmaizc；Agroba咖ri啪t嘲ef．aci吼s；PCRdetection；PCR-soumemhybridization；We咖nhybridi枷on；dothy晰di蒯on；SoumemblothybridizationIII AmpbpCTABdNTPdDTTEBEDTAhHRPIPTGkbkDKmLBMmlnPAGEPBSPCRPEGPMSFPRvPVPRNaser，mln缩略语amplicillinbaSepairhexadecyltrimethylmnnlolli唧b1_omiddeoxyIlucle勰ide埘phosphacedaydimiotllrit01廿lidiumbromidcetllylenedialllineⅡaceticacidhollrhorseradishperoxid骶eisopropyItllio—p—D-galactosidekilobaselilodaltonkanamycinhmabrommolepcrli姗minutepoIyacryI锄idegelel咖p：horesisphosphate-b1】蝈‰dsalinepol肿erasechainre删蚰polyetllyleneglycolphenylmethylsufbnylnuoridepseudordbiesbimspolyvinylp”olidoneribonuleasereVolutionsperminuterV氨苄青霉素碱基对溴化十六烷基三甲基胺脱氧三磷酸核苷天二硫苏糖醇溴化乙啶乙二胺四乙小时辣根过氧化物酶异丙基硫代．B．D半乳糖苷千碱基千道尔顿卡那霉素L嘣a肉汤培养基摩尔每升分钟聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链反应聚乙二醇苯甲基磺酰氟伪狂犬病病毒聚乙稀吡咯烷酮核糖核酸酶每分钟转数 SDSSpTBSTE1_risUTAEBSADABABANCsodiumdodecylsulfjtespectlnomycmTris_buff色redsaline1Hs／EDTAbu航rTris(hydroxymetllyI)一盯ninomethalleunitet“s·Cl，acetate，EDTAbufrerbovineserumaIbumindiaminobeIlzidineabscisicacidm仃ocelluloseV十二烷基磺酸钠壮观霉素Tris．缓冲盐溶液Tris／EDl’A缓冲液三羟甲基氨基甲烷酶活力单位tris．乙酸缓冲液牛血清白蛋白二氨基联苯胺脱落酸硝酸纤维素 前言1前言‘长期以来，研究者一直致力于利用分子生物学技术改良植物(特别是农作物)的性状，以满足人们的多种需要，如希望创造出优质高产、抗病虫、抗除草剂、抗旱、耐盐碱等优良性状的农作物，或者利用植物作为生物反应器生产药用餐白等【”。近年来，随着植物转基因技术的不断发展，其目标在逐步地实现。植物转基因技术是指通过体外重组DNA技术将外源基因转入到植物的细胞或组织中，从而使再生植株获得新的遗传特性。转基因技术可将任何来源的基因转入植物，这不仅扩大了重要农艺性状相关基因的来源，而且可以打破种问基【型交流的界限；这对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义[1】a迄今，通过植物转基因技术，人们不仅培育出了许多具有优良性状的植物新品种，而且还利用植物生物反应器生产出多种药用蛋白。1．1植物的遗传转化方法及特点植物基因工程研究的关键是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内，使之发生定向、永久性的遗传变异，即所谓的檀物遗传转化(geneticⅡ∞sfollllation)吵为了方便有效地将外源基因导入植物体内，人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前发展较为成熟的有DNA直接转化法和介导法等方法。DNA直接转化技术包括化学方法和物理方法，如基因枪法、电击法、PEG法、花粉管通道法、微注射法、激光法等，介导法主要有农杆菌介导法、病毒介导法等；其中农杆菌介导法和基因枪法是较为有效的两种方法吼1．1．1DNA直接转化法1．1．1．1基因枪转化法基因枪转化法(paniclegun)又称微弹轰击法(micm-projectilebombardment；particlebombardment；bi01isncs)，是一种DNA直接转化技术。其原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，在高压作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，从而实现基因转化。该技术是1987年由美国康杂尔大学的sanfbrd等人发明的一种基因直接导入法。KIein等在1987年首次以此方法把外源DNA导入洋葱表皮细胞，且观察到外源基因能表达，证明 刖鬲此方法是可行的【2J。1988年，McCabe等用外源DNA包被的钨粒对大豆茎尖分生组织进行轰击，结果约有2％的组织通过器官发生途径获得再生植株，并且在‰、R1代植株中检测到了外源基因的表达％1990年Gordon—Kamm等用基因枪法将gus报道基因和pat选择性基因导入玉米悬浮细胞系，且再生的转基因玉米植株熊够结实，首次获得转基因玉米鸭另外，Hadi等用12个质粒、sinunonds等用两个质粒分别轰击大豆未成熟子叶，经抗性筛选和southem杂交检测确认获得阳性克隆和再生植株酗】。由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程，因此它具有以下多种优点；(1)不用原生质体再生培养；(2)受体材料来源广泛，不受基因型限制；(3)缩短了获得转基因植株的周期；(4)获得的转基因植株变异率低，通常具有正常的育性等【”。特别是在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的应用。但是基因枪法也有自身的缺点，如转化效率不高，大多在O．1～1．O％的范围内，难以选择；外源基因序列常是多拷贝插入，因而容易导致基因沉默；转入的基因有时是呈非盂德尔遗传：费用较高等18】。1．1．1．2聚乙二醇法聚乙二醇法(polyethyleneglyc01，PEG)是一种通过化学物质PEG处理去细胞壁的原生质体，改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化的方法。鼬ens等首次通过此法转化烟草获得成功【9】。此后在双子叶和单子叶植物如烟草、矮牵牛、水稻、玉米等作物上都获得了成功ff⋯。由于PEG法具有实验成本低廉、结果也较稳定、重复性好、无需特殊的仪器设备等特点，因而在发明起初也成为应用较为广泛的方法。但是此法具有明显的缺点：原生质体培养再生难度较大；受转化受体的基因型限制；原生质体再生培养的转化植株变异率高，易产生白化苗；转化率低峭J。目前，该种转化方法在植物中很少采用。1．1．1．3显微注射法显微注射法(micm埘ection)是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中，通过组织培养最终获得转化植株。如1987年Neuhaur等用油菜(Br日ssfcⅡn印榔L．)花粉起源的12细胞期的体细胞胚注射NPTIT基因的DNA，获得转基因植株的频率高达27％～5l％㈣。此项技术起初主要应用于动物，八十年代中期开始应用于植物的遗传转化。1989年刘博林等用微注射法将Atrazine抗性基因向大豆叶绿体中转移，获得转基因抗性再生植株㈦。虽然该法具有DNA注射的准确性、可预见性、克服远源杂交的困难等优点，但其又有工作效率低、表达不稳定等缺点，故其应用受到了限制‘B】。自基因枪法诞生以来，这种转化方法在植物上的应用走入了低谷。2 Hq鬲1．1．1．4电激法及激光法电激法(electroporation)是八十年代初发展起来的一种转化技术，其主要原理是利用高压脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。李宝健等人在1985年首次将这种方法用于植物细胞的基因转化，并用此法获得了水稻转基因植株¨41。之后，又有研究者运用此法将cAT基因(氯霉素乙酰转移酶基因)转移到烟草、胡萝h、玉米等植物的原生质体中并得以表达【131。激光法同电激法类似，一定波长的激光聚焦后直径达0．3～0．5微米时，高能量的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔，短时问内又可自动修复，因而可利用激光束将外源DNA导入到细胞中。weber等利用此法将荧光素酶基因导入油菜叶绿体中㈣，Toper转化烟草【16】、中国的傅荣昭等转化小麦均获得成功‘17】。激光法和电击法均可用于双子叶植物和单子叶植物，转化受体材料广泛。由于这种方法的转化效率低、使用范围小、存在问题较多，因而其发展缓慢。1．1．1．5花粉管通道法花粉管通道法(pollen—tubepath、vay)又称子房注射法(overyinjection)，是利用花粉管通道导入外源DNA的技术，其主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备讵常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞f181。这是一种在整体植株水平上的转化方法，可使外源基因转移的操作直接在栽培作物上进行，免除了细胞和组织培养程序，并可直接获得转化的种子，开创了整株活体基因转化的新途径。Luo等报道了用花粉管通道法将含p35s．NptII．Hist3的质粒DNA转入藤坂五号水稻品种中，分子杂交检测证实了外源DNA已整合到水稻基因组中㈣。谢道昕等将两个Bt杀虫基因分别构建在植物表达载体Pbil21．2和GA643上，通过花粉管途径，将这两种杀虫基因导入我国棉花品种中，获得转基因植株‘19l。此外，刘德璞等用此方法也获得抗sMv的大豆转基因植株【20l；徐香玲等将几丁质酶基因转入大豆栽培品种中获得再生植株，斑点分子杂交证明了几丁质酶基因已转入大豆中口”。1．1．．1．6荚他直接转化方法除上述一些主要的直接转化方法外，还有脂质体法、离子束介导法、超声波介导法、萌发种子的电泳法和种子浸泡法等。它们各有其优缺点及适用范围，对于特定的受体材料需用特定的方法。例如，Deshayes等用脂质体介导法将NPTII基因转化烟草叶肉原生质体m】；程各久等用Ar+注入将比克氏棉和红麻的DNA导入泗棉2号【23】；许宁等利用超声波3 删吾的空化作用诱导小麦幼胚获得外源基因转移1241。1．1．2介导法1．1．2．1病毒介导法病毒具有感染寄主细胞并在寄主细胞内进行复制和表达自己基因的能力，因此可以作为基因工程的载体。常见植物基因工程的病毒载体有：单链RNA病毒(如，雀麦花叶病毒Bromemosaicvims．BMv)，单链DNA病毒(如，双子座病毒组Geminivimses)，双链DNA病毒(如，花椰菜叶纹病毒(Caulmowermasaicvims，CaMv)等【22】。可作为载体的植物病毒主要是CaMV(即花椰菜叶纹病毒CaucifIowermosaicvims)⋯。外源基因可插入到与CaMV活性无关的区域，随后此基因在CaMv感染的植株中表达，从而获得转基因植物口”。1．1．2．2农杆菌介导法(Agrobacterium．mediated)农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，主要有根癌农杆菌(A．t啪ef缸iens)和发根农杆菌(A．rhizogenes)，它们在自然情况下可以通过伤口侵染植物，导致受伤部位产生冠瘿瘤或毛发根。根癌农杆菌含有肿瘤诱导质粒(Ti)，Ti质粒上包含可转移DNA(T-DNA)区、毒性区(Ⅵr区)、结合转移区(con区)和复制起始区(ori区)4部分【”。其中与冠瘿瘤生成有关的是vir区和T-DNA。T-DNA区在农杆菌侵染植物时可以插入植物基因组中，使其携带的基因在植物中表达。Vir区用于编码T_DNA加工、转移及整合的功能蛋白，协助T-DNA整合进宿主基因组中。当植物受到伤害分泌含有酚类化合物的汁液时，这些酚类化合物诱使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于细胞表面，随后经过蛋白磷酸化、去磷酸化、DNA剪切及转运等一系列反应过程，T-DNA最后插入宿主细胞并以单或多拷贝的形式随机整合到核染色体上，完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程㈤。研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区，而且在TIDNA的同源区与D小认的高度重复区，T-DNA的整合频率也比较高【2“。农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于一种纯生物学的方法，与其它转化方法相比具有明显的优点：(1)转化频率高：(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1～3个，表达效果好，稳定遗传，多数符合孟德尔遗传规律；(4)农杆菌转化方法使用的技术、仪器简单【27j。由于上d 前言述优点，这种方法成为目自口应用最广泛的转化方法。1．2转基因植物研究现状1．2．1转抗虫基因植物虫害一直是全世界范围内制约作物高产、稳产的一个重要因素。使用农药等方法防治害虫虽然效果显著，但是农药杀虫剂的大面积使用既破坏了害虫和天敌之间的生态平衡又给环境造成了严重污染。因此，培育抗性品种，己成为害虫综合防治计划的最佳选择。目前，植物抗虫基因工程中使用的抗虫基因主要有两大类，一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，另一类是从植物中分离出来的抗虫基因口81。1．2．1．1来源于微生物的抗虫基因Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillustllmingiensis，Bt)晶体蛋白基因的简称。出于Bt在芽孢形成时产生的晶体蛋白具杀虫活性，故称其为“杀虫晶体蛋白(msecticidalcrystalpmteins，ICPs)”或“6一内毒素(6一endotoxin)”【2“。Bt杀虫晶体蛋白具有高效的杀虫活性，对哺乳动物、鸟类、鱼类和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染，具有良好的应用前景。1987年，美国Agrocetus公司利用农杆菌Ti质粒首次将Bt一内毒素基因转入商品棉，育成对鳞翅目幼虫抗性稳定的转基因棉‘捌。之后，抗虫转基因工程迅速发展起来。到目前为止，Bt一内毒素基因己成功转入水稻、棉花、玉米、大豆、马铃薯、番茄、烟草、苹果、唐棣、核桃、杨树、蚕豆、白三叶、菊花、酸果等植物中‘30出】，其中前11种已转入大田试验，有的已开始大面积种植。例如，1996年美国MonsaIlto公司研制培育的转Bt基因抗虫棉，具有抗棉铃虫、红铃虫及烟草夜蛾幼虫的能力，已在美国大规模种植。我国科学工作者在这方面亦作了努力，1991年中科院遗传所将修饰后的Bt基因导入棉花，获无抗虫性的工程植株；为提高其表达量，依照植物偏爱密码子的原则，人工全序合成了Bt杀虫蛋白基因，并于1993年导入我国棉花主栽品种，获高抗棉铃虫的转基因抗虫棉【431。迄今为止我国已培育了转Bt基因的中棉29、中棉30、中棉38、晋棉7、晋棉26等【45】。异戊烯基转移酶(ipt)是细胞分裂素合成中的关键酶。来源于农杆菌的ipt基因在烟草、番茄中表达后，可减少烟草夜蛾对叶片的损伤，并降低桃蚜的生存力㈨。然而，ipt基因的表达对植物发育有负面影响，如使根系发育不完全，降低叶绿素含量等；因此，如何兴其利除其弊，应成为研究者今后研究的重点。5 |Jq鬲胆固醇氧化酶基因，来源于链霉菌类，对棉铃象甲幼虫有极高的毒性，并能延缓美洲烟草夜蛾的生长。研究表明，胆固醇氧化酶的作用机理在于破坏昆虫中肠膜的完整性，最终导致细胞裂解死亡，因此，将胆固醇氧化酶基因转入作物中对昆虫也有很好的抗虫潜力【47I。1．2．1．2来源于高等植物的抗虫基因蛋白酶抑制剂(pmteininhibitor，PI)是对蛋白酶有抑制活性的一种小分子蛋白质，它能抑制昆虫或动物消化系统中蛋白酶的活性，是植物对付昆虫及病原体侵袭的一种天然防御体系。自1987年首次将豌豆蛋白酶抑制剂(Cowpea哪psinInllibitor，CpTI)基因转入烟草并获得抗虫植株以来，转PI基因获得抗虫转基因作物的研究取得了很大的进展【4”。目前至少有14种蛋白酶抑制剂基因转入作物中，其中大部分工作集中在来源于豆科、茄科和禾本科的Ser蛋白酶抑制剂，这种抑制剂主要对鳞翅目昆虫起作用，同时也对某些鞘翅类、直翅类害虫起作用。现在发现活性最强的一种是豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)，它是一种Ser蛋白酶抑制剂，具有抗虫谱，。、对人畜无害、害虫不易产生抗性等特点14引。实验表明，CpTI对大部分鳞翅类和鞘翅类起作用【49】。例如，在加利福尼亚田间试验成功的cpTI转基因烟草可导致棉铃虫幼虫极高的死亡率。我国郝贵霞、朱桢等也进行了CpTI转化毛白杨的研究【5⋯。