《犬瘟热病毒h基因原核表达及间接elisa的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
■？Ａ－－、、．．？．４－－．一．、、？‘．：Ｓ８５５．３学校代码：１０４１０分类号鞋；＾崎、＾密级：０２０２０１２２０６：学号＾｜駭．＇：－＇：Ｊｉ．袜＆朱考乂聲堪｜３‘１硕女聲隹絶Ａ犬痘热病毒Ｈ基因原核表达及间接ＥＬＩＳＡ的建立ＰｒｏｋａｒｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｆｉｅＨｒｏｔｅｉｎｅｎｅｏｆｙｐｇｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｐ打ｉｒ：ｈｉｄｅｃｔＥＬＩＳＡ＼＼巧■＾＞Ｖ－．．＇、，一＇－．．＇Ｌ．？＇矿喊；Ｖ护．聲换：张祥华逆申请人辄向东副教授，？：．指导教师巧巧＾’＇Ｈ心：＇预防兽医学；：学科专业、歡、一於．矜户榻；．，＾巧所在院（所）：动物科学技术学院至起二零一论文提交日期：五年宏月＿＇．‘氏：：ｃ把＇■＾＇＇＇．－：ｒ．，Ｖ．款乂取爲＇吟Ｖｆ，巧式、＇—．＇＇：、’、，：＇＇．－＇？－八＇、ｒＩ气：％辦碱；＇＇．＇－＇＇咬、一心／＇＇、球Ｖ．、Ｌ■、、、、、＇．？－．．．：成：诚谭— 独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下，通过我经的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农业大学或过一其它教育机构获得学位或证书而使用的材料。与我同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。■．／０学位论文作者亲笔签名；蘇骑净日期：＞／（、／论文使用授权的说明本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定全，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可公布论文的部或部分内容，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在＿＿年后解密可适用本授权书。口不保密，本学位论文属于不保密。□（请在方框内打＂Ｖ＂）学位论文作者亲笔签名；獻科日期：、Ｉ、（〇签）璋导教师亲笔名：細日期：化、心、记 目录目录摘要........................................................................................................................................IAbstract.....................................................................................................................................II中英文缩写词表.....................................................................................................................III第一章文献综述.....................................................................................................................11.1CDV病原特性............................................................................................................11.1.1分类地位..........................................................................................................11.1.2形态特征及分离培养......................................................................................11.1.3理化特性..........................................................................................................21.1.4基因组结构......................................................................................................21.1.4.1核衣壳蛋白.............................................................................................21.1.4.2L蛋白与P蛋白.....................................................................................31.1.4.3M蛋白.....................................................................................................31.1.4.4F蛋白和H蛋白.....................................................................................31.2致病机理....................................................................................................................41.2.1CDV组织嗜性..................................................................................................41.2.2神经症状及其机理...........................................................................................41.2.3免疫抑制机理...................................................................................................51.2.4持续性感染.......................................................................................................51.3临床症状....................................................................................................................61