猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA—ELISA抗体检测方法的建立-论文.pdf

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1、第35卷第1期家畜生态学报VoI．35No．12014年1月ActaEcologiaeAnimalisDomasticiJan．2013猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA—ELISA抗体检测方法的建立祖立闯，沈志强，郭广君，王金良，苗立中，董林，吕素芳(1．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2．山东省滨卅I畜牧兽医研究院，山东滨州2566OO)[摘要]为建立一种快速的猪伪狂犬病毒抗体检测方法，本研究参照已发表的PRVSA株基因组序列，PCR扩增了长约1070bp的gD基因片段，将目的片段定向克隆到pET30a原核表达载体，转化BL21表达菌，经IPTG诱导后获得了以包涵

2、体形式表达的重组gD蛋白。重组蛋白纯化后，经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗，建立了检测猪伪狂犬病毒抗体的PPA—ELISA检测方法。该方法与其他7种常见猪病病毒(CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV一2、PEDV、TGEV)的阳性血清不发生交叉反应；批内重复性试验的变异系数小于5，批间重复性试验的变异系数小于1O；与IDEXXgD-ELISA试剂盒相比较，符合率、敏感性和特异性分别为92．0、95．1和88．1。本研究建立的PRVgD-PPA—ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性，为PRV

3、的免疫猪群抗体监测、快速诊断和PRV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。[关键词]猪伪狂犬病毒；gD蛋白；截短表达；PPA—ELISA；检测[中图分类号]$811．6[文献标识码]A[文章编号]1005—5228(2014)01—0054—07猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬1基因大约编码5O种结构蛋白，有11种为糖蛋白，病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起猪的一种急其中gD是PRV的主要结构蛋白，它不但诱导体液性、热性传染病，主要以发热、脑脊髓炎、奇痒、呼吸免疫，而且诱导细胞免疫，同时是病毒粒子表面的病和神经系统障碍为主要特征，临床

4、上表现怀孕母猪毒感染细胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主细流产、死胎、弱胎、木乃伊胎；新生仔猪发热、神经症胞过程中发挥重要作用，为病毒复制的必需基因，是状、麻痹、衰竭死亡，死亡率可达100；成年猪多耐一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，过而呈隐性感染，成为该病的主要传染源l_l]。该病能诱导较好的保护反应，抵抗PRV强毒株攻在世界范围内流行，给全球养猪业造成了巨大的经击。因此gD被作为PRV特异性抗原研究的首济损失l3]，我国自1947年发现此病以来，现全国选蛋白。本研究对gD基因进行了截短表达，以表已有3O多个省份发生流行，是严重危害我国养猪业达的重组蛋白为包被抗原，优化Eu

5、SA反应条件，的重要疫病之一]。该病的危害在于病毒侵入猪体建立了可检测PR血清抗体的间接EuSA诊断方后，可潜伏于三叉神经节或荐神经节造成潜伏感染，法，并对现地采集的猪血清进行了检测。病毒的潜伏感染使病猪终身带毒并周期性向外排1材料和方法毒，给疾病的防治带来很大困难_7]。PRV属疱疹病毒科(Herpesvmdae)a一疱疹病毒1．1病毒株、细胞、菌株与血清亚科(Alpha—herpesvirinae)，在生物型上属于猪疱猪伪狂犬病毒SA株、仓鼠肾细胞BHK-21、克疹病毒I型(Suidherpesvirus一1，SHV-1)L8。SHV一隆菌株DH5a、表达菌株BL21(DE3)、表达

6、载体[收稿日期]2013—03—08，修回日期：2013-04-02[基金项目]山东省自然科学基金(ZR2012CQ012)；滨州市应用技术研究与开发专项(200706)[作者简介]祖立闯(1981一)，男，黑龙江宾人，助理研究员，硕士，从事兽医免疫学诊断技术研究。Email：zulichuang2008@126．com*[通讯作者]沈志强(1963一)，男，山东荣成人，博士，研究员，研究方向：预防兽医学与生物制品学。E—mail：shen@126．corn第1期祖立闯，等：猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA—ELISA抗体检测方法的建立55pET30a(+)均由本实验室保存。猪伪狂

7、犬病病毒PCR产物纯化后与pMD18-T载体于4℃过夜连(Pseudorabiesvirus，PRV)阳性及阴性血清、猪瘟接，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，PCR及病毒(ClassicalSwineFevervirus，CSFV)、猪细小BamHI／HindIII双酶切鉴定得到阳性重组质粒病毒(Porcineparvovirus，PPV)、猪繁殖与呼吸综合pMD18一T—gD，送生工生物工程(上海)有限公司进征病毒(Porcine