到目前为止，cpTI基因已被转入至少lO种植物中。尽管在蛋白酶抑制剂的研究方面已取得显著进展，但遗憾的是至今未见有一种转蛋白酶抑制剂基因的植物投入商业化种植。植物凝集素是一类糖结合蛋白，也是植物防御系统的一个组成部分。凝集素抗虫的作用机制可能是在昆虫肠腔部位与糖蛋白结合，降低膜透性，从而影响营养物质的正常吸收；同时诱发病灶，促进消化道内细菌繁殖，使昆虫得病或引起拒食、生长停滞甚至死亡㈤521。目前成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有：雪花莲凝集素(GNA)基因、豌豆凝集素(P．Lec)基因、麦胚凝集素(wGA)基因、半夏凝集素(Prr、A)基因。1997年Gatehouse等将GNA基因转入马铃薯，发现GNA可延缓马铃薯桃蚜的发育期，降低其生殖力，抑制其种群生长【5⋯。我国周岩等用GNA基因转化烟草，其抗蚜活性强，平均抑制桃蚜45％～60％的虫口密度【5”，梁辉等用基因枪法将GNA基因转化豫麦66，成功获得转基因植株，转基因植株对麦长管蚜和禾谷缢管蚜的进食均起到明显的抑制作用【551。到目前为止，GNA基因己被转入9种作物中，包括马铃薯，番茄，烟草等【5”。几丁质酶是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白质，催化真菌细胞壁的主要成分6 日Ⅱ高——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物抗菌能力【53】。1989年RyaIl等从Job草中分离得到一种几丁质酶，发现它能抑制淀粉酶的活性，从而有效抑制蝗虫等昆虫类【57】。于海波等也发现蚕豆几丁质酶可抑制早期若蚜的存活和生殖发育[53】。刘伟华等用基因枪法将菜豆几丁质酶基因导入小麦，转基因小麦的白粉病症状得到了很大程度的缓解f58】。吴家和等通过农杆菌介导法将几丁质酶基因和6．1，3葡聚糖酶基因导入陆地棉品种冀台321和中棉所35，获得的7个转化株系均表现不同程度的抗或耐黄萎病性[59】。现在几丁质酶基因虽已转入几种植物中，但并未显示对番茄夜蛾幼虫具有抗性，只对桃蚜有微弱的作用㈣。另外，来源于长春花的色氨酸脱羧酶(TDc)对虱虫有抗性，该酶基因在烟草中表达后，可使烟草白粉虱的繁殖力降低达97％{⋯。1．2．I．3来源于动物的抗虫基因动物来源的抗虫基因主要是哺乳动物和烟草夜蛾的ser蛋白酶抑制剂基因。现在人们发现，胰蛋白酶抑制剂(BPTl)、旺1一胰蛋白酶抑制剂(q1．AT)、脾抑制剂(SI)是很有发展前景的抗虫蛋白，但将这些抑制剂基因转入植物中后发现并未产生抗虫性或只产生很弱的抗虫性【56J。另外，一些昆虫毒素，如蝎子毒素、蜘蛛毒素等对昆虫也有毒害作用，可引起神经麻痹，使昆虫失去知觉，不能取食而死亡【56】。这些毒素也己开始应用于基因工程，但未见报道在生产应用上的抗性表现。1．2．2转抗病基因植物植物病毒是造成多种农作物减产的重要病原，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失高达200亿美元【6”。传统的抗病育种、农药防治、组织脱毒等预防病害的方法不仅耗时费力、污染环境，而且有很大的局限性。伴随植物基因工程技术的发展，研究者认为利用转基因技术获得抗病毒转基因植物会成为防御病毒侵害的有效方法。1．2．2．1来源于病毒的抗病基因病毒外壳蛋白介导的抗性是研究的最早、也是目前比较成功的抗病毒手段。该策略主要是将病毒的外壳蛋白(coatprotein，CP)基因转化到植物细胞内并得以表达，从而使转基因植物获得抗病毒的能力。自Beachy等首先利用病毒外壳蛋白基因转化烟草获得稳定遗传的抗病毒植株以来[62J，利用CP基因提高植物抗病性这一方法得到了广泛应用。迄今7 HU再为止，已经克隆了至少15个病毒组中30种病毒的CP基因，并成功转化了20多种植物，有些株系己进入田间试验并显示了与实验室一致的抗病效果‘63l。比如，在苜蓿花叶病毒(ALMv)CP介导的抗性研究中，无论CP表达水平高与低，都表现出对完整病毒粒子的抗性，而且CP表达水平高的植株还对裸露的RNA具有抗性【64l。尽管cP介导的抗病毒植株已获得了成功，但还存在很多问题。其一，迄今所获得的基因工程植株多数只表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少惭j。其二，具有潜在危险性，导入植物中的外源CP基因的表达产物可能包装另外一种病毒或其它致病因子的基因组而形成一种新的致病因子。因此，CP介导的抗病毒植株离推广应用尚有一段距离【66】。植物正链RNA病毒的复制酶属于依赖RNA的RNA聚合酶(RNA—dependentRNApolymeraSe，RdRp)，通常由1～2种由病毒编码的蛋白质和多种寄主成份构成。在病毒编码的复制酶蛋白质中存在多个保守序列；其中一个是存在于所有RNA聚合酶中的甘氨酸天冬氨酸天冬氨酸三肽基元序列(GDDmotif)，它对聚合酶的活性是必不可少的；另一保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域(NTPbindingdomain)，位于另一种由病毒编码的蛋白质中或与GDD序列共处于同一蛋白质中：此保守序列与螺旋酶活性有关，在病毒复制时RNA双链复制型的解旋过程中超重要作用【66】。烟草花叶病毒(TMV)的54KD蛋白是该病毒复制酶的核心部分，Golemboski等将该蛋白基因转化烟草，获得的转该基因烟草对TMv表现出高度抗性[67】。Anderson等将黄瓜花叶病毒(CMv)Fny株系的RNA内部缺失94个核苷酸后导入烟草(缺失区包含GDD三肽基元序列)，结果，缺失造成开放阅读框的移码，其翻译产物只有完整的97KD蛋白的75％左右，但仍然表现出对CPV的高度抗性【68】。根据现有的研究结果来看，复制酶基因介导的抗性既可以在蛋白质水平上又可以在RNA水平上实现。在蛋白质水平上，CaⅡ等认为转基因植物表达的复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡，或者是干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径；在RNA水平上，有学者认为是转录出的“埘A与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是mI矾A诱导了植物的自然抗病性等等【69】。病毒运动蛋白基因(Movernentprotein，MP)在植物的病毒防治方面也起一定的作用。La口idot等人发现，将TMV的缺陷型MP(dMP)基因转入烟草中后能获得抗TMV的植株，进一步的实验表明转dMP基因的烟草不仅对TMv，还对烟草花叶病毒组其它成员，以及其它种类病毒如ALMV、cMV等具有不同程度的抗性㈣。这表明各种病毒MP之间虽然8 HU鬲缺乏同源性但却具有相同的功能。不同病毒来源的MP可与同种植物胞问连丝结合，抗性是由于缺陷型MP与野生型MP竞争胞问连丝上的结合位点而得以实现的‘601。由此，激发了人们用缺陷的或异源的MP介导广谱病毒抗性的设想和实验，使得转一种基因而抗多种病毒成为可能，这一抗病毒途径可能具有广阔的应用前景。1．2．2．2来源于植物的抗病毒基因植物在其长期的进化过程中也逐渐获得了⋯系列复杂的防御机制来保护自己，如病程相关蛋白(Pathogenesis．relatedprotein，PR)基因在植物受病毒或其它病原体感染时编码病程相关蛋白直接对病原体进行攻击【删。虽然目前转PR基因植物的抗性水平并不理想，但随着植物防御机制的深入研究，这种抗病毒手段应该具有很好的应用前景。核糖体失活蛋白(RIPs)是许多高等植物能自身合成的具有酶功能的蛋白质，它能够专一性水解真核生物核糖体26s／28srRNA上一段14碱基的高度保守序列，从而阻止EF2／GTP复合物与核糖体60S大亚基的结合，抑制蛋白质的合成【631。Lodge等通过对美洲商陆(尸自wo肠cc日爿卅∈j，fcdn订L．)核糖体失活蛋白基因编码的cDNA进行克隆、体外重组、构建表达载体后再转化烟草植株，攻毒试验表明，表达PAP的转基因植物能抵抗多种病毒(Pvx、PvY、cMv等)的侵染㈣。张海燕等对美洲商陆RIPs的cDNA进行克隆、测序，再构建到植物表达载体pBP21，经农杆菌转化，将PAP的cDNA导入油菜后也获得了抗TuMv的油菜植株16⋯。1．2．2．3利用核酶基因抗病毒核酶(Ribo纠me)是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身以及其它RNA分的小分子RNA，它广泛存在于一些类病毒和病毒卫星RNA序列中【721。研究者根据核酶切割位点的序列保守性，人工合成切割不同病源性I矾A的核酶，在生产实践中取得了令人兴奋的成果：杨建华等将设计的特异切割烟草花叶病毒I斟A的锤头型核酶Rz．2转化烟草原生质体，通过检测TMV对烟草原生质体的侵染性发现，转基因原生质体中TMv侵染性明显低于未转基因的对照组【731；赵志英等将切割番木瓜环斑病毒(PapayaRingspotⅥms，PRV)RNA的核酶基I习转入番木瓜，获得的转基因番木瓜对PRV具有一定的抗性|74】。这是继杨建华【73】等人之后，我国将核酶基因成功转入植物并获得抗性植株的又一成功实例。9 日U晶1．2．2．4多基因策略以上方法所利用的都是单一的抗性基因，而且大多是针对某一种病毒的某一步侵染过程来设计的，因而其抗性多具有较强的专一性和局限性。然而，在自然条件下，RNA病毒有相当高的突变率，突变株的不断进化可能会导致抗性的丧失，因此，采用复合抗性基因的策略不失为一个可行的解决方案[751。多基因策略即是利用多个抗性基因共同作用或相互作用，从多条途径来破坏病毒基因组的功能表达，从而达到有效防治病毒的目的⋯。近年来，这方面的试验已经有了成功的例子，例如：在抗CMV的研究中，人们发现，用cMvcP基因与卫星RNA中的任何一种单独转化植物，都难以获得良好的效果，Yie等人将cMvcP基因与卫星RNA构建到同一植物表达载体中转化植物，结果获得了高抗工程植株。再比如，Pvx和PVY是危害马铃薯生产的常见病毒[75】，Lawson等将PVX和PvY的cP基因构建到同一质粒上构成双基因植物表达载体(口MON9898)，再转入马铃薯；随后Nomlcm杂交和wjstern杂交分别证明这两种基因均得到了稳定的转录和表达‘761。当用P、，X与PVYJ司时接种时，转基因植株表现出了对这两种病毒的抗性，这些实验结果有力地证明了该策略的可行性和有效性。1．2．3转抗除草剂基因植物杂草是农业生产中的一大危害，不仅与作物争夺水分养分，而且严重影响作物的产量和品质。目前，应用化学除草剂是防除杂草的主要方法。但是，除草剂在杀死杂草的同时往往对农作物的生长产生抑制作用或者杀死作物，因此，除草剂的使用受到很大的限制[771。植物基因工程技术的出现使选育抗除草剂作物新品种、扩大现有除草荆的应用范围的梦想成为现实，使得防除杂草变得越来越容易。1．2．3．1转抗草甘膦基因植物草甘膦(Glyphosate)是一种非选择性有机膦类除草剂，它具有：高效，对人畜低毒，低残留，不破坏生态环境，对绝大多数植物具有灭生性等特斛771。这些特点使得草甘膦成为最优秀的除草剂品种之一，有很高的商业价值。草甘瞵作用靶标酶是5一烯醇丙酮酸莽草酸一3一磷酸合酶(5一enolpymvyl-shiki．mace一3．phoshatesynthase，EPsPs)，它是细菌和植物体内芳香族氨基酸一色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中一个关键性酶限781。草甘膦的作用机制在于抑制植物体内芳香族氨基酸的生物合成，芳香族氨基酸能克服或减轻草甘磷对胡萝h、烟草、大豆等的毒害最用【79】。Monsato公司把来源于农杆菌cP4的EPsP合10 目Ⅱ吾成酶基因转化大豆，获得对草甘膦高抗性的转基因大豆【801，此大豆已商品化生产。HouH等将cP4和G0x基因转化小麦也获得了抗草甘膦表达【8“。此外，Kishorc和Ban_y将一氧化酶基因【82】，A1ejandmpenaloza．vazqnez将一膦酸转移酶基因【83J，Fi乜gibbon和Bmymer将igrA基因克隆、转入植物中‘841，也获得了不同程度的抗草甘膦表达，这些基因表达的酶也能将草甘膦快速的代谢成无毒化合物。1．2．3．2转抗草丁膦(Glufosinate)基因植物草丁膦除草作用机理是抑制植物的氨基酸生物合成酶——谷氨酰胺合成酶(Gs)，Gs在植物的氨同化及氮代谢调节中起重要作用，它是植物中唯一的解毒酶以解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的氨的毒性【8”。草丁膦抑制植物Gs后，导致细胞内氨的含量迅速积累，随之叶绿体解体，植物死亡【8“。虽然草丁膦抑制细菌、植物及哺乳动物的GS，但因它不能进入哺乳动物的血液和脑组积，因此，草丁膦对哺乳动物是安全的【85-881。来自土壤细菌＆HE∥D叼雠s矗增加scopfc“J的bar基因【8919。1和来自Svf，讹c^，o坍p驴”黜的pat基因{引I是两个抗草丁膦基因。这两种基因都编码PAT(草丁膦乙酰转移酶)，P：AT使草丁瞵的自由氨基乙酰化，从而对草丁瞵解毒【921。有学者将bar基因转入烟草、番茄、马铃薯、水稻、拟南芥中，在花椰菜花叶病毒35S启动予的控制下，PAT在转基因植物中获得了不同水平的表达，无论表达水平高还是低，这些转基因植株都获得了抗草丁膦抗性[93。961。我国张晓东等人用基因枪也将bar基因导入小麦幼胚、幼穗和花药、获得了多株转基因小麦；经班点杂交和sout}1em杂交鉴定表明，外源基因已稳定整合到小麦基因组；转基因植株一代经除草剂草丁膦抗性鉴定表明，能抗20～80m玑的草丁膦，其中一株的抗性高达150mg／L【97】。1．2．3．3转抗磺酰脲类除草剂基因植物磺酰脲类及眯唑啉酮类除草剂作用机理是抑制植物中的乙酰乳酸合成酶(ALs)，ALs酶是细菌及植物支链氨基酸一缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成中的重要酶【98】。Haughn等将变异植株的ALS基因转入烟草、这一转基因植物产生了对除草剂的抗性【98】。烟草的SURB．Hra基因也可以在某些变异种的细胞或整体植株上转移，产生对磺酰脲类除草剂的抗性；Mazur等将sURB．Hra基因导入烟草，用磺酰脲类除草剂处理，观察其毒性症状；用叶面喷旌分别为每hm289、169、329，结果表明，即使在最高处理剂量时，转基因烟草也未出现药害，这一处理剂量比大用常规用量高4倍；然而，野生型植株在每hm289时即出现严重药害【州。11 HU哥另外还有抗阿特拉津(AtraZine)转基因作物，细胞色素P450及脱卤素酶转基因抗除草剂作物。中国科学院遗传所朱立煌等通过施用阿特拉滓筛选出了抗阿特拉津的龙葵【moJ0”。Shiota等利用大鼠细胞色素P450还原酶基因，通过农杆菌注入技术获得了转基因烟草，这种转基因烟草获缛抗50pM儿浓度的绿麦隆的表达1102‘1051。1．2．4植物生物反应器随着转基因植物技术的日益成熟，植物体正成为具有重要经济价值的药用蛋白、抗体和疫苗的生物反应器，转基因植物因此又被称为“分子药田”、“分子农业”(molecularf妇ing)【106】。它具有了无限制生产重组蛋白的巨大潜力，能为人类提供一种大量生产重组药用蛋白的安全可靠、低成本、高效崭新生产体系，成为人类医学和生命科学研究领域中提供诊断试剂和蛋白质药物的有用工具。1。2。4。1利用转基因植物生产药用蛋白转基因植物生产药物蛋自最早的例子之一是利用植物贮藏蛋白天然的高水平表达特性生产人血清蛋白(HAs)Il”J。HsA是一种非糖基化蛋白，据估计全球每年需求量达到550吨【∞“。通常，它是从人血中分离提纯，因此成本高昂，而且还要冒病毒污染的风险。现在，人们可以利用转基因植物得到更安全、价廉的人血清白蛋白。骨形态发生蛋白(BMPs)是一类调节骨组织发育的生长因子。BMP。2是BMP家族中诱骨活性最强的。在骨组织工程研究和临床应用中需要大量的BMP一2；我国高源等将bmp一2基因导入烟草，结果在烟草各组织中均得到表趔”8J。转基因植物作为生产药物蛋白的生物反应器，为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系。据不完全统计，目前已有几十种药物蛋白或多肽在植物中得到成功表达，其中包括人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等(见表1)【10酬。1．2．4．2利用转基因植物生产饲(食)用疫苗利用植物生产可食(饲)疫苗已经成为目前研究的热点领域。传统疫苗生产一般采用酵母细胞，从中提取抗原，纯化后再输入到人畜体内使其产生抗体，从而达到免疫的目的。在疫苗生产的整个过程中，需要成本很高的发酵和蛋白质纯化技术，而且在分发运输过程中需要冷藏，大大增加了疫苗的成本。用植物基因工程技术生产疫苗方法与用微生物和动物生产疫苗方法相比，具有明显的优势：成本低及使用方便；生产速度快：能进行有效的翻译后加工；安全性好；动粘膜免疫；易于运输等‘1舡”61。12 ‘由于植物易于转化并能提供廉价的蛋白质源，因此利用转基因植物开发新型疫苗是一种最经济的有效途径，并且具有相当大的潜能。目前，已有多种口服疫苗在转基因植物中表达成功，且在动物和人实验中获得了满意的结果。