.4诊断技术....................................................................................................................71.4.1病毒分离技术..................................................................................................71.4.1.1病毒培养................................................................................................71.4.1.2电镜观察................................................................................................71.4.1.3动物回归试验........................................................................................71.4.2包涵体检测......................................................................................................71.4.3荧光抗体技术..................................................................................................81.4.4酶联免疫吸附试验（ELISA）.......................................................................81.4.5胶体金免疫层析技术......................................................................................81.4.6RT-PCR..............................................................................................................81.4.7实时荧光定量PCR..........................................................................................91.4.8环介导等温基因扩增技术..............................................................................91.5犬瘟热疫苗研制......................................................................................................101.5.1灭活苗............................................................................................................101.5.2麻疹病毒疫苗................................................................................................10i 目录1.5.3弱毒疫苗........................................................................................................101.5.4基因工程疫苗................................................................................................111.5.4.1亚单位疫苗..........................................................................................111.5.4.2核酸疫苗..............................................................................................121.6治疗..........................................................................................................................12第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立............................................................................132.1材料与方法..............................................................................................................132.1.1试验材料........................................................................................................132.1.2试剂................................................................................................................132.1.2.1主要试剂..............................................................................................132.1.2.2相关试剂配制......................................................................................132.1.3设备................................................................................................................142.1.4方法................................................................................................................142.1.4.1引物设计..............................................................................................142.1.4.2RNA提取与cDNA模板制