猪嵴病毒vp1基因克隆与表达及抗体检测elisa方法的建立

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1、田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立研究生：田野导N-秦爱建。教授摘要猪嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKV)是微RNA病毒科嵴病毒属的成员，可能是导致猪胃肠炎的病原之一。自2007年首次发现以来，在全球大多数养猪国家陆续发现该病毒的感染。急性胃肠炎是导致幼儿、幼畜死亡的一个主要原因，虽然猪嵴病毒感染与猪胃肠炎之间的关系尚不明确，但是临床发现该病毒与宿主存一定的适应关系。研究表明，猪群各个生长阶段均可感染PKV，且该病毒常与其他肠道病毒混合感染

2、，或是其他疾病发生的诱导因素，其给现代养猪业带来了潜在危害。猪嵴病毒尚不能在体外细胞中进行培养，给该病毒的相关研究工作造成一定的困难。在猪嵴病毒感染的检测与诊断方面，主要采用RT-PCR技术直接检测临床样本，血清学技术用于猪群中猪嵴病毒感染状况的调查与分析尚未见文献报道。因此，建立特异、敏感的血清学技术，并用于猪群中猪嵴病毒感染的血清流行病学调查是十分必要的。PKV的结构蛋白VPl具有良好的免疫原性。本研究对VPl基因进行了克隆和原核表达，并利用表达的VPl蛋白建立了检测PKV抗体的间接ELISA方法，以期为PKV感染的血清学调查与监测提供

3、一种可靠的技术手段。1．猪嵴病毒VPl基因的克隆与表达运用分子生物学软件DNAstar和ABCpred对猪嵴病毒XD株的VPl蛋白进行了抗原表位信息分析，结果显示猪嵴病毒VPl蛋白的785aa一1038aa区域具有较高的抗原性和亲水性。设计扩增编码该区域基因片段的引物，应用RT—PCR方法特异性扩增XD株VPl基因片段，将其克隆至原核表达载体，成功构建得到重组质粒pET一32a—XDVPl，并在Ecoli(DE3)中诱导表达。在诱导温度为28。C，IPTG终浓度为0．05mmol／L，诱导3h的条件下可获得扬州大学硕士学位论文2高效表达的可

4、溶性重组蛋白VPl。用大肠杆菌细菌裂解液对临床猪血清进行吸收，去除非特异性抗体，然后再利用重组蛋白VPl进行Westernblotting检测，筛选获得PKV阳性血清。2．猪嵴病毒抗体检测ELISA方法的建立用纯化的重组蛋白VPl为包被抗原建立了检测PKVVPl抗体的间接ELISA方法，且确定了ELISA的最适工作条件。结果显示，重组蛋白最适包被浓度为0．4pg／mL，待检血清适宜稀释度为1：50，HRP．山羊抗猪IgG工作浓度为1：4000，待检血清和酶标二抗的反应条件为37。C30min，阴阳性临界值为O．35。建立的ELISA方法具有

5、良好的特异性，与猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒阳性血清无交叉反应。应用建立的ELISA方法对临床采集华北地区的8个猪场的720份猪血清样本进行了PKV抗体检测。结果表明，猪场PKV抗体阳性率介于33．33％．98．89％，总阳性率为81．25％，提示我国华北地区猪场PKV感染较为普遍，但猪场之间的感染状况有所不同。综上结果，本研究建立的PKVVPl抗体检测ELISA方法可用于PKV感染的血清学调查与监测。关键词：猪嵴病毒；VPl；原核表达；间接ELISA田野：猪嵴病毒VPl基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立3GeneClone

6、andProkaryoticExpressionofStructuralProteinVP1ofPorcinekobuvirusandDevelopmentofELISAforDetectionofAntibodytoVP1AbstractPorcinekobuvirus(PKV)isamemberofthegenuskobuvirus，familyPicomaviridae．SomepapersreportedthatPKVispotentiallyassociated、析tIlporcineacutegastroenteritis．Sw

7、ineinfectionwiththevirusarefoundinmostcountriesalloftheworldsince2007．Acutegastroenteritisisamajorcauseofdeathforyoungchildrenandyounganimals．TherelationshipbetweenPKVandswinegastroenteritisisnotclear,butthevirusWasfoundinclinicanadaptiontothehost．PigsatthedifferentagesCan

8、beinfected、析thPKV,whichwereCO—infected、析t11otherenterovirus．Itmaybeadisease-inducedfactor