这些疫苗都是针对同常生活所常见的人和动物疾病设计的，如用于人的乙肝病毒疫苗Ⅲ：1201、霍乱弧菌疫苗㈣】、肺结核疫斟122。、产肠毒素大肠杆菌疫苗旧。1251、Norwalk病毒疫苗f126，12”、狂犬病毒疫苗f1281、涎腺病毒疫苗【129】、轮状病毒疫苗【1301、麻疹病素疫苗【131】、呼吸道合胞病毒疫苗‘132，133】和牙龋疫苗【134】等：用于动物的猪感染性胃肠炎冠形病毒疫苗【埘】、免出血病病毒疫苗f13们、犬细小病毒疫苗[1361、运输热疫苗l啪]和口蹄疫病毒疫苗‘138’等。相信在不久的将来，人们通过咀嚼食物或者牲畜通过饲用饲料就可获得免疫，使得传染病的防治变得更加容易。表1转基因植物表达的药物蛋白T曲le1MedicaIpmteinsexpressedbytransgenicplants药用蛋白转基因植物应用作者人生长激素(hGH)烟草，向日葵刺激生长Bana等，1986脑啡肽(EIlkephalin)油菜，拟南芥镇痛valldeKerckhove等，1989脑啡肽(Enkephalin)烟草镇痛心ebbers等，1990人干扰素(HIFN一Ⅱ一D)caMc抗病毒Dezoetcn等，1989人血清蛋白(HAs)烟草，马铃薯血浆成分s“mons等，1990人表皮生长因子(11EGF)烟草刺激上皮细胞分裂Higo等，1993血管紧张肽转化酶抑制剂烟草，番茄抗过敏H锄釉oto等，1993促红细胞生成素(EP0)烟草调节红细胞水平Ma乜umoto等，1993红鳟生长激素(TGF)烟草刺激生长Bosch等，1994人干扰素(HH州一洳D)水稻抗病毒zhu等，1994促红细胞生成素(EPO)烟草调节红细胞水平Mats啪oto等，1995水蛭素(Himdin)烟草悬浮细胞凝血酶抑制因子PaⅡnenter等，1995巨噬细胞集落刺激I司子烟草抗感染G雏z等，1996人Ⅱ，B血红蛋白(Ⅱ，phHb)烟草治疗贫血病Djergl、k等，1997人毒蝇碱性胆碱能受体烟草Mu等，1997骨形态发生蛋白(BMPs)烟草调节骨组织发育GAOYuan等，20063 1．2．5其他转基因植物1．2．5．1转品质改良基因植物品质改良主要涉及蛋白质的含量、氨基酸的组成、淀粉和其他多糖化合物以及脂类化合物的组成【1391。通过植物基因工程手段可以改善这些营养成分的组成。如Liu等将水稻富含甘氨酸启动子的基因osgrp一2导入到其他作物获得高水平表达甘氨酸的植株【139l；玉米的贮藏蛋白质基因转移到大豆中，获得了蛋氨酸含量高的转基因大豆【Ⅲ】。将编码赖氨酸的基因入植物，获得的转基因植物高水平合成富含赖氨酸的蛋白质，已提高种子贮藏蛋白的营养价值‘Ⅲ4431。Mener等将富含脯氨酸基因导入水稻中获得转基因植株，提高了籽粒蛋白质含量，改善了稻米的品质‘144】。我国在利用基因工程改良植物品质上也取得了较大的成就，Peng等将玉米醇溶蛋白(zein)基因导入马铃薯后，田问转基因植物的块茎中必需氨基酸含量提高10％以上，而含硫氨基酸的增加尤为显著‘14”。1997年，中国第一个获准进行商品化生产的转基因番茄——华番l号，解决了由于果实具有呼吸跃变期而难贮藏的难题，大大延长了番茄的保鲜期【14⋯。高分子量谷蛋白亚基(HMW—GS)是影响小麦面粉加工品质和烘烤品质的重要因素。目前，已有许多研究都表明了利用HMW—GS基因改良小麦品质的可行性[146。15”。河北省农业科学院将优质蛋白基因和抗白粉病基因转到普通小麦种，获得了高产优质抗病的新品系『15211．2．5．2转抗逆基因植物作物的平均产量总是不能达到其潜在能力的最高值，原因之一就是他们并不总是生活在最适宜的环境中，而是经常受到各种逆境条件(早涝、盐碱、强光、低温等)的危害|J”l。利用植物转基因技术提高作物的抗逆性成为有效方法之一。HKTl基因编码钾离子转运蛋白，La嘶e等将其转入小麦中，获得了耐盐植株并提高了K+小a+比旧1。siv撇ani等将来自大麦的HvAl基因转入小麦，使这种转基因小麦后代的水分利用效率得到了改良和提高【1541。Dessalegne等将草酸氧化酶基因转入番茄中得到的转基因番茄在盐胁迫情况下其产量大于对照[155】。除此之外，Nishida和Murata还获得了耐寒冷的转基因烟草和蓝藻【博6I：转极地鱼抗冻蛋白(AFP)基因的抗冻草莓也已用于大罔生产【”们。我国在抗逆基因的分离、克隆和转化等方面的研究己取得一定进展，克隆了耐盐碱相关基因，通过遗传转化已获得了耐1％Nacl的苜蓿，耐O．8％Nacl的草莓，耐2％Nacl的14 刖再烟草，抗逆基因工程作物己进入田|、日J试验阶段I”引。另外，刘岩等获得了耐盐性明显提高的转基因玉米植株‘159J；张荃等获得了耐赫性提高的转基因番茄‘160】；张艳敏等分别进行了相关合成酶编码基因的转化试验，不同程度地提高了转基因后代对水分和盐分的耐受能力㈣‘1631。1．2．5．3转雄性不育基因植物传统的雄性不育系因其恢复源偏少或者群体优势不强，抑或不育性不稳定等限制了农作物杂种优势在生产上的应用¨“】。随着植物基因的迅速发展，采用遗传转化方法创造作物雄性不育系和恢复系将为杂种优势的利用提供一条行之有效的新途径。自上世纪90年代初M撕ani等人开始利用基因工程创造植物雄性不育以来，至今已初步建立了几种创造雄性不育的体系1164】。DeBlock等首先开展了在小麦上的研究，利用Mariani等人的方法构建了雄性不育基因的体系【1”】。李艳红等以自己克隆的肌动蛋白基因为基础，构建了一种新的人工雄性不育嵌合基因，并将此基因转入普通小麦中，经PCR和southem检测，初步表明该基因已整合到小麦的基因组中[1”】。1．3本研究的目的和意义自80年代末第一例转基因玉米诞生以来，转基因玉米的发展己经历了约20年时间，但至今未见玉米转伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)糖蛋白gD基因的报道。gD基因的蛋白表达产物具有良好的免疫原性。本研究以玉米胚乳特异表达启动子(Globulin．1)和PRvgD基因构建的重组质粒为载体，通过根癌农杆菌介导法转化单子叶超甜玉米幼胚，以期获得在种子内专一表达外源蛋白的转基因玉米。伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是一种由伪狂犬病病毒引起多种家畜、野生动物、伴侣动物和实验动物感染的急性传染病。自然条件下有35种动物可感染发病，最常见于猪、牛、羊、犬、猫和鼠类，现以猪感染最为普遍，猪是该病毒的主要宿主和传染来源。目前该病分布广泛，危害严重，已经给许多国家的畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失。据报道已有40多个国家和地区发生过该病，现已遍及欧洲、东南亚、南美洲、中美洲及非洲。我国也已有20多个省市报道过此病，且呈增长趋势。在我国每年有上千万头猪感染该病毒，造成的经济损失达20亿元。该病对仔猪的致死率可高达100％，成年猪可产生呼吸系统感染症、康复猪可潜伏感染、终生带毒等，给全球畜牧业尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫接种是防治及消灭伪狂犬病的重要手段，但目前常用的弱毒苗、 刚百灭活苗普遍存在散毒、毒力返强、潜伏感染等问题及不足，因此，利用生物技术尝试研制更安全有效的植物饲用疫苗防治伪狂犬病，将有十分重要的意义。玉米是世界第三大粮食作物，产量高，易于贮藏、运输和加工，同时是动物饲料的主要成分，如果gD疫苗基因能在种子中专一高效表达，生产饲用伪狂犬病疫苗将具有很大的市场需求和巨大的直接经济效益，同时可显著提高种植业的附加值。虽然在利用转基因植物生产疫苗方面取得了重要进展，其中有一些已经进行了动物和人体的实验，并且证明直接食用(饲用)疫苗的免疫性是非常有效的。但在转基因受体植物、基因表达组织的专一性和疫苗抗原基因的选择等方面，还不能满足植物疫苗产业化生产的要求，一些重要的动物传染性疾病的植物饲用疫苗研究还没有开展。PRv糖蛋白gD是免疫反应的主要靶目标，本研究以PRV的gD基因和G10bulin．1启动子构建的重组质粒一—pGLB．gD为载体转化玉米，研究外源基因在胚乳中的特异表达，从而为转gD基因玉米成为一种特有的可饲(食)性伪狂犬疫苗提供一个可行的技术手段。这一研究在国内外尚未见报道，因此，本课题具有重要的学术价值和巨大的经济效益。6 材料2材料2．1植物材料超甜玉米(历4Ⅲ回wL)自交系1132，由广东省农业科学研究院作物研究所玉米研究室提供。烟草(Mco砌”ⅡfⅡ6Ⅱ∞mI。)K326，由广东省农业科学研究院作物研究所烟草研究室提供。2．2菌株和载体DH5。(大肠杆菌)、农杆菌(一r“m咖c招"s)LBA“04(pTDK233)、转基因植物表达载体pGLB-gD(图1)、pBA鸣D(图2)均由广东省农科院胡建广博士提供。图l表达载体pGLB-gD质粒图谱Fig．1PIasmidcons妇mctofexprcssjonvectorpGLB—gDE9BarPnoCaMV3SSgDNOSLBEcoRJHjndIXh0JSDeIEc捌图2表达载体pBA_gD质粒图谱Fjg．2P】asmidconstnlctofexpfessionv。ctDrpBA—gD2．3PCR引物参照Hasebe的方法【16”，根据PvRgD基因序列，设计了一对鉴定gD基因内部序列的特异性引物：PI：CACGGAGGACGAGCTGGGGCTP2：GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT17 材料2．4培养基2．4．1玉米转化及筛选培养基根癌农杆菌感染培养基：Ms大量元素、MS微量元素+烟酸O．5mg／L+吡哆胺盐酸0．5mg儿+硫胺素I．0mg／L十肌醇100．Om∥L+水解酪蛋白1000．0m晷，L+2，4一Dl，5m∥L+蔗糖68．5∥L+葡萄糖36．O∥L+乙酰丁香酮100．O“m01，pH5．2；幼胚和根癌农杆菌共培养培养基(GM)：Ms大量元素、Ms微量元素+烟酸O．5m∥L+吡哆胺盐酸O．5mg／L十硫胺素1．Omg／L+肌醇100．0m∥L+水解酪蛋白l000．Om∥L+脯氨酸700．0mg几+2，4一D1．5m∥L+蔗糖20．0∥L+葡萄糖10．O∥L+乙酰丁香酮100．O“mol，pH5．6；转化幼胚筛选培养基：GM除去葡萄糖和乙酰丁香酮，加入先锋霉素250．Omg／L；愈伤组织诱导培养基(1M)：N6大量元素、微量元素+B5维生素+谷氨酰胺300．Omg／L+水解酪蛋白500．0mg／L+脯氨酸700．Om∥L+蔗糖20．09，L+AgN03900．0m∥L，pH5．6；抗性愈伤组织继代培养基：IM+ABA3．Om∥L；抗性愈伤组织分化培养基：Ms大量元素、Ms微量元素+B5维生素+谷氨酰胺300．Omg／L+水解酪蛋白500．Om∥L+蔗糖20．O∥L+6一BA2．0m∥L时4AAO．5m∥L；玉米生根培养基：l／2MS+蔗糖10．09／L+IBA3．Om∥L+NAAO．1mg／L，pH5．6l㈣】。2．4．2烟草愈伤组织培养培养基烟草愈伤组织诱导培养基：MS+2mg／LBA+0．2mg／LIAA烟草愈伤组织分化培养基：MS+1mg／LBA；烟草生根培养基：Ms+O．1m∥LIAA。2．4．3细菌培养基LB液体培养基：胰蛋白胨10，Og，酵母浸出物5．09，NaCl10．09，溶于双蒸水中，完全溶解后调pH至7．0～7_2，定容至looO．0ml，在15磅高压下蒸汽灭菌20min，室温保存。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1．5％的琼脂，在15磅高压下蒸汽灭菌20min。待培养基降温至50．O℃左右，加入相应抗生素，铺制平板。待培养基凝崮后，置4．0℃保存备用。YEP培养基：胰蛋白胨5．Og，酵母浸膏1．Og，牛肉浸膏5．09，Mgs04．7H200．4939，溶于双蒸水中，完全溶解后调pH至7．O～7．2，定容至1000．0ml，在15．0磅高压下蒸汽灭1R 材料菌20min，室温保存。2．5试剂及配制2．s．1主要试剂限制性内切酶j矾oI、＆以I、dNTPs等购自T酞ara工司；TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程公司：回收DNA试剂盒购自Omega公司；100bpladder购自Fennentas公司；琼脂糖购自Sigma公司；尼龙膜购自Amershampharrnaciabiotech公司；硝酸纤维素膜购自上海华舜公司；DIGEasyHyb和DIGDNALabeliIlgandDecection幻t购自Roche公司：[c‘．32P】dCTP购自上海福瑞生物工程公司；山羊抗猪IgG购自美国SaJlta公司：培养基所用盐类为广州化学试剂厂产品；维生素为上海源聚生物科技有限公司产品；脯氨酸、L-谷氨酰胺等购自上海伯奥生物科技有限公司：Tis、SDS、CTAB等购自Sigma公司。2．5．2碱法提取质粒溶液SolutionI：50．Ommol／L葡萄糖，lO．0mmol／LEDl'A，25．Ommol／LTris．Cl(pH8．0)，121．0℃，20min，冷却至室温，4．O℃保存备用。SollnionII：O．2mol／LNaoH，1．O％SDs，用灭菌蒸馏水现用现配。SolutionIII：3．Omol／LKAc，11．5％(w／w)冰乙酸，4．0℃保存备用。TE：lO．Ommol／LTHs．HCl(DH8．O)，1．0mmol／LEDTA。3m01／LNaAc(pH5．2)：在800ml蒸馏水中溶解408．19三水乙酸钠，用冰乙酸调pH5．2定容至1000．Oml，分装后高压灭菌。2．5．3农杆菌感受态细胞相关溶液的制备Psi．培养基：2．O％蛋白胨，O．5％酵母提取物，10．0mm01／LNaCl，5．0mmol／LKCl，用KOH调pH值至7．6，加1．0m01几Mgs04至终浓度20．Ommol／L，121．0℃，20min。溶液RFl：loo．0mmol／LRbcl，50．Ommol／LMncl2’4H20，30．Ommol几KAc，l0．Ommol／LCaCl2·2H20，15．0％(w／v)G1yceml，用0．2mol／L醋酸调pH至5．8，过滤除菌，4．O℃保存备用。溶液RF2：lO．Ommol／LMOPS，10．0咖ol／LRbCl，75．0mmol／LCaCl2·2H20，15．O％(WⅣ)G1ycerol，用Na0H调pH至6．8，过滤除菌，4．O℃保存备用。lO 材料2．5．4植物基因组DNA提取相关溶液1．5×CTAB：1．5％(w／v)C1、AB，100．Ommol／LTris—HCl(DH8．O)，20．0mmol／LEDTA，1．4mol／LNaCl。lO％CTAB：10．O％(w／v)CTAB。高盐TE：1．0mol／LNaCl，10．Ommol／LTris—HCl(pH8．O)，1．0mmol／LEDl、A。0．5mol／LEDTA(pH8．0)：在800．Oml蒸馏水中加入186．19EDTA—Na·2H20，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用Na0H调节溶液pH值至8．0，然后定容至1000．Oml，121℃，15血n。2．5．5分子杂交相关缓冲液50×11AE：242．09Tris．base，57．1ml冰乙酸，100．Oml0．5mol／L的EDTA(pH8．0)，定容至1000．0m1，室温放置，临用前用蒸馏水稀释成1×TAE。琼脂糖凝胶变性液：O．5mol／LNaOH，1．5mol几NaCl。琼脂糖凝胶中和液：1．5mol／LNacl，lmo儿Tds．Hcl(口H7．4)。washingbu髓r：0．1mol／L顺丁烯酰胺酸，O．15mol／LNacl，O．3％T、veen一20，pH7．5。顺丁烯酰胺酸缓冲液：0．1mol／L顺丁烯酰胺酸，O．15mo儿NaCl。20×ssc：3mo忱NaCl，柠檬酸钠88．29，pH7．O。100×DaIlhardt’s：1．O％Fic01l，1．O％Polyvinylpyrolidone，1．O％BSA；过滤除菌，一20．0℃保存。预杂交液：6×SSC，10．O％PEG，5×DaIlllardt’s，1％SDS。杂交液：预杂交液中另加经变性的同位素探针。2．5．6烟草叶蛋白提取缓冲液50mmol／Lnis—HCl(pH7．5)，50mmol／LNaCl，5mmol／LEDTA，0．1％1YitorⅨ一100，1％(w，v)VC，l％(w／v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，121℃，20IIlin，冷却至室温，置于4℃保存备用。临用前加1％100mmol／L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，2％1mol／L的二硫苏糖醇(DTT)。2．5．7SDS—PAGE与western_blotting相关溶液30％丙烯酰胺：70ml双蒸水中加入299丙烯酰胺和lg甲叉双丙烯酰胺，搅拌加热溶解后，定容至100ml，置棕色瓶中于4℃保存备用。20 材料10％过硫酸胺：O．59过硫酸胺溶于5ml蒸馏水中，于4℃保存备用。1．5mo儿Tris．HCl(pH8．8)：36．339Tris．base溶于适量双蒸水中，调pH8．8，定容到200ml，室温放置。1．0Ino儿Hs—Hcl(pH6．8)：24．229THs_base溶于适量双蒸水中，调pH6．