备.............................................................142.1.4.3PCR反应体系及结果判定...................................................................152.1.4.4重组质粒PMD18-T-CDVN构建与测序...........................................152.1.4.5敏感性试验..........................................................................................182.1.4.6特异性试验..........................................................................................182.1.4.7临床样品检测应用..............................................................................182.2结果..........................................................................................................................182.2.1RT-PCR初步建立结果...................................................................................182.2.2退火温度优化试验结果................................................................................182.2.3重组质粒PMD18-T-CDVN构建与测序结果.............................................192.2.3.1PMD18-T-CDVNPCR鉴定.................................................................192.2.3.2PMD18-T-CDVN双酶切鉴定.............................................................202.2.3.3PMD18-T-CDVN测序结果.................................................................202.2.4RT-PCR敏感性试验结果...............................................................................212.2.5RT-PCR特异性试验结果...............................................................................212.2.6临床应用结果................................................................................................222.3讨论..........................................................................................................................222.4小结...........................................................................................................................23第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达......................................................................243.1材料与方法..............................................................................................................243.1.1菌株和质粒....................................................................................................243.1.2试验CDV样品..............................................................................................243.1.3生化试剂........................................................................................................243.1.4主要仪器设备................................................................................................24ii 目录3.1.5培养基和部分试剂配制................................................................................253.1.6质粒提取试剂配制........................................................................................253.1.7蛋白电泳相关溶液配制................................................................................253.1.8蛋白纯化试剂配制........................................................................................263.1.9蛋白复性试剂配制........................................................................................263.1.10试验方法......................................................................................................273.1.10.1引物设计............................................................................................273.1.10.2病毒RNA提取..................................................................