猪圆环病毒2型cap原核表达与间接elisa方法的建立

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4、取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包當其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农化大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做化任何贯献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。：时间研究生签名：＾／年名月王曰又／关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权＾保留送交论文的复印件和磁盘，可，允许抢文被查飼和借阅式采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可Ｗ用不同方式在不同

5、媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）：＾研究生签名时间；年６月ｊ曰心＞／Ｔ第一导师签名：Ｉ时间：＾／Ｔ年《月立曰摘要猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是圆环病毒属的代表种，可分为PCV1和PCV2。PCV1没有致病性；PCV2引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS）是猪的免疫抑制病之一，给世界养猪业造成了严重的经济损失。目前，临床上还没有有效的方法控制和消灭PCV2，市场上流通的疫苗也不能起

6、到很好的预防效果。因此，建立一种血清学检测方法，快速、及时掌握PCV2的流行情况，做好预防措施就显得十分关键。研究利用PCV2ORF2的原核表达蛋白作为抗原，建立间接ELISA检测方法，并初步应用于PCV2血清抗体的临床检测。首先，根据实验室保存的PCV2鄂州株（Genebank未登录）基因序列设计特异性引物，分别在上、下游引物加入SacI和HindIII酶切位点，扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因，将该片段克隆至pET-28a原核表达载体，经PCR、酶切鉴定，表明成功构建了阳性重组表达质粒pET-ORF2。将其转化入大肠杆菌Rosetta中，经IPTG诱导

7、表达，SDS-PAGE电泳分析初步确定重组蛋白为34.5KDa，主要以包涵体形式表达。最佳诱导条件为：37℃条件下，摇菌至OD值0.4-0.6左右时加入终浓度1mmol/LIPTG，诱导5h时目的蛋白表达量最高，可达0.46mg/mL。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析。结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。其次，用纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立了PCV2抗体间接ELISA检测方法。其中，抗原包被浓度为4.6µg/mL，37℃孵育2h后4℃过夜；5%SMP/PBST，37℃封闭2

8、h；待检血清的最佳稀释度为1∶40，37℃孵育1h；