8，定窖到200mi，室温放置。10％SDS：在900m1水中溶解1009SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液pH值至7．2，加水定容至1000m1，室温放置。5×Tris．甘氨酸电泳缓冲液：Tris．base15．19，甘氨酸949，lO％sDs50ml，溶于适量双蒸水中，完全溶解后定容至1000111l，室温放置。2×SDS加样缓冲液：100mol／LTris-HCl(pH8．O)，200mol／LDTT，4％SDS，O．2％溴酚蓝，20％甘油，置棕色瓶内室温保存。考马斯亮蓝染色液：45ml双蒸水，10ml冰乙酸，混匀后加入O．259考马斯亮蓝，充分溶解后过滤，置棕色瓶内室温保存。SDSm～GE脱色液：45ml双蒸水，10ml冰乙酸，充分混匀。电转缓冲液：甘氨酸14．49，nis-base3．09，10％sDs3．7ml，甲醇200mI，加双蒸水定容至500m1，室温保存。TBS(pH8．O)：95IIll双蒸水中加入Tris．basel．219，NaCl8．779，充分溶解后调pH值8．0，定容至1000ml，室温保存。TBST；含O．05％．I、veen．20的TBS，室温保存。封闭液：含5％脱脂奶粉的TBST，于4℃保存备用。wjstem-blotting底物液：6mg二氨基联苯胺(DAB)溶解于9mlO．01m01／LTris-Hcl(pH7．6)，再加1mlO．3％coCl2。混匀后立即使用，每次现用现配。2．5．8抗生素Kanan巧cin：将卡那霉素溶于适量无菌蒸馏水，O．22岬滤膜过滤，终浓度50．0m∥L，．20．O℃长期保存。Ce矗adine：将适量头孢霉素溶于无菌蒸馏水，0．22扯m滤膜过滤，终浓度250．Omg几，-20．0℃长期保存。spectinomycin：将壮观霉素溶于适量无菌蒸馏水，O．22pm滤膜过滤，终浓度50．Omg／L，．20．O℃长期保存。21 实验方法3实验方法3．1质粒的大量提取与纯化(1)分别剐取-70℃保存的装载有质粒pGLB-gD和pBA·gD的大肠杆菌于50ml的LB液体培养基中，质粒pGLB-gD的液体培养及含卡那霉素50mg，L，质粒pBA-gD的液体培养基含壮观霉素50m∥L，37℃，250r／min震荡培养过夜；(2)8000r／min离心5min收集菌体，弃去上清液；(3)加入2mlSolmionI、50¨l溶菌酶和10肛120mg，m1RnaseA，振荡混匀，静置10Inin；(4)加入4mlSolutionII，混匀，直到变为清亮；(5)加入3rnlSolutionIII，混匀，冰上静置30min；(6)12000r／min离心15mh，收集上清液，尽量不要吸取絮状物：加入2倍体积的无水乙醇，混匀，冰上静置10min；(7)12000r／miil离心15min，去上清；用70％的乙醇清洗沉淀表面一次，沉淀溶解在2mI的无菌水中；(8)加入2ml7．5mol／LNH4Ac，混匀，冰上静置30min；(9)12000“rnin离心15min，收集上清：加入2倍体积的无水乙醇，混匀，．20℃静置30～60min：(10)12000r／min离心15min，去上清，用70％的乙醇清洗沉淀表面一次，沉淀溶解在1．5ml的无菌水中；(11)加入10“120mg，ml鼬1aseA，37℃保温30m血；(12)加入等体积的13．O％PEG8000(含1．6mol／LNaCl)，冰上静置30min：(13)15000r／min离心15lIlin，去上清，每管沉淀溶解在0．5m1的无菌水中：(14)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分振荡，15000r／min离心10min；(15)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分振荡，15000r／mm离心10min；(16)取上清，加2倍体积的无水乙醇和1／10体积的3mol／LNaAc(pH5．2)，．20℃静置2h：(17)15000r／min离心15min，去上清，用70％的乙醇清洗沉淀表面一次，晾干表面水分，用50“l无菌水溶解沉淀DNA；(18)用uv-4000型分光光度计(瑞士AP公司)分别测定260nm、280m的光吸收值，22 实验方法检测DNA浓度并求出DNA纯度，一20℃保存备用。3．2农杆菌感受态细胞的制备(1)挑取单菌落于2mILB液体培养基中，28℃下250r／min振荡培养过夜；(2)次日500Hl转接于Psi一培养基中，28℃，250r／min振荡培养至OD600=1．0～2．0：(3)将细胞培养物Falcon管冰浴10～15min，4℃，4000r／min离心15min沉淀细胞，弃去上清液；(4)用16m1RFl溶液重悬细胞，冰浴15min，4℃，400洲min离心15min沉淀细胞，弃去上清液；(5)用4mlRF2溶液重悬细胞，冰浴15min后，分装，每个离心管200ul’立即用液氮速冻2～3rnin，一80℃保存备用。3．3农杆菌的转化(1)取1～2肛g纯化的DNA(3．1中制备)与农杆菌感受念细胞混匀，冰浴30min(2)迅速放入液氮中，静置5min：(3)迅速转入37℃水浴30min：(4)加入800“lⅥ1P液体培养基，30℃振荡培养3～4h：(5)均匀涂布于含有卡那霉素(筛选pGLB唱D质粒)和壮观霉素(筛选pBA—gD质粒)的YEP平板，于30℃倒置培养至出现单菌落。3．4转化外植体前的准备3．4．1烟草无菌叶片的获取(1)精选饱满的烟草种子，先用蒸馏水清洗数次；(2)用70％的酒精消毒30秒，之后立即置于15％次氯酸钠液中10min，取出后用无菌水反复冲洗四遍；(3)将无菌烟草种子播于三角瓶中的MS培养基中进行萌发；(4)幼苗的叶片长度达到3cm左右时待用。 实验方法3．4．2玉米幼胚的准备(1)取授粉9～1l天的超甜玉米果穗，去除包叶，籽粒表面用70％的酒精消毒30秒，无菌水漂洗一次，再用20％次氯酸钠浸泡消毒20～25min，无菌水冲洗3～4次。(2)在超净工作台上用无菌镊子小心挑取大小为l～2mm的幼胚。3．4．3根癌农杆菌的培养转化前一天，分别挑取(3．3中)含有质粒pGLB．gD和质粒pBA—gD的根癌农杆菌单菌株LBA4404，分别在含5胁g／L卡那霉素和50mg／L壮观霉素的YEP液体培养基中28℃震荡培养至0D600值0．5～1．O，立即放于冰上静置10min。于4℃、4000“mm离心收集菌体，再用2倍体积的感染培养基悬浮菌体。3．5转化3．5．1转化烟草叶片用无菌打iL器在烟草无菌叶片上打孔(直径为O．5cm)，将叶圆片浸入准备好的含质粒pBA-gD的农杆菌菌液中，5分钟后取出，用无菌的滤纸将叶圆片上的菌液吸干，然后将其平放在烟草分化培养基上共培养。3．5．2转化玉米幼胚将分离的幼胚用感染培养基洗涤一次，然后浸入制备好的含质粒pGLB．gD菌液中，在摇床上震荡培养5min。取出幼胚，用灭菌的滤纸吸干表面的菌液，将其移入固体共培养培养基上，22℃暗培养72h。3．5．3抗性愈伤组织的筛选及植株再生3．5．3．1烟草叶片抗性愈伤组织的筛选和植株再生将感染后的外植体接种到共培养培养基上，然后在26～28℃连续光照下共培养26h，随后将外植体转移到含3mg，tBasta(筛选阳性愈伤组织)和250m班先锋霉素的愈伤组织诱导培养基上，用石蜡膜封口，于同样条件下进行抑菌培养，并每周转移同样的培养基一次，两周后将生长良好的愈伤组织继代培养2～3周。挑取生长旺盛的愈伤组织转移到 实验方法分化培养基(3mg／LBasta+250m∥L先锋霉素)继续培养。当有芽分化时，将芽连同基部愈伤组织一起切割下来转移到含同样浓度的Basta和先锋霉素生根培养基上，待茎芽伸长到2～3个茎节，带根的小植株长出几片新叶后移入花盆中炼苗，最后栽培于温室中。3．5．3．2玉米幼胚抗性愈伤组织的筛选将共培养后的幼胚转移到筛选培养基上培养3天，再移入5m∥LBasta的筛选培养基上筛选一周，然后转移到10m∥LBas诅的选择培养基上继续筛选，每次继代均选择生长良好的愈伤组织转入下一轮，经过3轮筛选后，抗性愈伤组织经加ABA的继代培养基诱导胚状体形成，3周后转入再生培养基诱导小苗，培养条件为：温度26～28℃，光照16h／d，光强1500～20001x，愈伤组织先长出绿点，然后再分化出小苗。将小苗转移到生根培养基中生根，经练苗后移栽花盆中，然后移入温室。3．5．4转化体的分子检测经上述再分化过程产生的烟草和玉米植株叶片，采用cTAB法提取DNA。在进行点杂交与soutllem杂交时，以未转化的植株为负对照，以限制性内切酶)(1loI完全消化总DNA，以20pg的pGLB—gD质粒DNA为正对照，用同一限制性内切酶处理。gD基因从质粒pGLB-gD中用ⅪIoI酶切，回收1200bp的gD基因DNA片断，进行分子杂交。3．6转化植株DNA的提取3．6．1转化植株基因组DNA快速提取试剂：溶液A：1．2mlRNaseA，溶液B：60ml溶液C：180ml溶液D：3mlResin溶液E：50ml溶液F：25ml10m∥ml，一20℃保存；5N异硫氰酸胍；4NNaCl04pH5．2：用时充分混匀；用前加入75ml无水乙醇，充分混匀TEbu行-er。(1)称取O．59烟草、玉米叶片，液氮中研磨，加入1m1溶液B，反复混匀，室温放置5min：(2)加入2．5ml溶液c，溶液A10ul，充分混匀，室温放置20min；25 实验方法(3)≥8000mm离心3min；(4)取上清，加入50肛l溶液D，室温放置5min，≥8000rpm离心lmin，弃上清(5)加入800ul的溶液c，混匀，≥8000rpm离心lmin，弃上清：(6)加入1ml的溶液E，混匀，≥8000Ipm离心1min，弃上清；(7)重复(6)；(8)≥12000rpm离心lmin，吸于上清，室温晾于5耐n；(9)取溶液F100ul，混匀，50℃水浴5min；(10)≥12000rpm离心1min，取上清，即为DNA。3．6．2CTAB法大量提取转化植株总DNA(1)称取59烟草、玉米叶片，用液氮充分研磨；(2)将冷冻研磨成粉末的材料移入50m1的离心管中，加入20m11．5×CTAB提取液(可预热到80℃)，摇匀，在56℃水浴中保温15～20min，期间摇动数次；(3)加入15m1氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，平缓摇动10min，20℃，4000“min离心15min：(4)取上清至另一离心管，加入l／lO体积的10％CTAB，混匀：(5)再加15ml氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，平缓摇动10rnin，20℃，4000r／min离心15mm：(6)取上清至另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，直至出现乳白色絮状沉淀；(7)将絮状沉淀挑出，转入1．5Tnl离心管，用70％的乙醇清洗沉淀一次：(8)12000r／min离心1IIlin，弃70％乙醇并晾干沉淀；(9)用O．5ml的高盐TE溶解沉淀，加入20ulRnaseA(10mg，m1)，37℃作用2h；(10)加入等体积的Tris饱和酚，摇动lOmin，充分混匀；(11)15000r／min离心15rnin，取上清；(12)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，摇动10min，充分混匀；(13)15000r／min离心15min，取上清；(14)重复(12)一次；(15)15000“min离心15miIl，取上清；(16)加入2倍体积的无水乙醇，混匀，将沉淀转入1．5ml离心管，用70％的乙醇洗沉淀一次，12000r／min离心5min；26 实验方法(17)去上清，晾干，溶于0-3～O．5mlddH20，用uv-4000型分光光度计分别测定260mn、280砌的光吸收值，检测DNA浓度并求出DNA纯度，一20℃保存备用。3．6．3探针的制各、回收与纯化3．6．3．1酶切质粒制备探针用劢DI酶切质粒pGLB—gD制备探针，反应体系如下：ddH2022．5¨lBuffbrR-十。5．0LLlpGLB—gD20．0肛lXhoI2．5u1Vt50ul混匀，于37℃保温箱保温2h。然后电泳分离1．2kb的gD基因。3．6．3．2DNA片段的回收与纯化根据E．Z．NA@GeIExⅡactionKit说明书纯化回收目的片段，具体方法如下：(1)用新鲜配置的1×TAE溶液电泳，DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，在长波紫外光下切取目的片段(注意：所含凝胶越少越好。)；(2)加3～4倍胶体积的BmdingBu跪r，55℃～65℃温育直至胶完全溶解；(3)将胶溶液加入DNA柱中，12000r／min离心lIIlin；(4)加750¨1wjShBu自fer，静置2～3min，12000r／min离心1min，弃除溶液；(5)再加750ulwishBu腩r，静置2～3m血，12000r／IIlin离心1min，弃除溶液：(6)12000r／min离心1min，(7)加30ulElutionBu旋r，12000r／min离心lmin，收集DNA溶液。到此，就得到纯化的gD基因探针。 实验方法3．7转化植株的分子检测3．7．1转基因烟草植株的分子鉴定3．7．1．1PcR鉴定利用设计好的一对特异性引物对转基因烟草植株进行初步鉴定，反应体系如下：DNAO．5ullO×bufrer5ulMgCl2(25mm01／L)3}IlP1(50mmol几)O．5LllP2(50mmol凡)O．5uldNTPs(10mm01／L)1肛l1砷(5U，p1)O．5肚lH2039U1Vt50u198℃预变性5min后加DNA聚合酶0．5ul，循环参数为95℃1min，60．5℃1min，72℃1mill，35个循环后，72℃延伸lOmin。全部反应结束后取5“1PCR产物电泳检测。3．7．1．2Southem印迹杂交(1)转膜①取10扯g植物基因组DNA样品，加入相应的限制性内切酶，37℃酶切过夜：②加样于O．8％琼脂糖凝胶(无EB)，电泳过夜，电压降为1V／cm，电泳缓冲液为TAE；③电泳结束后，EB染色，拍照检查酶切及电泳结果；④切去凝胶多余的部分，在O．2mol／LHcl中处理30min；⑤自来水冲洗两次，加入变性液浸没凝胶并不断摇动，处理45min；⑥自来水冲洗，换入中和液中处理30min，换一次中和液继续处理15min；⑦剪一张与凝胶一样大小的尼龙膜Hybondl’M-N(Amersham公司)和两张3MM的滤纸，在1×TAE溶液中充分浸泡。⑧中和后的凝胶与尼龙膜紧贴，中间不能有气泡，凝胶与尼龙膜外侧各贴一张准备好 实验方法的滤纸，然后将此体系夹在多空的支持夹中，固定在电泳槽中，尼龙膜放在正极侧，凝胶放在负极侧，浸泡在l×TAE溶液中。4℃，300～600InA恒流电泳4～8h。⑨通过电转仪把DNA印迹到尼龙膜，转移缓冲液为l×TAE；⑩转移完成后在尼龙膜上做好标记，用6×sSc清洗尼龙膜，室温晾干，80℃烘箱处理2h，各用；(2)DIG标记探针根据试剂盒说明书操作，具体步骤如下：①用砌D1酶切质粒pGLB—gD，回收纯化目的片段(约1．2kb)；②加1肛g回收的研qA，用ddH20稀释至终体积15“l；③DNA溶液在沸水中煮10min，迅速置于冰上冷却，使DNA充分辨性；④将下列试剂加入到刚变性的DNA中：2p110×HexanucleotideMix，2斗1dNTPsLabelingMix，1“lⅪenowenzymelabelmggrade，混匀，快速离心，37℃温育1～20h；⑤加入2plO．2mol／LEDTA(pH8．0)，终止反应。(3)杂交①将适量体积(20瑚“100锄2膜)的DIGEasyHyb(购自Ibche公司)预热至杂交温度(54℃)，预杂交60mm，平缓摇动；②DIG标记的DNA探针在沸水中煮5min，迅速置于冰上冷却；③将变性的DIG标记探针加入到已预热的DIGEasyHyb溶液中，小心混匀，避免产生气泡；④倒掉预杂交液，加入探针／DIGEasyHyb混合液，在杂交温度(54℃)中平缓摇动，杂交过夜。(4)洗膜显色①杂交后，15～25℃，用大量的2×ssc、O．1％sDs洗膜2次，每次5min，然后再用washingbug．er洗膜1～5min；②用100mlBlockingbu髓r，室温温育30min；③加入20mlAntjbodysolution，室温温育30min；④100mlw驰hingbu＆r室温沈膜2次，每次15min；⑤用20mlDetectionbu腩r平衡2～5min：⑥用10rnl新鲜配置的c010rsubstrates01ution室温避光温育，一般在16h后显色将完29 实验方法成⑦当带的颜色深度达到要求时，用50InlddH20洗膜5min，终止反应。3．7．1．3烟草叶蛋白的提取参考TadkaberI_y的方法‘169】并适当改进，具体步骤如下：(1)称取烟草叶59，加液氮研磨成粉末状；(2)加入10m1烟草叶蛋白提取缓冲液；(3)冰浴过夜；(4)4℃，4000r／min离心20min：(5)取上清至另一离心管，4℃，10000r／min离心20min：(6)取上清，取30¨l上清液与30¨l2×sDS加样Bu恐r混匀，煮沸3min，进行sDs．PAGE电泳检测；其余上清存于．