................273.1.10.3RT-PCR................................................................................................273.1.10.4H基因的克隆测序.............................................................................283.1.10.5重组表达质粒pET32a-CDVH的构建.............................................293.1.10.6目的基因诱导表达............................................................................303.1.10.7目的基因诱导表达条件优化............................................................313.1.10.8重组蛋白大量表达及初步纯化........................................................313.1.10.9重组H蛋白过柱纯化.......................................................................323.1.10.10重组H蛋白透析复性......................................................................323.1.10.11重组H蛋白免疫小鼠试验..............................................................333.1.10.12重组H蛋白免疫小鼠抗体效价检测..............................................333.2结果..........................................................................................................................333.2.1重组质粒PMD19-T-CDVH构建.................................................................333.2.1.1目的基因PCR扩增.............................................................................333.2.1.2重组质粒PMD19-T-CDVH双酶切鉴定...........................................343.2.2CDVH基因片段测序结果与分析.................................................................343.2.2.1重组质粒CDVH基因片段测序结果................................................343.2.2.2H基因同源性分析...............................................................................353.2.2.3进化树分析..........................................................................................353.2.3重组质粒pET32a-CDVH双酶切电泳结果.................................................363.2.4诱导表达试验................................................................................................363.2.4.1IPTG浓度优化试验结果....................................................................363.2.4.2最佳诱导表达时间试验......................................................................373.2.5重组蛋白表达形式试验结果........................................................................383.2.6蛋白纯化试验................................................................................................383.2.6.1包涵体洗涤初步纯化结果..................................................................383.2.6.2Ni柱纯化结果......................................................................................393.2.7重组H蛋白免疫小鼠抗体效价检测...........................................................393.3讨论..........................................................................................................................403.3.1CDVH基因片段的选择................................................................................403.3.2重组表达系统选择........................................................................................40iii 