猪伪狂犬病毒ge基因亚克隆、原核表达及elisa抗体检测方法的建立

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1、万方数据分类号：S852：§5垒：壹密级：公珏单位代码：学号：!QQ墨鱼2011421猪伪狂犬病毒gE基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立ProkaryotieExpression，SubcloningofgEGeneofPRVandDevelopmentofELISAfortheDetectionofViralAntibodieswiththeExpressionProduce学位申请人：裴丽华指导教师：范京惠副教授左玉柱副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一四年

2、五月三十一日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盛些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：已瑚午签字日期：的r午年5月z日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

3、和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：琵东轰签字日期：刎中年占月土日电话：邮编：争工揪月弥沙：年名午签川懿≯作：文期沦日倒字学签万方数据摘要

4、lUlIIIIIIIIMIIIIIIIIY2668386猪伪狂犬病(porcinePseudorabies，PR)是由猪疱疹病毒I型(pseudorabiesvirus，P

5、RV)引起猪的一种急性传染病。该病已在世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。结合相应的鉴别诊断方法，并采取相应的控制措施是预防该病的有效手段。gE糖蛋白是其主要的毒力因子之一，gE基因的缺失可以使PRV毒力大大降低，但不影响其免疫原性。目前gE基因缺失弱毒株已经在世界各国广泛使用。由于缺失疫苗与野毒株之间在gE基因上的差别，因此，gE基因可以区分疫苗免疫和野毒感染。本研究克隆表达了gE的主要抗原表位区，并将其作为包被抗原，建立了快速检测猪伪狂犬病的血清学诊断方法。根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病毒gE全基

6、因序列，设计合成一对特异性引物，采用PCR技术扩增gE全基因，克隆后进行序列测定，测序正确的质粒命名为PRV—gE。根据gE糖蛋白及原核表达载体pET32a的特点，选取一段抗原性较高的序列用Primer5．0软件设计另一对特异性引物。从重组质粒PRV—gE中扩增gE基因抗原性较高的序列(gE’)，将其与原核表达载体pET32a连接，构建表达质粒pET32a-gE’。经IPTG诱导后SDS—PAGE电泳可检测到分子质量约为45ku的蛋白，与预期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中。利用原核表达载体pET32a上

7、带有的His标签对pET32a-gE’重组蛋白进行纯化，纯化蛋白的Western—blotting结果显示，该重组蛋白与PRV阳性血清具有良好的反应原性。表明分子质量约45ku的蛋白即为目的蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，通过系列反应条件的优化，建立了检测PRV抗体的问接ELISA检测方法。优化结果显示，该方法的抗原最佳包被浓度为6．0lxg／mL；封闭液为含5％犊牛血清的PBST工作液；阴阳性血清最佳稀释度为1：40，37℃作用1h；酶标抗体最佳稀释度为l：200，37℃作用lh；底物显色时间为15min。与IDEX

8、X公司PRVELISA试剂盒相比，特异性为84％，敏感性为90％，符合率为87％。该方法与CSFV、PRRSV、PPV阳性血清不发生交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数均值都小于10％，具有较好的特异性和重复性，为检测PRV提供了一种简便的血清学诊断方法。关键词：PRV；gE基因；克隆；原核表达；ELISA万方数据ProkaryoticExpression，SubeloningofgEGeneofPRVandAnIndirectELISAfortheDetectionofViralAntibodieswjththeEx

9、pressionProduceAuthor：PeiLihuaSupervisor：Pro￡FanJin曲uiMajor：PreventiveVeterinaryMedicineAbstraetporcinePseudorabies(PR)iSahighlycontagiousandinfectionsd