80℃备用。3．7．1．4SDS．PAGE电泳(1)配制10％分离胶，灌胶，室温静置待聚合(约30min)：(2)配制5％积层胶，用去离子水冲洗分离胶顶部，吸干水分，灌注积层胶，立即插入干净的加样梳子，室温放置待聚合(约30mm)；(3)拔去梳子，用去离子水冲洗加样曹，把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加适量Tris．甘氨酸电泳缓冲液；(4)上样，在80V电压下电泳，当燃料进入到分离胶时，加压到120v，直至溴酚蓝到达分离胶底部：(5)停止电泳，取出凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中染色1h以上，脱色，观察结果。3．7．1．5westem．blotting杂交(1)sDs．PAGE电泳结束后，切取所需凝胶：(2)安装转移装置，在石墨板上依次叠加3张滤纸，Nc膜，凝胶和3张滤纸，每加一层均需挤压排出气泡；(3)按凝胶面积0．65mA／cm2接通电源，4℃电转移2h：(4)取出Nc膜，叨去左下角作标记，放入杂交袋，按O．1m№In2的量加入封闭液，平缓摇动，室温温育2h或4℃过夜；(5)弃去封闭液，按O．1ml／cm2的量加入用封闭液稀释的血清(1：100)，37℃温育2h：30 实验方法(6)去封闭液和一抗，用TBST漂洗NC膜3次，每次10min；(7)将Nc膜放入新的杂交袋，按0．1ml／cm2的量加入用TBsT稀释的二抗(1：1000)，37℃温育lh；(8)去二抗，用TBsT漂洗Nc膜2次，再用TBS漂洗两次；(9)将Nc膜转移至新鲜配制的底物液中，轻轻摇动，观察反应结果，蛋白带颜色深度达到要求后，用蒸馏水略为漂洗，终止反应，立即拍照。3。7．2转基因玉米植株的分子鉴定3．7．2．1DNA点杂交(1)剪取适合点膜器大小的尼龙膜，浸于ddH20中，湿润透后在20×Ssc中浸泡约30min：(2)将点膜器用O，1N的NaClH浸泡后，用d积20冲洗3～4次；(3)剪取两张同尼龙膜大小相同的滤纸，用20×ssc湿润后分别放在点膜器的上下两部分：(4)将尼龙膜紧贴于上部滤纸，小心排出气泡，组装好点膜器，接通真空抽气机；(5)样品处理：取DNAlO“l(5斗g)．加10扯lO．4mol／L的NaoH混匀，37℃变性10min，加入20“120xSSc中；(6)在加样孔中加满10×Ssc，真空抽滤，使所有液体初级抽干，关闭真空抽气机；(7)将样品加在上样孔中，抽滤，等样品抽干后，用10×SSC洗孔两次，抽干液体；(8)取出尼龙膜，在2×SSC中短暂漂洗去盐；(9)将膜置于两张滤纸之间，室温晾干；(10)于80℃烘箱中烤膜1～2h后取出，用保鲜膜包裹备用。3．7．2．2Southem印迹杂交(Southern．bIottinghybridizati蛐)转膜方法同3．7．1．2(1)3．7．2．3DNA探针标记采用随机引物DNA标记系统，根据试剂盒说明书进行。具体操作程序为：(1)用XhoI酶切质粒pGLB—gD，回收纯化目的片断(约1．2kb)；(2)取25ng回收的DNA，加入无菌双蒸水至总体积为25ul；(3)于100℃水浴中变性5min，立即放于冰上5min，使探针DNA充分变性3l 实验方法(4)加入dATP、dGTP和dTTP(浓度分别为O．5mmol几)各2山；(5)加入Prirnersmixl5“l，a-32P．dCTP3“l(10uci，p1)(北京福瑞公司)(6)加入2“lⅪenowf_mgment(5u／肛1)，混匀，于25℃温育1～3h。(7)加入3“lO．2m01／LEDTA(pH8．O)，终止反应。3．7．2．4杂交(1)将准备好的尼龙膜在6xSSC中浸泡2min，转入预杂交液中，于68℃保温2～4h：(2)将标记的放射性探针于i00℃水浴中变性5min，立即放于冰上，5min后把浚探针加入到预杂交液中，盖好杂交瓶盖，继续在68℃保温16～18h。3．7．2．5洗膜与压x胶片杂交结束后，取出杂交膜，按下列方法洗膜：(1)2×SSC、0．5％sDS液，洗膜5min(室温)，重复两次(2)1×SSC、0．1％SDS液，68℃洗膜15miIl；(3)O．1×ssc、0，1％sDs液，于68℃洗膜15min；(4)在O．1×SSC液中稍漂洗(室温)，取出滤膜，用吸水纸吸去多余的液体，然后用保鲜膜包裹；(5)压X光片，于一80℃进行放射自显影。32 结果及分析4结果及分析4．1质粒pGLB—gD酶切结果酶切结束后，分别取0．5“l质粒pGLB．gD、0．5“l空载质粒pGLB和5¨1分子量标准参照物进行电泳，结果显示：质粒pGLB．gD被切成两个片段，其中的小片段为1．2kb，而对照(相应的空载)未被切开，这表明外源gD基因被切下(见图3)。4．2gD基因在烟草中的转化与表达图3质粒pGLB—gD酶切鉴定Fig．3Res缸ction趾alysisofpGLB·gD1．100bpladder2．质粒pGLB—gD3．空载质粒pGLB4．2．1筛选压力的建立与转基因烟草植株的获得在烟草转化筛选之前，利用Om∥L、1mg／L、3mg几、5mg几和lomg／L等5个basta浓度，观察末转化烟草对筛选标记basta的敏感性。15d以后，发现没有加basta的培养基中，烟草叶圆片四周有大量幼芽长出，长势茂盛；1m班的培养基中烟草叶圆片四周有少量长出，长势很弱；其他3个浓度的烟草叶圆片枯萎，没有任何叶芽。因此，将选择标记的浓度定在3mg几的水平上。按照3．5．1和3．5．3．1中介绍的方法，获得转基因烟草植株共168株(见图版1)。4．2．2转基因烟草的PCR鉴定应用PRVgD基因内部特异性引物Pl、P2，以烟草基因组DNA为模板进行PcR扩增。结果表明，转基因植株27、57、59能扩增出特异性目的带，大小与一重组质粒pGLB唱D为模板的阳性对照一致，非转基因烟草未能扩增出任何条带(见图4)。初步表明外源基因已整合到烟草植株27、57、59基因组中。33 结果及分析图4转基因烟草PCR检测结果Fig．4Rcsunof衄lsgeIlictobaccopl趾tsbyPcR锄plicationM：100bpladderCK+：阳性对照(pGLB-gD)质粒CK-：阴性对照(非转化植株)4．2．3转基因烟草的PcR-Southern杂交检测为了进一步确证gD基因已经整合到烟草基因组中，以烟草基因组DNA为模板，用引物PI、P2进行PcR扩增，然后电泳和转膜，同时设计两个对照：以重组质粒pGLB—gD为模板作为阳性对照，以非转基因烟草基因组DNA为模板作阴性对照。用地高辛标记的全长gD基因作探针进行sou也em杂交。杂交结果显示，阳性对照(质粒)和转基因植株18、27、57、58、59出现了明显的带，而阴性对照(非转基因烟草)和转基因烟草42、60未出现带(见图5)，进一步确认gD基因已整合到转基因烟草18、27、57、58、59的基因组中。图5转基因烟草PCR-Soutb锄杂交结果Fig．5也eidentificationoftraIlsgenictobaccobySOuthenl_blomngC一：negatiVecomr01C+：positivecon仃ol18、27、42、57、58、59、60：transgenictobaccos34 结果及分析4．2．4烟草叶蛋白SDs—PAGE及western-blotting分析提取烟草叶蛋白，进行sDS—PAGE电泳、转膜。以PRv高免血清为一抗，HRP标记的山羊抗猪IgG为二抗进行Westemblotting分析，DAB底物显色后，转基因植株18、27、57、58在43kD与66kD之间出现一特异性蛋白带，其分子量与理论分子量44．45KD相符；而作为阴性对照的非转基因烟草未出现任何条带(见图6)，说明外源基因gD在转基因烟草中得到了正确表达。图6转基因烟草Wjstem—blo埘ng杂交结果Fig．6Anal”isof咖sgellictobaccoplantsbywestemb10niIlg．M：ProteinMarkerC：negativeco地Dl18、27、57、58、59：transgenictobaccos4．3甜玉米的转基因研究4．3．1根癌农杆菌浓度对转化率的影响农杆菌LBA4404振荡培养至菌夜的OD600值达到O．5和2．O时，使菌体的浓度分别为O．3、O．6、1．0，浸染后，经共培养、恢复性培养和抗性愈伤组织筛选等过程，抗性愈伤组织形成频率见表2和表3。从表2看出，原菌液浓度在OD600值为0．5，感染浓度为O．3时，转化效率最高，抗性愈伤组织形成频率为24．6％：从表3的分析结果看，菌液原始浓度对抗性愈伤组织形成频率影响差异极显著，感染浓度对形成频率差异也极显著，而菌液原始浓度和感染浓度对形成频率影响差异显著。如果农杆菌过度生长，到对数期以后，其感染幼胚的能力显著下降，即使感染菌液的浓度调整到最适水平，其转化效率也显著下降，转化率下降到6．8％。35 结果及分析4．3．2共培养时间与温度对转化效率的影响在农杆菌原菌液浓度和感染浓度分别为0D6000．5和0．3的条件下，设定了22℃、25℃和28℃3个温度，每个温度设定了1d、2d和3d共培养时间，分别统计形成抗性愈伤组织的幼胚的频率。试验结果显示：在共培养时间为3d时，共培养温度22℃下的转化效率最高，形成抗性愈伤组织幼胚的频率为24．6％：共培养温度在25℃时，转化效率略有下降，频率为21．3％；当共培养温度在28℃时，转化效率明显下降，频率仅为3．1％，并且农杆菌生长旺盛，幼胚的生长受到抑制，在随后的抗性愈伤组织筛选培养中，农杆菌的去处也比较困难。在共培养温度为22℃和25℃下，一转化效率随着共培养时间的延长，转化效率有提高的趋势。表2农杆菌菌液原始浓度、感染浓度对转化效率的影响Table2E虢ctsof剐grobacteriuIlltumc‰iensoriginaJdcnsnya11dinfectiondeIlsityontmsformationmte表3农杆菌菌液原始浓度、感染浓度对转化效率的方差分析T曲1e3varianceanalysisofagrobacteriumtullle￡lciensoriginaldensity锄dinfbctionde璐ityontrallsfomationr砒e36 结果及分柝4．3．3转基因植株的获得，转化超甜玉米幼胚，在筛选和继代过程中，大多数愈伤组织成水浸状，进而褐化和死亡。只有少数愈伤组织经过7～9周的筛选可以继续分裂，经诱导再生植株(见图版2)。由于玉米胚性愈伤组织不断向非胚性化转换，有一部分转化的愈伤组织失去了再生能力，所以，随着继代时间的延长，转化频率越来越低。本研究所采用的质粒较大，共转化6批次，再生苗11个株系，抗性愈伤组织的成苗率为10．1％左右。再生植株移栽大田后可以正常发育(见图版3)，但也有些植株发育出现异常，包括顶端出现雌穗、雌雄花期不遇等，可以通过与其他植株杂交，其后代的表现恢复正常。4．3．4转基因玉米植株的点杂交分析取待测玉米总DNA5陷、负对照DNA5岭、正对照质粒15pg，碱变性：组装好点膜器；将已经变性过的DNA全部点样于尼龙膜上，于800C烘箱内烘2h。随机引物法制各a．”PdcTP标记的DNA探针，用标记的gD基因做探针进行soumem点杂交，杂交结果显示在筛选获得的84株抗性植株中有38株出现较强的杂交信号，而其余的大部分与负对照一致没有任何杂交信号，个别的出现很弱的杂交信号，部分检测结果见图7。图7转基因玉米点杂交分析Fig．7Amlysisofmetl獬gellicplantsbydot-blottirlgcK+：阳性对照(pGLB．gD)；cK一：阴性对照(非转基因植株)：Ol、02、03、04⋯⋯14、15、16为转基因植株4．3．5转基因玉米的Southern印迹分析肋DI单酶切质粒pGLB-gD，电泳回收1．2kb的gD基因，用Ⅱ．32PdCTP进行标记。将Southem点杂交为阳性的植株总DNA(10¨曲、末转化植株总DNA(10“g)和质粒pGLB—Gd(25pg)分别用砑DI和EcDRI双酶切，电泳后凝胶变性，电转移至尼龙膜上。以标记的gD基因为探针进行southem印迹分析，部分检测结果见图8。图中编号为02、03、05、06、09、13、16的再生植株中出现了与阳性对照一致的杂交带，而编号为01、14的37 结果及分析再生植株同负对照一致没有出现杂交带。结果表明gD基因已整合进编号为02、03、05、06、09、13、16的再生植株中，而01、14的再生植株是Soutllenl点杂交的假阳性结果。到此可以确认，本实验获得了转基因的玉米植株，southem印迹共检测出23株呈阳性，转化率为2．9％。图8转基因玉米Southem印迹分析Fig．8Southem_blotting趾alysisofmetransgellicplaIltscK+；阳性对照(pGLB—gDⅨhoI+EcoRI)cK：阴性对照(非转基因植株)叭、02、03、05、06、09、13、14、16为转基因植株。 讨论5讨论随着植物基因工程技术的快速发展，利用植物作为反应器生产可食(饲)用植物疫苗成为近年研究的热点。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的一种分布广、危害严重的急性传染病，给世界的养猪业造成巨大的经济损失‘1701。猪伪狂犬病毒gD基因表达的糖蛋白对猪伪狂犬病具有很好的免疫原性，是预防猪伪狂犬病的理想免疫蛋白【1711。本研究首次以烟草和玉米为受体材料，进行了gD基因转化植物及表达的研究。5．1gD基因转化烟草的研究一烟草作为组织培养的模式植物在转基因植物的研究中得到广泛的应用。本研究也采用烟草作为猪伪狂犬病毒糖蛋白保护性抗原gD基因的受体材料，利用根癌农杆菌介导法转化烟草叶肉细胞，获得了转gD基因的烟草植株。PCR扩增和PCR-Somh锄杂交检测证实gD基因己整合到烟草基因组中；westem杂交分析表明gD基因在烟草中正确表达，这不仅为伪狂犬病转基因植物可饲疫苗的深入研究奠定了基础，还为其他动物病毒转基因植物可饲疫苗的研究提供了有益的借鉴。在分子检测中，PcR-soutllem杂交结果确认gD基因已整合到转基因烟草18、27、57、58、59中，然而用PCR方法捡测转基因烟草时，转基因烟草植株27、57、59扩增出了目的带，转基因烟草植株18、58未能扩增出目的带，可能原因是烟草基因组比较复杂，影响了gD基因的扩增，此外DNA的纯度对PCR也有影响。虽然PCR．Soumem杂交结果确认了gD基因已整合到转基因烟草59中，但在westem-bloning结果中转基因烟草59并未出现明显的特异条带，是否gD基因在转基因烟草59中沉默或另有其他的原因，有待进一步的研究。所获得的转基因烟草植株长势良好，未见畸形植株的出现，这表明gD基因的转入并未明显影响烟草的生长发育。5．2gD基因转化玉米的研究玉米不同基因型对农杆菌介导转化的敏感性存在显著差异，目前农杆菌介导转化玉米研究仅在A188以及具有A88或B73遗传背景的玉米材料中取得较大成功‘"2。17引，本研究利用衣杆菌介导转化法在超甜玉米自交系中获得成功，对于超甜玉米的遗传工程改良研究将具有重要的推动作用，同时也大大拓宽了农杆菌介导转化单子叶植物(玉米)受体基因39 讨论型的范围。农杆菌介导幼胚的转化因材料和双元载体的差异，导致转化效率在5％～50％之问变化f"2‘1741。本研究的转化效率最高为24．6％，处于中间水平，这可能与本受体材料的基因型有关。以愈伤组织为受体进行转基因研究，要经过愈伤组织诱导、农杆菌感染愈伤组织、筛选抗性愈伤组织等过程，前后需要经过至少3轮筛选，时间为8～12周；经过长时间继代后，愈伤组织的再分化能力明显下降，对转基因效率的提高具有重要的影响。本研究采用幼胚作为基因转化的受体材料，由幼胚直接诱导抗性愈伤组织，省去了第一步诱导愈伤组织的过程。因此，以幼胚为转化受体诱导抗性克隆的方法与以愈伤组织为转化受体筛选抗性克隆的方法相比，前者的愈伤组织继代次数少，这不仅缩短了试验周期，而且也减少了因愈伤组织过多次数的继代对其再分化能力的影响。本研究首次利用玉米胚与胚乳特异表达启动子(GlobuIin．1)启动的PRVgD基因转化超甜玉米幼胚，所获得的再生苗中有一部分为畸形苗。这可能有两种原因造成，一是玉米通过长时间的组织培养产生的体细胞变异，使再生植株长成各种各样的畸形苗；二是外源基因插入位点的不同也可能导致转化植株的性状发生变异成为畸形苗。但生长状况良好的再生植株移栽大田后均能正常生长并可育，这说明插入位点恰当的gD基因对转基因玉米的生长发育并无明显的影响。本研究对转基因玉米檀株进行了DNA点杂交和soumemlbJo廿ing检测鉴定。从点杂交结果看，在84株抗性植株中只有38株出现明显的阳性杂交信号，而其余均表现为阴性，这可能是由于质粒没有整合进玉米基因组而以核外基因的方式进行表达的结果，也可能是因个体差异导致的个别组织(植株)对筛选压力的抗性。导致假阳性较高的原因，有待进一步研究。以植物作为反应器生产疫苗已有不少成功的例子，本研究利用玉米胚乳特异表达启动子表达外源基因，使外源PRV糖蛋白gD基因在玉米胚乳中特异高效表达，而在玉米的其他组织或器官低水平表达或者不表达【1751，这样使外源基因的产物既能在目标器官或组织富集而又不影响其他非目标器官或组织的生长发育。本研究在这方面做了尝试研究，为下一步的疫苗表达及攻毒实验奠定了基础。本研究的成功将为我国乃至整个世界猪伪狂犬病的防治起到极其重要的作用。 结论’1利用叶圆片法，通过根癌农杆菌介导法将PRv糖蛋白gD基因导入烟草叶肉细胞，经愈伤组织诱导、筛选、继代及再生，成功获得了转PRv糖蛋白gD基因植株。