目录3.3.3包涵体及复性................................................................................................413.4小结..........................................................................................................................41第四章犬瘟热间接ELISA方法的初步建立......................................................................424.1材料与方法..............................................................................................................424.1.1试验设备与试剂............................................................................................424.1.2相关试剂配制................................................................................................424.1.3试验方法........................................................................................................434.1.3.1间接ELISA操作步骤.........................................................................434.1.3.2间接ELISA相关试验条件确定.........................................................434.1.3.3间接ELISA阴、阳性血清临界值确定试验.....................................434.1.3.4重复性试验..........................................................................................444.1.3.5特异性试验..........................................................................................444.1.3.6犬血样检测..........................................................................................444.2结果..........................................................................................................................444.2.1抗原包被浓度和犬血清稀释倍数优化方阵滴度结果................................444.2.2二抗稀释倍数优化试验结果........................................................................444.2.3最佳封闭液确定............................................................................................454.2.4显色时间的确定............................................................................................464.2.5间接ELISA阴阳性判定临界值计算...........................................................464.2.6重复性试验....................................................................................................474.2.7特异性试验结果............................................................................................474.2.8样品检测结果................................................................................................474.3讨论..........................................................................................................................48全文总结.................................................................................................................................49参考文献.................................................................................................................................50致谢.....................................................................................................................................57作者简介.................................................................................................................................58iv 摘要摘要犬瘟热病毒（caninedistempervirus，CDV）是犬瘟热（caninedistemper，CD）的病原体。CD是威胁犬类健康的最严重传染病之一，发病后死亡率极高，且无特异性治疗药物。为此，本试验针对CDV的N基因，建立了快速诊断RT-PCR方法；同时通过RT-PCR方法扩增CDV部分H基因，通过原核表达、复性，成功表达出CDVH蛋白，并构建了H蛋白间接ELISA方法，证实表达的H蛋白具有免疫原性，具体内容如下：1．根据GenBank公布的CDVN蛋白基因序列，设计了一对特异性引物，成功扩增出464bp的CDVN基因片段。测序结果表明该序列与GenBank已经发表CDV基因序列的同源性为94.8%～98.5%。利用本文建立的CDV检测RT-PCR方法对30例疑似CDV病例检测显示：RT-PCR检测方法的阳性检出率为90%、胶体金试纸阳性检出率为86.7%，说明RT-PCR方法检出率和敏感性更优。2．血凝素蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一。本文去除H基因高度疏水区核苷酸设计引物，成功克隆了来自南昌CDV病料中CDV长度为1236nt的H基因片段。将该基因片段插入到载体pET32a中，构建了原核表达质粒pET32a-CDVH，重组蛋白H基因在Rosetta菌中获得了高效表达。表达产物以包涵体的形式存在，经包涵体洗涤、复性、Ni柱纯化、透析浓缩，最终获得浓度为0.561mg/mL重组H蛋白溶液。小鼠免疫试验显示，重组蛋白免疫产生的血清抗体效价在1:102400以上，免疫原性良好。3．以7.5ug/mL的复性H蛋白溶液包被96孔酶标板，成功建立了重组CDVH蛋白间接ELISA。间接ELISA条件为：重组蛋白包被浓度7.5ug/mL、1%明胶封闭、血清稀释倍数为1：80、酶标二抗稀释倍数为1：5000，阴阳性血清判定的临界值(OD492)为0.100。