猪嵴病毒ch441株vp3基因的原核表达及间接elisa方法的建立

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文猪嵴病毒CH441株VP3基因的原核表达及间接ELISA方法的建立ProkaryoticExpressionoftheVP3GeneofPorcineKobuvirusCH441andDevelopmentofIndirectELISA祝俊鹏指导教师姓名马小军副教授（甘肃农业大学兰州730070）杨彬副研究员（中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046）学科专业名称临床兽医学研究方向动物免疫与抗病论文答辩日期2015年5月29日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席赵红斌研究员评阅人景志忠研究员伏小平副教授20

2、15年5月甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要致使猪死亡的原因有很多，腹泻是重要原因之一，给养猪业带来的经济损失很大。近年来，新发病原在猪群中被不断检测到，在腹泻猪群中检测到的猪嵴病毒（Porcinekobuvirus，PKV），有较高的阳性检出率。猪嵴病毒(porcinekobuvirus，PKV)属于微小核糖核酸病毒科(picornaviridae)嵴病毒属，是一种没有囊膜的单股正链RNA病毒。目前国内关于猪嵴病毒的研究较少，检测方法较少，有待进一步完善。为建立猪嵴病毒的间接ELISA检测方法，本研究对GenBank中登录16株猪嵴病毒的VP1基因与VP3基因进行了

3、序列分析，挑选出适合用来建立间接ELISA检测方法的基因，然后建立猪嵴病毒的间接ELISA检测方法。研究内容包括：1.猪嵴病毒VP1基因的克隆与序列分析利用RT-PCR方法克隆了猪嵴病毒CH441株VP1基因。并对该基因进行序列分析，核苷酸一致性分析结果显示，猪嵴病毒CH441株VP1基因与其他15株猪嵴病毒VP1基因核苷酸相似性在81.5%~90.2%，表明VP1基因存在较为明显的变异。氨基酸同源性分析结果显示，氨基酸序列相似性为86.6%~96.9%，该结果明显高于核苷酸相似性，表明VP1基因的部分变异为无义突变。2.猪嵴病毒VP3基因的克隆分析与原核表达通过RT-P

4、CR成功克隆了猪嵴病毒CH441株VP3基因。对VP3基因进行序列分析，核苷酸一致性分析结果显示，猪嵴病毒CH441株VP3基因与其他15株猪嵴病毒VP3基因核苷酸相似性在84.0%～90.7%。氨基酸同源性分析结果显示，猪嵴病毒VP3基因的氨基酸序列相似性为91.5%～99.1%。上述结果表明，猪嵴病毒CH441株VP3基因与其他15株猪嵴病毒VP3基因核苷酸、氨基酸相似性均高于VP1基因，说明VP3基因的变异比VP1基因的小，更适合作为建立诊断方法的候选蛋白。本研究应用原核表达系统表达了VP3蛋白，并用纯化的VP3蛋白制备了猪源高免血清。3.猪嵴病毒间接ELISA检测

5、方法的建立利用纯化的猪嵴病毒VP3蛋白作为包被抗原，成功建立了特异性与稳定性高的检测猪I甘肃农业大学2015届硕士学位论文嵴病毒抗体的间接ELISA方法，为猪嵴病毒的诊断成立了一种新的方法。通过本研究建立的VP3抗体检测方法对临床采集的44份腹泻猪血清样本进行检测，VP3抗体阳性率为63.64%，检测结果显示在甘肃地区发生腹泻的猪群中，猪嵴病毒具有较高的阳性检出率。关键词：猪嵴病毒；VP1基因；VP3基因；间接ELISAII甘肃农业大学2015届硕士学位论文AbstractDiarrhoeaisoneoftheimportantreasonsofcausingthedea

6、th,itgivestheindustrycausedgreateconomicloss.Inrecentyears,therehavebeennewpathogenesishavebeendetectedinpigs,pigcrestvirus(Porcinekobuvirus,PKV)isanewvirusdetectedindevelopeddiarrheadiseaseofpigsinrecentyears,anditspositivedetectionrateishigher,soitcausedthewideattentionofscholarsbothath

7、omeandabroad.Crestswinevirus(porcinekobuvirus,PKV)belongtothesmallRNAvirusfamilypicornaviridaecrestviruses,itisasinglestrandischainwithoutcapsulemembraneRNAviruses.Indomesticcresttothepigvirusrelatedresearchisless,anddetectionmethodisless,soweneedtofurtherperfect.In