通过PcR分子标记、PcR_southem分子杂交确认gD基因整合进烟草基因组中，westem-blotting杂交证明外源基因在转基因烟草中正确表达。2研究了根癌农杆菌原菌液浓度及感染浓度对超甜玉米幼胚转化频率的影响，发现最佳浓度为：原菌液浓度OD600值O．5，感染浓度O-3时转化幼胚的频率最高。3研究了根癌农杆菌转化超甜玉米幼胚的共培养时间和共培养温度对转化效率的影响，结果发现最佳共培养时间为3天，最佳共培养温度为22℃。4利用根癌农杆菌介导法将PRV糖蛋白gD基因导入超甜玉米幼胚，经过抗性愈伤组织诱导、筛选以及继代、再生培养，最后成功获得转基因玉米植株，经SoutIlem斑点杂交、Southem印迹杂交，确认PRV糖蛋白gD基因成功整合进玉米基因组中。41 图版叶圆片法转化pGLB—gD质粒的转基因烟草Bast&筛选B矗s协《3mg／L)Bas铽3mg『L)第一轮筛选筛选。9’筛选⋯。‘第二轮筛选转基因烟草植株圈版l转基医烟草42 罔版转基因重米抗性愈伤组织继代转基因重米幼胚巾长出抗性愈伤组织转纂国重米抗性愈伤组织再乍植株圈版2转基因玉米愈伤组织诱导及植株再生 圈版转羲国玉米试管苗大田中的转基因玉米圈版3转基因玉米檀株44 参考文献[1】王关林．植物基因工程原理与技术[M】．科学出版社，1998，16l一178．[2阳einTM，WolfED，WuR，etal．High-velocitymicro一删ectilesfordeliveringnucleicacidsintolivingcells闭．Nature，1987，327(7)：70—73．【3】MccabeDemisE，SwainWilliamF，ManinellBriallJ，cta1．Stabletransfo肋ationofsoybeaIl(GlycineMax)bypanicleacceleration【J】．Bio厂recllllology，1988，6：923—926．[4】Gordon．K眦mWJ，SpencerTM，ManganoML，eta1．TraIlsfo肌ationofMaizeCellsandRegenerationofFeniIe1'r舭sgenicPlants【J]．PlantCell，1990，2(7)：603—618．[5】HadiMz，McMhllenMD，FillerJJ．Transfornlationof12di归融rremplasmidsimosoybeanviapamclebombardment【J]．PlantCellReporls，1996，15：500一505．[6】SimmondsDH，DonaldsonPA．Gen0幻，pescreellingforpmlifbrative锄bryogenesisandbiolistictransfomlationofshomseasonsoybeallgeno咖es[J】．Pl趾tCelIReports，2000，19：485—490．[7】安韩冰，朱祯．基因枪在植物遗传转化中的应用[J】．生物工程进展，1997，17(1)：18—25．【8】BretellR．S．BiotecllllologyandGeneticEn西neer堍【J】．Rc“ews，1995，13：315—334．[9】KrensF．A．，Molend司kL．，Wull锄sG．J．，eta1．如m廿Tmnsfo珊alionofPl舭tPr。toplastswithTi—PlasE【lidDNA[J】．Nature，1982，296：72—4．[10】王萍，王罡，季静，等．大豆转基因体系的研究进展[J】．遗传，2004，26(6)：969—976．[11】Ne岫rG，SpaflgenbergG，MmelstenScheidO，eta1．Tr趾sgeIlicrapeseedplantSobtainedbythemicfoiHjectionofDNAintomicrosporc-derivedembryoids【J】．TheorApplGenet，1987，75：30一36．[12】LIUBo—Lill，YUEShao-xiall，HUNai-Bi，eta1．TrallsferingresistanceagaillstAt晒ne鲫etochloroplastofsoybeanatldeXpressintra_IlsgenicsoybeaIlplants川．ScienceinChjlla(SeriesB)，1989，19(7)：699—705．[】3】傅荣昭，孙勇如，贾士荣．植物遗传转化手册fA幻．中国科学技术出版社，1995，3：9—11．[14】LIBa0一Jian，XUXin-Ping，SHIHe—Ping，eta1．Stlldyonintroducingexogenousgeneto4S 参考文献embryoofriceViaelec仃oprationaIldobtaining打a11sgenjcricepl姐tsEJ】．sienceincllina(SeriesB)，199l，21(3)：270～275．f15】Ⅵ，EBERG，MoNAJEMBASHISS，GREULICHKO，eta1．UptakeofDNAiflhloroplastsofBrassicanapus(L“)bymeansofamicrofocusedlaserbe锄【J1．EurJCellBio，1987，43：63．【16】TOPERR．，SCHELLJ，STEINBISHS．，eta1．Ve恻ileclo工liI培vectorsfortramsientgeneexpressiona11ddirectgenetraIlsferinplamcells阴．NucleicAcidsRes，1988，16：8725．【17]傅荣昭，曹光诚，马江生，等．用基因枪法将人工构建雄性不育基因导入小麦的研究初报[J】．遗传学报，1997，24(4)：358—361．【18】LuozhongxIlll，WuR．Asimplemethodforthc订ansfo衄ationofricevia吐1epollen．tubep拙way[J】．PlalltMolBioR印，1988，6(3)：165一174．【19】xIEDao·xin，FANYun-Lin，NIⅥ_n—chao，eta1．0btainingtransgeniccottonplantsbyintmducing肋cf，，淞加坩f增招船妇insecticidalcrystalproteinsgene【J】．scienceinChina(SeriesB)，199l，21(4)：367—373．口O】LIUDe-Pu，LIA0Lin，YUANⅥng，LⅣYu-Zhi．Gai曲塔ofsoybeaIllinesresistailttoSMVbyintroducingexogenousDNA【J】．SoyeaIlSciellce，1997，16(4)：277—282．【21】XUxian哥Ling，zOuLian-Pei，LIUWei-Hua，eta1．Aprelirninarystudyon订舭sfeningchitillasegencimosoybeans【J]．SoybeaIlSciencc，1999，18(2)：10l—108．[22】傅荣昭，孙勇如，贾士荣主编．植物遗传转化技术手册【M】．北京：中国科学技术出版‘社，1994，78—80．[23】程备久，田秋云．离子注入法导入外源DNA诱发棉花农艺性状变异的研究[J】．核农学报，1996，(3)：201—205．【24】许宁，赵南明．超声波诱导小麦幼胚基因转移四．自然科学进展——国家重点实验室通讯，1994，(4)：507—510．(25】徐春晖，夏光敏，贺晨霞．农杆菌转化系统研究进展【J】．生命科学，2002，14(4)：223—225．【26]Z枷bryshPC．Chromcles硒mtheAgmbacterium—plalltCell肼呵ATransferStory【J】．AruluRevPIamPhysioIPlamMoiBiol，1992，43：465—490．【27】陈丽梅，潘俊松，何欢乐，等．农杆菌介导的基因转化研究进展【J】．甘肃科学学报，2005，17(2)：61—63．46 至耋壅堕[28】HannyCL，Fitz—JamesPC，Can．TheprotemcrystalsofBacillusthuringiensisBerJiner[J】．CallJ．Micmbiol，1955，(1)：674—7lO．【29]夏敬源．美国棉花抗性育种概况[J】．棉花文摘，1992，7(1)：ll—14．f30]PerlakFJ，DeatonRW，A瑚strongRL，eta】．InsectfesimantcottonplaIlts四Bio／Tecllllology，1990，8：939—943．[3l】GasserCS，FraJeyRT．Geneticallyenginee血gplantsforcropimprovemem脚．Sciences，1989，244：1293—1299．【32】cousinSYL，LyonBR，LewellgnDj．Trans鼬TnationofanAuS廿alianc嘣oncultivar：prospectsfofcottonimpr0Vementt}啪u酿geneticen西neering川．AustraliallJo哪alofPlantPhysiology，1991，18：48l一494．[33】倪万潮，张震林，郭三堆．转基因抗虫棉的培育【J】．中国农业科学，1998，31(2)：8—13．[34j谢道昕，范云六，倪万潮，等．苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因导入棉花获得转基因植株[J]．中国科学(B)，1991，(4)：367—373．f35】JeDkinsJN，McCan)，JC，BuehIerRE，etal．Resistance“cot咖埘m6．endotoxingenesfromBacmusth晡n百ensisvaLhlrstakionsekctedLepidopteminsects[J】．A粤．onomyJo啪al，1997，89：768—780．[36]FroHunME，MofrishF，AmlstrongC，cta1．111heritaIlceandexpressionofchimaericgenesinmeprogenyoft饱11sgeIlicmaizeplants【J]，1990，8：833—839．【37】Gordon-K锄mWJ，SpencerTM，MaIlganoML，eta1．TransfonnationofMaizeCellsaIldRegenerationofFenileTraIlsgellicP1雒ts叨．Pl趴tCell，1990，2(7)：603—618．[38】丁群星，谢友菊，戴景瑞，等．用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米的研究[J】．中国科学(B辑)，1993，23(7)：707—713．[39l王国英，杜天兵，张宏，等．用基因枪将Bt毒蛋白基因转入玉米及转基因植株再生[J】中国科学(B辑)，1995，25(1)：225—229．[40】余迪求，王志国．玉米抗螟虫基因工程植株的获得和大田抗虫试验[J】．广东省遗传学研究，1992，199(5)：40～41．[41】梁小友．双抗表达载体的构建及番茄的转化鉴定【J]．植物学报，1994，36(11)：849—854．[42】徐香玲，高晶，刘伟华，等．Ti质粒介导的Bt、k．6内毒素蛋白基因转化大豆的初步47 参考文献研究[J】．大豆科学，】997，16(】)：6—11．【43]赵桂兰，刘艳芝，李俊波，等．影响农杆菌介导的大豆基因转化因素的研究【J]．大豆科学，2001，20(2)：84—88．【44]南相Fj，刘文萍，刘丽艳，等．PEG介导Bt基因转化大豆原生质体获得转基因植株【J]．大豆科学，1998，17(4)：326～329．f45】张保龙，倪万潮，李国锋，等．棉花高效多抗育种体系研究进展【J】．江苏农业科学，2000，(1)：24—27．【46】SmigockeA，EarleED，HoganPS，eta1．Transgenicplalltsforinsectresistance[J]．Theroleof廿ansgeIlicplants，1997，3：225—236．【47】JouaninJ，Bonade—BottinoM，Girardc，eta1．№lsgeIlicplalltsforinsectresistance【J]．PlantScience，1998，131：l—11．[48]HilderVA，Ga把houseAMR，sheem柚SE，咖1．Anovelmechanismofinsectresistanceengineeredintotobacco【J】．Nature，1987，330：160一163．[49】GatehouseAMR-PowellKS，PeumatlswJ，eta1．Insecticidalpropertiesofplantlectins：theirpotemialinplantprotection[J]．MolecularBiologyiIlCropProtection，1994，8：177—201．【50]郝贵霞，朱祯，朱之悌．豇豆胰蛋白酶抑制基因转化毛白杨的研究[J】．植物学报，1999，41(12)：1276—1283．[51】wangzhi-bin，Lixue。yong，Guosall一dui．Plamlectinsandanti—insectgeneticengineering[J】．BiotechnologyBulletin，1998，2：5一lO．【52】zhuYu，WuQiall，GaoYue—feng，eta1．CloningandsequcncingofsnowdroplectincDNAa11dcons廿uctionofplaIltexpressionvector【J】．JournalofAgricult啪lBiotec圭1110logy，1997，5：331—338．【53】GatehouseAMR，Da啊sonGM，NewellcA，eta1．1hnsgenicpotatoplaIltswimedhancedrcsistancetothetomatomoⅡl，厶2c4珂D6胁D膪，订cP口；gro、Ⅳthroomtrials【J]．MolecularBreeding，1997，3：49—64．[54】zhouY(周岩)，TianYc(田颖川)，wuB(吴标)，eta1．Illllibitione腩ctofTransgenictobaccoplantsexprcssmgSnowdmpLectinonThepopulationdcvel叩mentofMyzuspersicae[J】．C}linJBiotechnol(生物工程学报)，1998，14：13一19．[55】梁辉，朱银峰，朱祯，等．雪花莲凝集素基因转化小麦及转基因小麦抗蚜性研究[J]．遗4R 参考文献传学报，2004，31(2)：189一194．【56]T蛳jaH，schmer，eta1．MetagenomesofcoInplexMictobi8lconsortiaDe巾edfromdi疵rentSoilsasSollrcesforNoVelGenesConferringFomlationofC砷onyls行omShort—ChainPolyolson协c向删幽胁∞，f【J]．TiBtech，1998，16：168—175．【57]RyanCA．Proteinasainllibitorgenef抽ilies，s拄ategiesfortransfonIlationimpfoveplantdefenseagainstherbiVores【J】．Bio船says，1989，10(1)：20一26．【58】刘伟华，李文雄，胡尚连．基因枪法向小麦导入几丁质酶基因的研究[J]．西北植物学报，2003，23(1)；54—59．【59】吴家和，张献龙，罗晓丽，等．转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及黄萎病的抗性[J]．遗传学报，2004，31(2)：183—188．【60】ThomsJ．C，BagdadyNH，GerendasJ，eta1．neimpactofinsecticidesusedagainStnunmoth【J】．P1antPhysi01，1995，109：717—720．【61】林忠平。走向21世纪的植物分子生物学【M】．北京：科学出版社，2000，2(1)：131—445．[62】BeachyRN，Loesch—friesS，11umerNE．Coatprotein_mediatedrcsistarlceagainstviruSinfection啊．A姐RevPhytoPhthol，1990，28：45l一474．[63】张海燕，陈正华．获得病毒抗性的植物基因工程策略及其抗病机理研究进展[J】．武汉植物学研究，1997，17(增刊)：15—24．[64】TbchnerPEM，v{mMarleG，eta1．PlamstLansfomed埘thamuta眦alfalfamosaicvimscoatproteingeneareresistaIlttothemutalltbutnott0wildtypevirus【J]．