试验证明该间接ELISA方法特异性强，重复性良好。对收集的背景清楚血样的检测结果符合预期。关键词：犬瘟热病毒；H基因；原核表达；间接ELISAI AbstractAbstractCaninedistempervirus(CDV)isthepathogenofcaninedistemper.It’soneofthemostseriousinfectiousdiseasethreatdogshealthy,withhighmortalityrateafteronset,butthereisnospecifictreatment.Therefore,thisexperimentonthebasisofCDVNgene,establishedacaninedistempervirusRT-PCRdetectionmethod.clonedCDV−Hgene,buildaprokaryoticexpressionsystemandinducedHproteinexpression.Meanwhile,weestablishedaindirectELISA,andconfirmedthattheHproteinwithgoodimmunogenicity.Specificcontentasfollows:1PrimersweredesignedaccordingtothesequencesofCDVgenethatretrievedfromGenBank,weamplifiedagenefragmentabout464bpfromCDVnucleicacid.productswereanalyzedbysequencing,resultsshowedthehomologywas94.8%～98.5%.Byoptimizingtheexperimentalconditions,finallyestablishedacaninedistempervirusRT-PCRdetectionmethod.Inthetestof30clinicalsamples,usingRT-PCRmethod,thepositivedetectionratewas90%,higherdetectionrateandmoresensitivitythanthedetectionrate86.7%thatusingcolloidalgoldstrip.2TheHemagglutininproteincaninducestrongneutralizingantibodies,thusasetofprimersspecifictoHgeneofCDVwasdesigned,whichtheHproteingenefragmentis1236nt.ConnectthegenefragmentswithpET32a,constructedtheprokaryoticexpressionplasmidpET32a−CDVH.RecombinantproteinwareefficientexpressioninRosettabacteria.Bydialysismethod,weobtainedrecombinantproteinH(0.561mg/mL).ThemiceimmuneexperimentshowedthatserumantibodytiterofrecombinantproteinHwashigherthan1:102400.3Thisstudyused7.5ug/mLrenaturationofrecombinantproteinsHPackagetheenzymelabelplate,indirectELISAwasestablished.Theoptimumworkingconditionsweredetermined:theconcentrationofcoatingantigenwas7.5ug/ml,coatedat4℃overnight,blockingwith1%gelatinsolution,80-folddilutionofsera,1:5000dilutedHRP-antibody,andOPDsubstratesolutionwasincubatedat37℃for15minindarkroom.Thecutoffvalueofthepositiveresultswas0.100.TheindirectELISAmethodspecificityisstrongandwithgoodrepeatability,Testresultsofthebloodsamplewhichbackgroundisclearconformtotheexpectation.Keywords:CDV;Hgene;prokaryoticexpression;indirectELISAII 中英文缩写词表中英文缩写词表英文简写英文名称中文名称aaAminoacid氨基酸AmpAmpicillinsodium氨苄西林钠bpBasepair碱基对CDVCaninedistempervirus犬瘟热病毒CDVHCDVhemagglutininprotein犬瘟热病毒血凝素蛋白CNSCentralnervoussystem中枢神经系统CPECytopathiceffect细胞病变效应ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验GSSGL-Glutathioneoxidized氧化型谷胱甘肽GSHL-Glutathionereduced还原型谷胱甘肽HelaHeLacell海拉细胞HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶RT-PCRReversetranscription-polymerasechain反转录聚合酶链式反应reactionRT-LAMPReversetranscriptionloop-mediated逆转录环介导等温扩增isothermalamplificationkDaKilodalton千道尔顿MVMeaslesvirus麻疹病毒McAbMonoclonalantibody单克隆抗体MDCKMadindarbycaninekidney犬肾细胞ntNucleotide核苷酸ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放性阅读框PPRVPesteDespetitsruminantsvirus小反刍兽瘟疫PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液ssRNASingle-strandedribonucleicacid单链核糖核酸SSPESubacutesclerosingpanencephalitis亚急性硬化性全脑炎TCID50Tissuecultureinfectivedose50半数组织培养感染量VOPBAVirusoverlayproteinblotassay病毒铺覆蛋白印迹技术III 第一章文献综述第一章文献综述犬瘟热（caninedistemper，CD）是由犬瘟热病毒（caninedistempervirus，CDV）感染犬引起的严重急性、热性、高度接触性传染病。犬瘟热的传染性强、发病率和死亡率高、宿主范围广泛。CDV除可感染犬外，还可感染毛皮经济动物貂，野生动物狐、海豹、浣熊、豹、虎、狮、土狼、珍稀野生动物大熊猫等，也有灵长类动物[1-2][3]感染CDV的报道。犬瘟热病毒与人类的SSPE及MS可能存在联系，并可能[4-7]与人的Paget’s病有相关性。