Vimlogy，1994，203：269—276．[65】赵福宽，张鹤龄，郑用琏，等．外壳蛋白基因介导的植物抗病毒基因工程研究进展[J】．北京农学院学报，1997，12(2)：74～76．[66]邹新慧，何平．植物抗病毒基因工程研究进展及存在的问题【J]．江西农业学报，14(4)：59—65．【67】GolemboSkiDB，L眦onossofrGP，z删nM．P1antSlrallsfornled、vitllatobaccomosaicVimsnonstmcturalgenesequenceareresistanttothevims[J】．Pmc．Natl．Acad．Sci．USA．，1990，87(16)：6311—6315．[68】AnderSonTM．AdefectiVer印licasegeneinducesresistancet0cucumbermosaicvimsintmnsgeIlictobaccoplants【J】．Pmc．Natl．Sci．USA，，1992，89：8759—8763．49 参考文献[69]CarrJP，GaldnA，eta1．ReplicaSe-mediatcdresistancetocuc啪bermosaic“msintraJlsgenicplantsinVolvessuppressionofbomvirusreplicationintheinoculatedleavesandlongdistallcemoVemenl[J]．Ⅵm109y，1994，199：439—447．[70】LapidotM。，GaffeR．，DingB．，eta1．Adys如nctionalmowmentproteinoftobaccomosaicvirusthatpaniallymodmesthep1删odes眦诅甜ldlimitsvimsspreadin订aIlsgenicplants【J】．PlantJ，1993，2：959—970．【71】LodgeJK，K砌ewskiwK，eta1．Broad．sp舳vimsresist札cein眦IsgenicpI觚tsexpressingpokeweedantiViralproteiD[J】．Proc．Natl．Acad．Sci．USA．，1993，90；7089—7093．【72】KielIntopfM，EsquiVelEL，BrachMA，cta1．C1iIlicalapplicationsof抽。巧mes明．Lancet1995，345(8956)：1027—1031．[73】杨建华，王华林，于善谦，等．核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用嘲。复旦大学学报(自然科学版)，1998，37(4)：547—550。[74】赵志英，周鹏，曾宪松，等．核酶基因转化番木瓜的研究[J】．热带作物学报，1998，19(2)：20—25．[75]YieY，TienP．HighresistancetocucumbermosaicvimsconferredbysatelliteRNAaIldcoatpmteinjntrallsgeIliccommercmtobaccocultivarG一140Ⅲ．MolecularPlant．Microbelmefactions，1992，5(6)：460一465．[76】Lawsonc，KalliewskiW，HaleyL，eta1．Engineeredresi蛐lcetomixcdvinlsinfectioninacommercialpotatocultiVar：resistancetopotatovimsXaIldpotatovimsYintrans妒nicRussetBurbank叨．Biotechnology，1990，8：127—134．【77】HasIanlE．ThesjIil(imatepathway【M】．B埘envonhs，London，1974，133一136．[78】任不凡，曹淞僧．草苷膦及研究进展[J】．农药，1998，37(7)：l一8．【79]Ja、vorskiE．G．ModeofaotionofN·phosphono_Methylglycine：in瞌ionofaromatic锄inoacidbios”hesis[J]．J．Agric．Food．Chem，1972，(20)：1195一¨98．【80】PadgeneS。R．Aplicationtotheu11itedkingdomAdvjsoryCommi№eonNovelFoodsaIldPmcessesforReViewoftlleS疵tyofGlyphosateTole啊ntsoybeaJls[R】．111eA鲥culturalGroupofMonsatoCompanyMonsanto，EuropBmsselsBelgim，1994，13：130—133．【81]ZhouH．，ArrowsmithJ．w．，Fmmm，M．E，etal．Glyphosate—tole啪tCP4andGOX5n 参考文献genesasaselectableMarkerinnheattransfornlation[J]．plantcellReport，l995，15159—163．[82】KishoreGM．，BarryGF．Inhibitorsof锄inoacidbiosymhesis：st豫tegiesforimpaningglyphosatet01er肌cetocroppl趾ts【J】．Americ柚SocietyofPl趾tPhysiologiSts，1992，8：139．145．[83】Aleja11dmM，PenalozaL，cta1．ExpressionofmehygromicinBphosphotrasferaSegeneconferstolemcetotheherbicide91)，phosate【J】．plamcellRepon，l995，(14)：482—487．[84】Fi魄ibbonJE，BraymerHD．IsolationaIIdcloningofagene(igrA)、viththeabilityofconfcrtoleranceforglyphosate，ApplAndEuv曲n[J】．Microbiol，1990，(56)：3382—3388．[85】黄建中．农田杂草抗药性【M】．中国农业出版社，1995，233—237．[86】贾士荣．转基因植物食品中标记基因的安全性评价【J】．中国农业科学，1997，30(2)：l一15．[87]苏少泉．除草剂作用机制的生物化学与生物技术的应用[J】．生物工程进展，1993，14(2)：30—34．[88】TachibanaK，WatallabeT，SekizawaT，eta1．ActionmechallismofbialaphosII．Accumulationof黜0niampl姐tstfeatedwi也bialaphos嘲．J．Pest．Sk．，1986，(11)：33—37．[89】ThompsonCJ．Ck唧lcterizationoftheherbicideresistancegenebarfbmStreptomyceshygroscopicus【J】．EMBOJ，1987，(6)：2519—2523．[90】whiteJ．ACassettecontainingtlleb8rgeneofs仃eptomyceshygmscopicus：aselectableMarkerforplanttransfonIlation【J]．NucleicAcidsRes，1990，(18)：1062一1065．【91]wbhllebenw．NucleotideSequenceofPhosphjnot肺cin-N-acetyltmsferasegenef如mstretom”esviridoc}lromogenesTueH94arditsexprcssioninNicoti肌atabac哪叨．Gene，1988，(70)：25～37．【92】Patem．Inpna芏12en、virksamesResistengengegenphosphinotllricinundseineVbnvendung【P】，Patentnumber：3701623，7—11．[93】LeemansJ，DebolckM，}IalluinK，eta1．Theuseofglufosinate0．5aselectiVeherbicideongeneticallyengineeredresistallttobaccopl￡IIlt[J】．BCPCpublicatious．Proc．Brit．51 参考文献Cropprotectionconfweeds，1987，6：867—870．[94]EliseuS，FigueimFimo，LucioF，eta1．Tra壬lsfo嘲ationofpototo(solanumfubemsum)CV_MaIltigueimusingAgmbacterimtumcfaciensalldevaIuationofherbicideResiStance[J]．P】3ntcellR印orts，】994，(13)：666—670．【95】JunCao，XiaolallDuan，davidEcElroy，eta1．RegenerationofherbicideresistanttransgellicriceplaIltsfollowingMicroprojectilc—mediatedtansf0珊adonofsuspensionCultureCen[J】．P1antCellReports，1992，(11)：586—591．【96】Ak咖aK，PuchtaH，HohB．EmciemAgmbacterium—mediatedtransfo衄ationofArabidopsisthaIianausing，mebargeneasselectablemarker[J】．PlantCellR印ort，1995，(14)：450—454．[97】张晓东，李冬酶，徐文英，等．用基因枪将除草剂BaSta抗性基因与小麦HMw谷蛋白亚基基因导入小麦获得转基因植株【J】．华北农学报，1997，12(1)：133一136．【98]HaughnGw．T‰sfomlation谢thamutantArab讨opsisacetolactateSyn也asegene∞nderstobaccoresis切m“oSulfollylu聆aherbicides【J]．MoLGen．Genet，1988，(211)：266—271．[99】SmimJ．K．，SchlossJ．V，MazurB．J．．Fuac村onalexpressionofplantacetolactatesyllmasegeneinEscherichiac01i[J]．Proc．Nau．Acad．SCl．USA，1989，9(6)：123—126．[100】朱立煌，胡乃璧，翟文学，等．龙葵阿特拉津抗性生物型的鉴定和阿特拉津抗性基因的克隆[J】-遗传学报，1986，13(6)：403—4lO．[101]朱立煌，胡乃璧，翟文学，等．龙葵叶绿体的阿特拉津抗性其因psbA的核苷酸序列及有关分析【J】．遗传学报，1989，16(5)：381—388．[102】ShiotaN．Herbicide—Resistailt廿ansgenicTabaccoplaIltsexpressingCyPIAⅣP450ReductaseFusedEnzyme[J】．Pest．Sci，1995，(44)：83—84．【103】SlliotaN．．Herbicide-resistanttobaccoplantSexpressir培tllefhsedenzymebetweenratcytochromeP450IAIardyeastNADPH-C”ochromeP450oxidoreductase[J]．Plamphysiol，1994，(107)：866—873。【104]SakakiT．，JianG，eta1．鼬neticstudiesonageneticallyengineeredFusedEnZymeBetweenRatc”oc量lro眦P450IAlaIldye髂tNADPH·P450Reductase[J】-Biochemis仃y，1994，(33)：4933—4939．[105】ShiotaN．，HomanL，eta1．MetabolismoftheHerbicidechlortoluronintransgenic52 参考文献TbaccopIantsexpressingⅡ1eFusedE11zymebetw优nRatCytochmmeP450IAIandyeastNADPH-CytochromeP450oxido-reductaSe【J】．Pest．Biochem．Physi，1996，(54))：190—198．[106]FischerR，EmansN．Molecul8rfhmlingofphamlaceuticalproteins【J]．TrallsgenicResearch，2000，9：279—299．【107】S硒monsPC，Dekk髓BM，SchrammeijirB，eta1．ProductionofcoHedlyprocessedhu士11ansemmalb啪inintmsgenicplants陬Bio瓜chnol，1990，8：217—221．[108]GAOYuan，SuOGuangli，HANJin，eta1．ExpressionofHmanofBMP一2geneindi腩remtissuesoftobaccoplants【J]．ActaGen鲥caS血ica，2006，33(1)：56—52．[109]Mo舳tAS．Explomg廿趾sgenicpl姐tsasanewvaccinesource【J】．Science，1995，268，(5)：658—660．[1106】李轶女，胡英考，沈桂芳．转基因植物基因工程疫苗[J】．生物技术通报，2002，(3)：1l—15．[11l】李枞，宋艳茹．新的生物反应器——转基因植物[J】．生物技术通报，1998，(5)：52—57．(112】孔桂美．应用植物表达系统生产疫苗的研究概况【J】．生物技术通报，2002，13(3)：226—227．【113】汪开治．利用转基因植物生产生物药[J】．生物技术通报，2001，(5)：36—40．[114】茅海燕，方平楚，等．利用转基因植物作为疫苗生产系统的研究进展[J]．浙江大学学报(医学版)，2003，32(1)：77—81．[1l5】BirchRG．Plant打ansfomlation：Pmblemandstra把giesforpractical印plication【J】．AIlnuR删Physi01PlamMol|Bi01．，1997，48：294—297．[116]TkketCO，MasonHS．Areviewoforalvaccinationwimtmnsgenicvegetables[J】．MicrobesInfjct，1999，1(10)：777—783．【117】ThaIl“alaY，YhgYF，LyonsP，eta1．Immullogenic时of计a11sgenicplant-derivedhepatitisBsurfaceaIltige[J】．Pmc．Natl．Acak．Sci．USA．，1995，92：3358—3361．[118】MasonHS，Man—kitLamD，A皿屹enCJ．Expressionofh印atmsBsurfacea11tigenjntraIlsgenicplant[J】．ProcnatlAcadSciUSA，1992，89(24)：11745—11749．【119]凡lpustaJ，ModelskaA，FiglerowiczM，eta1．Aplant—derivedediblevaccineagainsthepaIitisBVims【J】．FASEBJ，1999，13：1796一1799．E1 参考文献[120】RichterLJ，ThallavalaY，AmtzenCJ，eta1．ProductionofhepatitisBsurfheatlt培enin仃arIsgenicplantsfororalimmunization[J】．NatureBiotechn01，2000，18(11)：1167—1171．【121】ArakawaT，ChongD．K．x．，Lan毋idgeW}LR．，eta1．E师cacyofafoodplant-basedomichoieratoxj工lBsubunitVaccine(J】．Nat．Biotechnol，1998，16：934—938．[122J王凌健，倪迪安，陈永宁，等．利用转基因胡萝h表达肺结核疫苗【J】．植物学报，200l，43(2)：132—137．[123]HaqTA，MasonHs，ClementsJD，eta1．OralimmuIlizationwitharecombinantbacterialantigenproducedintransgenicplams【J]．Science，1995，268：714—716．【124】11acketCO，MasonHS，LosonskyG，eta王．Immunogenic姆inh啪ansofarecombinantbacterialantigendeliVeredinatrazlsgenicpotato【J】．NatureMedicinc，1998，4(5)：607—609．