近年来，由于CDV的自然感染宿主范围不断增大，并且物种间可发生交叉传染，给毛皮动物养殖、养犬业和野生动物保护都造成了严重危害与损失。国际动物卫生组织（OIE）始终将犬瘟热列为重点关注的动物疫病。1.1CDV病原特性1.1.1分类地位[8]本病最早发现于18世纪后叶，1905年Carre用动物接种技术复制了本病，发现病原为病毒。1951年Dedie首次用组织培养的方法培养出CDV。我国于1980年，[9]由华国荫等从美国进口的鸡胚组织培养弱毒中首次分离出CDV。犬瘟热病毒与麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒（RPV）、海豚瘟热病毒（DDV）、小反刍兽瘟疫（PPRV）[9]等同属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属。1.1.2形态特征及分离培养图1-1副粘病毒科病毒结构模式图Fig1-1ParamyxoviridaeSchematischerAufbau（ChristianG.Schüttler2007）犬瘟热病毒粒子结构与其他副粘病毒科病毒相似（见图1-1）。CDV具有多种形态，多数呈球形，也有丝状和畸形的病毒粒子。囊膜表面密布由血凝素蛋白（H）和融合蛋白（F）构成的纤突，纤突上有血凝素，没有神经氨酸酶，但CDV的血凝[10]作用未被充分肯定；囊膜内侧是由基质膜蛋白（M）组成的“小管状结构”；病毒中心由核衣壳蛋白(N)包裹RNA基因组形成螺旋状核衣壳。核衣壳上附着磷蛋白（P），此外CDV核衣壳上还有大蛋白（L）。CDV表面有囊膜，对外界因素的抵抗力弱，分离成功率较低。用于CDV分离培养的细胞分为原代细胞和传代细胞系两大类。原代细胞主要有犬和貂的肺巨噬细1 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立胞、肾细胞、胚胎细胞、T淋巴细胞、鸡胚成纤维细胞等；传代细胞系主要包括：Vero、MDCK、BHK21、CRFK、B95a、及Hela等。CDV在犬肺巨噬细胞上可形成葡萄串样的细胞病变；实验室感染以雪貂最为敏感，是公认的CDV试验动物；CDV[11-12]在鸡胚绒毛尿囊膜上会形成特征性的痘斑，是检测CDV中和抗体的标准方法。1.1.3理化特性CDV对各种外界环境的抵抗力较差，对高温、干燥、紫外线及有机溶剂敏感，易被乙醇、乙醚与煤酚皂等灭活。CDV经乙醚、氯仿、甲醛化学处理后丧失致病性但抗原性仍保持；pH4.5以下、pH9.0以上活力丧失；37℃5日，室温9日，56℃30[13]分钟后，病毒毒力下降；反复冻融5次毒价稳定。病毒在-10℃可以保存数月，-70℃[14]或冻干可以长期保存。王君玮研究表明：CDV对鸡、鹅红细胞有轻度凝集,但CDV对人“O”型红细胞及猪、绵羊、小鼠、兔、犬红细胞均未见血凝作用。1.1.4基因组结构CDV病毒粒子内含呈螺旋对称的衣壳，其核酸是一条连续的单链RNA分子，6分子量为6×10Da，基因组全长约15690bp。基因结构见下图1-2。图1-2CDV基因结构示意图Fig1-2ThegenomicorganizerofCDV按照5'到3’端的顺序依次为：5’端引导序列，大蛋白（Largevirus-specificiedRNAdirectedRNApolymeraseprotein，L）、血凝素蛋白（Hemagglutininprotein,H）、融合蛋白（Fusionprotein，F）、基质膜蛋白（Matrixprotein，M）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，N）基因序列及3’端引导序列。各序列长度分别为：L6573nt、H1947nt、F2205nt、M1442nt、P1655nt、N1683nt、3’[15]端和5’端引导序列分别为55nt和38nt。1.1.4.1核衣壳蛋白N蛋白包裹着病毒粒子的RNA基因组。N基因序列有1683个核苷酸（nt）,只有一个开放性阅读框（ORF），从全基因序列108～110nt的AUG起到1677～1679nt的终止密码UAA，共编码523个氨基酸（aa），分子量为58kDa。N蛋白分为三个区，N端的17～159aa及C端的408～519aa为可变区，中间160～407aa为保守区，[16]中间保守区是N蛋白结构和功能的核心区域。犬瘟热病毒的毒力在中枢神经系统[17][18]的持续性感染中具有重要作用，而其毒力与N蛋白密切相关。BeauvergeP等经研究认为：CDVN蛋白281～289位的YPALGLHEF连续9个氨基酸高度保守，是T细胞表位，在细胞免疫中发挥重要的功能。同时，N蛋白上含有B细胞抗原表位。N蛋白的1～80aa或337～358aa是B细胞表位，是诱导产生抗体的抗原表位。另外，3’端缺失蛋白与全长N蛋白主要位于细胞核内，而5’端缺失1～88aa的蛋白2 第一章文献综述位于细胞质内。说明N末端1～88位氨基酸是N蛋白从细胞质转运到细胞核必需[19]的氨基酸序列。1.1.4.2L蛋白与P蛋白L蛋白基因全长6573nt，ORF全长6555nt，编码2161个氨基酸，分子量246kDa，是分子量最大的结构蛋白。L蛋白含有高达19.2%Leu和Ile，呈碱性等电点。该蛋白存在一个线性、不连续的、高度保守的推测功能区。研究认为，L蛋白能识别启[20]动子序列，从而启动基因的转录和复制过程，是一个多功能的酶单位。P蛋白属于糖基化蛋白，基因全长有1655nt。编码P蛋白的ORF起始于1801～1803nt的AUG到3322～3324nt的终止密码子UAA共1524nt，编码507个氨基酸。磷蛋白的丝氨酸和苏氨酸的含量很高，可作为磷酸化的位点。P蛋白与L蛋白是CDVRNA依赖的RNA聚合酶的两个亚单位，RNA聚合酶对于基因的转录起着重要作用。此外，P基因上的另一个ORF起始于基因序列的第1823nt到2347nt，编码174个aa组成的非结构蛋白C蛋白。C蛋白在CDV入侵后的感染过程中可诱导宿主机[21]体出皮疹反应。Curran等(1992)发现在mRNA750位核苷酸处有一个长约18nt的编辑位点，在转录时若共转录插入一个G残基，转录产物就会发生变化，产生一个编码非结构蛋白的mRNA，翻译成V蛋白。V蛋白可与L蛋白发生反应，在CDV快速入侵粘膜组织和淋巴器官的淋巴细胞的过程中起抑制细胞因子的传导，进而抑[22]制病毒复制的作用。1.1.4.3M蛋白M蛋白基因全长1442nt，M基因编码335个aa，蛋白大小为34kDa。CDV和[23]MV的M蛋白在核苷酸和编码氨基酸水平的同源性分别为67%和76%，M蛋白在麻疹病毒属病毒所有蛋白中最保守。M蛋白与CDV细胞膜表面糖蛋白、胞浆内[24]核衣壳结构形成,以及病毒的装配和出芽有关。有学者分析不同毒力CDV毒株的M蛋白核苷酸及编码的氨基酸发现，两种组织培养适应株和两株野毒株M蛋白基因非编码区域出现了额外的第二个ORF，编码52个aa的短肽，而在Onderstepoort疫苗株却没有。Onderstepoort疫苗株以典型的细胞溶解方式进行传播，无致病力，但野毒株具有持续性感染能力，两个组织适应株有一定致病力且具有持续性感染能[25]力，因此推断第二个ORF的存在可能与这些病毒在体外培养中持续性感染有关。1.1.4.4F蛋白和H蛋白CDV病毒囊膜表面分布着由H和F蛋白两种糖蛋白组成的纤突，两种纤突在[26]病毒吸附和侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。