[125]MasonHS，HaqTA．EdiblevaccineprotectsagainstEscb酬cbiac01iheat一1abileentemtoxin(LT)：po扭toeseXpressingasynⅡleticLT-Bgene[J】．vaccine，1998，16(13)：1336—1343．[126]M嬲onHS，BallJ，SmJ，eta1．ExpressionofnorwalkVimscapsidpmteinintraIlsgenictobaccoa11dpotatoanditsomliIIlmunogcnicityinmiceⅢ．ProcNatlAcadScjUSA，1996，93：5340一5353．[127]TacketC0，MaSonHS，LosonskyG，eta1．HuⅡlallinun吼erespoflsest0anovelNo九valkVimsVaccinedeliVeredinn：ansgenicpotatoes【J]．JInfcctDis，2000，182(1)：302—305．【128]ModelskaA，DietzscholdB，SleyshN，etal．Immullizationagainstralbieswimplantderivedantigen【J】．ProcNatlAcadSciUSA，1998，95(5)：2481—2485．【129】TackabenyES，DudaniAK，PriorF，eta1．Developmentofbiopllamaceuticalsinplantexprcssionandimmunologicalreactivi毋ofhurnanc”omegalvinlsglycoproteinBinseedsoftraIlsgenictobacco[J]．Vaccine，1999，17(23．24)：3020—3029．[130]Yu，J．，LaIl西dge，W．H．R．．Aplallt-baSedmulticomponentvaccinepmtectsmicefbmentericdiseases【J】．Nat．Biotechnol，2002，9(“)：548—552．【131]HuangZ，Dr)，I，WebsterD，eta1．Plant—derivedmeaslesvimshema991utininproteininducesneutralizingantibodiesinmice阴．Vaccine，2000，19：2163—2173．54 参考文献[132】BelangerH，FlayshN，CoxS，eta1．Humanrespimtorysync”ialVimsvaccineant噜enproducedinplant[J】．FASEBJ，2000，14(14)：2323～2328．[133】SandhuJS，心amyanskiSF，DominerLL，eta1．0ralimmunizationofmice、vi山transge血ctomato如uitexpressingrespiratorysync”ialvims—Fpro把ininducesasystemicimmuneresponse[J】．TrallsgenicRes，2000，9(2)：127一135．【134】MaJK，Hia钍A，HeinM，eta1．Generationandassemblyofsecretoryat】tibodies证plallts(J】．Science，1995，286(521j)：716—719．【135】GomezN，WigdomVitzA，CastanonS，eta1．OralimmunogeIlicityoftheplantderivedspikepmteinfrDmswine’订a11smissiblegastroenteritiscoroIlavims[J】．Archviml，2000，145(8)：1725—1732．[136】CastailonS，ManinMS，Manin-A10nsoJM，eta1．Immuniz“onpotatoplamexpressingVP60proteinprotectsagainstrabbithemorrhagicdiseasevirus【J】．JⅥr01，1999，73(5)：4452—4455．[137】Lee，R．WH．，Strommer'J．，Ho姑ins，D．，eta1．TowardsdevclopmemofailediblcvaccifleagainstboVineprleumonicpasteurellosisusing批msgeIlicwhitec10verexprcssinga埘a门肝厅口fm胁厅口F坍Df州c口A1leukotoxin50fusionprotein【J]．InfectImmun，200l，69(9)：5786—5793．[138】Wigdorov“zA，Carrilloc，DusS舭tosMJ，eta1．ProtectionofmiceagainstcMlenge州thfoodaIldmoumvimsbyitll-nlunizationwithfoliarextractsf如mplantsinfected州mrecombinanttobaccomosaicvinlsexpressingmeFMDVstrIlcturalproteinVP【J]．Ⅵrology，1999，255(2)：347—353．[139】LiuZZ，、)l恤gJL，Huangx，eta1IThepmmoterofarice出ycine—richproteingene(osgrp一2)confersVascular-specincexpressioninn’ansgenicplants[【J】．Pl。mds，2003，21(9)}324—833．[140]付顺华．植物转基因研究进展【J]．云南林业科技，2003，(1)：69—74．[141]ShaulO，GaliliG．ConcertedregulationofIysineandsynthesisintobaccoplantseXpressingbacteriaJfeedback—insensitiveaspanatekillaseanddihydrodipicolinatesynthase[J】．P1amMolBi01，1993，23：759—768．【142]FalcoSC，GuidaT，LocheM，eta1．Transgeniccanolaandsoybeanseeds“t11increasedlysine[J】．Bio／Thechnology，1995，13：577—582．55 参考文献[143]ChenJQ．Gcneticen西neeringonoilcr叩breedingⅢ．JoumslofChineseBiotechnoIogy，2004，24(5)：24—28．[144】Me的crEGM，SchilperoortRA，Ruebs，eta1．nallsgenicricecelll硫saIldpl姐ts：expressionoftraIlsferredchimericgenes【J】．P1姐tM01．Biol，1991，16(5)：807—820．[145】PengLH，WenTN，ChenCS．cDNAclollingandgeneexpressionofthemajorZeinofMaizeinpotatoes[J】．PIantMolBioI，1992，221：1—7．[146】RookeL，BekesF，FidoR，eta1．0verexpressionofa西u钯npmteinintr蛐sgenicwheatresuttsinhig量1lyeIasticdough[J1．JounlaIofCereaIScience，1999，30：115—120．。[147】张晓东，梁荣奇，陈绪清，等．优质HMv谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析[J】．科学通报，2003，，48(5)：474—479．f148】BaHDF，BarcelP，LazzeriPA，et甜．Functjonalpropertiesofnours】丘Dm矗eldgm、Ⅵl仃{msgenicwheatlinesexpressingtheHMV91uteninsubunjt1Axland1Dx5genes【J】．MolecularBreeding2003，12(3)：223—229．【149】A1VarezML，Guelmans，HalfordNG，eta1．silencingofHMV西uteIlinsintmsgenicwheatexpressjngex仃aHMVsubLulits网．Theor．Appl．Gcnet，2000，100(2)：319—327．【150】PopineauY，DeshaycsG，LefcbVreJ，eta1．Pro】锄inaggregation，91utenviscoelas廿c匆，趴dmixingpropertiesof位msgenicwheatlinesexpressing1AxalldlDxhighm01ecular、Ⅳeightglutemnsubunit吣genes[J]．JAgricFoodChem，200l，49(1)：395—401．【15t]梁静静，吕德彬，陈军营，等．小麦Axl亚基基因转化研究【J]．麦类作物学报，2004，24(3)：5—8．【152]张建辉，丁丽丽，赵和．应用一年五代快速育种技术聚合优质抗病基因【J】．河北农业科学，2004，8(2)：17—20．[153】LmlrieS，FeeneyKA，MaalhuisFJ，eta1．AmleforHKTlinsodiumuptakebywheatroots【J]．PlamJoumal，2002，32(2)：139一149．[154]SiVamaniE，BallieldinA，wraithJM，eta1．ImprovedbiomasSproductivitya11dwaterusee伍ciencyunderwaterdeficitconditionsintraIlsgenicwheatconstitutivelyexpressingthebarleyHvAlgene[J】．plantsci，2000，155(1)：l一9．[155】DessalegneL，wettenAc，caligariPD．ProtectionoftransgenictomatoesexpressionS6 参考文献oxalateoxidase【J]．ActaHortic，1997，12：447—458．[156]Nis“daL，MuralaN．ChillingsensidV崎inplamsanycyanobacteria：thecmcialcom曲utionofme珊【brallelipids[J]．A衄ualReviewsInc，1996，47：541—568．[157】SuJ，Ta培oIIiJ，WuR．Howtoob组inopimaiGeneExpressioninplaIlt[zJ．中国第七次基因学术会议，1999，122一125．【158]邓定辉．抗性基因工程育种[J】．世界农业，2000，(9)：27—28．[159】刘岩，王国英，刘俊君，等．大肠杆菌gulD基因转入玉米及耐盐转基因植株的获得【J】中国科学(c辑)，1998，28(6)：542—547．[160]张荃，王淑芳，赵彦修，等．HALl基因转化番茄及耐盐转基因番茄的鉴定[J】．生物工程学报，200l，17(6)：658—662．【161】张艳敏，郭北海，r占生，等．小麦农杆菌转化系统的建立与转基因植株的获得[J]．华北农学报，2003，l8(3)：1—3．【162】樊剑呜，张跃灵，李莉，等．酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建与转化【J】．河南农业大学学报，2003，37(2)：134～136．[163】AbebeT，GueIlziAC，ManinB，etal．ToIeranceofMallllitolAccumlllatmgTransgenicWheattow缸erStressandsalinity[J】．PlantPhysiol，2003，13l(4)：1748—1755．【164】M撕alliC，GosseleV，BeuckellerMde，eta1．AchiIIlericribonucleaseillllibitorgencrestoresfemlitytomalesterileplants【J]．Naturc，1992，357：384—387．【165】DeBlockM，DebmuwerD，MoeflsT．Thedevelopmentofanuclearmalesterilitysysteminwhcat[J】．TheorApplGenet，1997，95：125—131．[166]李艳红，肖兴国，赵广荣，等．将新的人工雄性不育基因导入小栽培品种的研究初报川．农业生物技术学报，1999，7(3)：255—258．[167]HasebeH，wheelerJGa11dOsorioFA．Genespec湎cassaytodi艉reIniatestraillsofpseudorabiesvirlls[J】．、，etMicrobi01．，1993，34：221—231．【168】胡建广，祁喜涛．根癌农杆菌介导超甜玉米自交系幼胚转化研究【J】．广东农业科学，2004(增刊)：32—34．【169】1hdkaberryES，DudanjAK，PriorF，etaI_Developmemofbioph锄aceuticalsiIlplantexpressionsystems：c王onin舀expressionandimmunologicalreactivityofhumarIc”omegaloVirLIs91ycoproteinB(uL55)inseedsoftransgenictobacco【J】．Vaccine，1999，17：3020一3029．57 参考文献[170】廖筱萍，娄高明．伪狂犬病新型疫苗研究进展[J】．微生物学通报，29(6)：76—81．【171】胡涛，崔保安，王岩，等．伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建【J】．中国预防兽医学报，2004，26(1)：25—27．[172】IshidaY，SaitoH，ohtaS，eta1．HighefHciencytraIlSformationofMaize(zeamaysL．)mediatedbyAgrobacti啪tIlmefaciens[J]．NatⅢeBiotechnology，1996，14(6)：745—750．【173】Fr鼬eBR，ShouH，Chikw砌haRK，eta1．Agrobacti啪蛐e‰iens-mediatedtransfomationofmaizeembqosusingastandardbinaryvectorsystem[J】．PlantPhysiology，2000，129(1)：13—22．[174】Zhaoz·Y，GuW，Tagli锄iL，eta1．Hight11rou曲putgenetictratlsf0咖ationmediatedbyAgrobacti啪t哪facierISinmaize[J]．M01Breed，2000，8(4)：323—333．【175】BelangerFc，KrizAL．MolecularbasisforallelicpolymoIphismof恤emaizeG10bulin-19ene【J]．0enetics，199l，129(3)：863～872．58 致谢致谢本论文是在导师刘萍教授和胡建广研究员的悉心指导下完成的。在实验和论文写作过程中，两位导师实事求是的科学态度和严谨的治学精神使我受益终生；他们广博的学识、和蔼可亲的对人态度、严于律己宽以待人的做人原则给我树立了终生学习的榜样。多年来两位导师不仅对我的研究工作给予了许多有益的启发和直接的指导，而且在生活上还给予了许多无微不至的关怀和帮助，使我能够顺利完成研究生学业。在此，向两位导师表示最衷心的感谢并致以崇高的敬意!同时感谢张红绪老师在生活和学习上给予的关心和指导。感谢我院李明军教授和广东省农科院刘建华研究员、李余良博士、陈惠珍实验员在我做论文期间给与的关心、支持和指导。感i9f我校崔烨同学、江西农业大学宋克军、杨承槐同学在实验和生活中给予的帮助。在三年研究生期『自J，张国俊、丁义峰、常云霞、刘丹丹、赵乐、韩德果等同学在学习、生活中给予了许多热情的帮助，在此向他(她)们道一声谢谢。特别要感谢我深爱着的家人，这么多年来，正是他们的默默支持和鼓励，使我能够安心学习、快乐地生活，顺利完成学业。最后，感谢所有帮助过我的亲人、老师、同学和朋友159 攻凄硕士学位期间发表论文清单攻读硕士学位期间发表论文的清单1．胡建广，祁喜涛，李余良．RAPD技术应用于超甜玉米种子鉴定【J]．中国农学通报(核心期刊)，2002，18(6)；25—272．胡建广，祁喜涛．根癌农杆菌介导超甜玉米自交系幼胚转化研究[J】．广东农业科学，2004(增刊)：32—34．3．刘萍，齐付国，丁义峰，常云霞，祁喜涛．氨苄西林钠对小麦旗叶衰老及产量因素的影响[J】．河南农业科学(核心期刊)，2004，(5)：11—154．刘萍，祁喜涛，常云霞等．核酶在我国植物抗病毒领域的研究和应用现状【J】．(已接收)60