Stern等（1995）用痘病毒表达系统表达了CDVH蛋白和F蛋白，二者共转染时可诱导合胞体的形成，但分别转染时未出现合胞体，说明细胞的融合需要两个蛋白的共同作用。H蛋白决定着宿[27]主特异性，H蛋白可识别、吸附于宿主细胞表面的CD150/SLAM或CD46受体,然后F蛋白通过构象改变使病毒囊膜与宿主细胞膜发生融合，使病毒核酸进入宿主细胞并发生进一步增殖。F蛋白为寡聚糖蛋白，位于囊膜表面。它包括附着区、融合区、穿膜区三个主要功能区。F蛋白编码基因全长2205nt，ORF一般为1989nt。成熟的F基因mRNA3 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立翻译的初产物是F0蛋白，分子量是62kDa。随后F0在高尔基体的蛋白水解酶的作用下，裂解成40kDa的F1蛋白和23kDa的F2蛋白（对大量CDV毒株的分析发现，初产物F0蛋白裂解部位的氨基酸序列均为“RRQRR”）。然后，F1和F2再通过[28-29]二硫键连接成蛋白二聚体。F蛋白在融合开始后通过构象的改变，F1的N端暴露出一个高度保守的强疏水融合序列，该序列直接与宿主细胞膜作用，介导病毒囊膜与靶细胞膜之间的融合。H蛋白编码基因ORF起始于全基因序列7079～7081nt位的AUG，Onderstepoort疫苗株终止密码子为8891～8893nt位的UAA，ORF全长1815nt。多数毒株起始序列与Onderstepoort疫苗株相同，但终止密码子是8889～8902nt的UGA，ORF全长1824nt，编码607个aa，分子量84kDa。H蛋白N端的35～55位aa形成了一个疏水性区域，这个区域有两个作用:一为穿膜的信号序列，二为H蛋白的锚定区。CDV只有一个血清型，因为H蛋白基因是整个基因组中变化率最高的，常根据其序列相似性将CDV分为两大谱系，即疫苗毒和野毒。CDV可分为美洲-1型(大部分疫苗株)、美洲-2型、亚洲-1型、亚洲-2型、欧洲型、Artic-like和欧洲野生动物型,疫苗型CDV和野生型CDV的H蛋白在核苷酸和氨基酸残基水[27,30]平上都存在约10%的差异，分离株间的同源性可高达93%～99%。[31]Cherpillod等（1999）用CDV强毒株的H和F基因构建了真核表达质粒，用重组质粒免疫犬，然后用强毒株感染试验犬，试验表明免疫犬可抵抗CDV强毒[32]株的感染，CDV表面糖蛋白可诱导动物机体产生特异性中和抗体。Hirayama-N等试验表明CDVH-McAb对小鼠的保护力强于CDVF-McAb对小鼠的保护力。制备的针对CDVH蛋白的单抗攻毒后其对接种小鼠的保护力远远高于抗CDVF蛋白的单抗。1.2致病机理1.2.1CDV组织嗜性CDV是一种具有广泛组织细胞嗜性的病毒，可感染多种细胞和组织。研究人员应用免疫组化和原位杂交方法对CDV抗原的分布规律进行定位分析研究，CDV分布在呼吸系统、消化系统、淋巴组织、内分泌系统、皮肤组织、中枢神经系统(centralnervoussystem.CNS)和脉管系统的细胞中,包括淋巴样细胞、角蛋白细胞、凝血细胞、成纤维细胞及脑血管内皮、上皮细胞和神经外胚层细胞内均可发现犬CDV的存在[33]。上皮细胞（Epithelialcell）、巨噬细胞(Macrophagocyte)和淋巴细胞（Lymphocyte）[34]是CDV主要的靶细胞。CDV的嗜性可能与细胞上的CDV受体有关。郭爱珍等[35]（2000）,用VOPBA研究表明,Vero细胞膜中存在多种与CDV结合的受体蛋白。1.2.2神经症状及其机理本文统计表明，有15.12%就诊的犬瘟热病例在不同时期表现出神经症状，其中61.50%的患犬在发病后第10到15日左右出现神经症状。少数病例发病初就表现出严重的神经症状，有些病犬仅仅表现神经症状。CDV导致的中枢神经系统（CNS）损害的出现受多种因素的影响，如：病毒毒4 第一章文献综述株、感染动物的年龄和自身免疫状态等。CDV的神经侵染途径主要有：一、血源性[36][37]途径，通过血液中的淋巴细胞侵入血脑屏障；二、随脑脊液在CNS扩散，CDV通过脑脊液的传递作用，病毒可由大脑血管的内皮细胞扩散到CNS，侵害神经元和[38]胶质细胞，引发脱髓鞘脑脊髓炎；三、也有报道称CDV还可沿嗅神经传播。研究表明，大多数出现神经症状的自然感染的犬都发展成脱髓鞘脑白质炎，很少见局[39]限于脑灰质的病变。犬瘟热病毒引起的脑损伤是一种非特异性、非对称性损伤。[40]因此，病犬神经症状的表现形式各种各样。可表现为似鞠躬的踏脚运动、四肢的持续性抽搐、咬肌颤动、间歇性全身性抽搐、空嚼流涎、转圈运动等症状。关于犬瘟热引起的神经中枢的脱髓鞘机理有多种观点，有两种基本途径：体液和细胞途径。体液途径认为在CDV感染的过程中产生了抗髓磷脂抗体或抗髓磷脂基本蛋白抗体。血清补体结合或介导抗体引起细胞毒性反应，而后引起对CNS抗[41]原的效应细胞反应，最后导致脱髓鞘。对脱髓鞘犬瘟热脑炎的研究揭示，细胞因[42]子在该病发挥重要作用，在犬瘟热病灶，前炎性细胞因子显著上调，而此时MMP-9呈最显著的上调。在脱髓鞘犬瘟热脑炎中，MMPs和TIMPs总体上调，呈[40]阶段相关。在实验动物的研究表明，向脑白质中注射髓磷脂抗血清，可出现一些[43]脱髓鞘特征。细胞途径认为，巨噬细胞-单核细胞和少突胶质细胞是主要的脱髓鞘效应细胞。出现神经症状的病例，在脑组织中发现非化脓性脑炎，神经胶质细胞[44]及神经原内有核内和胞浆内包涵体，脑和脊髓有胶质细胞与星状细胞增生。对CNS抗原敏感的T淋巴细胞导致或影响了巨噬细胞和星形胶质细胞的激活，并通过[45]这些细胞吞噬正常CNS的髓磷脂，从而导致脱髓鞘病变。1.2.3免疫抑制机理CDV感染机体后，可以导致机体免疫组织和器官的退行性病变，引起免疫抑制，引起被感染动物的多种继发感染，而免疫抑制导致的继发感染是动物高死亡率的重[34]要原因。犬瘟热导致的免疫抑制国内外学者进行了大量研究：刘雯（2011）通过免疫组织化学(IHE)和原位杂交(ISH)研究CDV体内分布，结果显示CDV主要对肺脏、小肠、脾脏和淋巴结造成严重损害。病毒分布在呼吸道上皮细胞、小肠绒毛上皮细胞、巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞的胞浆中，特别是各组织内的巨噬细胞及淋巴组织发生退行性改变。淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞内含大量CDV抗原，说明淋巴细胞坏死、凋亡和淋巴细胞再生障碍导致的淋巴细胞减少是CDV感染的[46]共同特征，也是引起机体免疫抑制和多种继发感染的主要原因。Krakowkas在体外对犬瘟热病毒感染引起的免疫抑制机理研究结果表明，犬瘟热病毒引起的免疫抑制可通过病毒依赖性和非病毒依赖性两种方式实现。CDV的急性感染期，Thy-1和+CD4T细胞是CDV的主要靶细胞，犬的淋巴细胞信号活性分子(SLAM/CD150)为[47]CDV相应的受体。CDV感染后，病毒与SLAM/CD150受体发生结合，造成细胞[48]结构的破坏与损伤，引起SLAM分子不能执行相应的免疫功能而造成免疫抑制。1.2.4持续性感染犬瘟热病毒的持续感染，指CDV在犬体内长期存在持续增殖，并不断地或间接地向体外散毒，使其他易感动物感染发病。5 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立[49]持续感染的发生机理主要涉及病毒方面和机体方面的多种原因。Gaby等（2010）的研究认为，不需要释放病毒的细胞间传播是持续性感染的原因，病毒的传播可能需要已感染病毒的细胞上的病毒附着蛋白与靶细胞上的未知神经胶质细胞受体的相互作用，细胞间的结合促进了F蛋白在已感染细胞和靶细胞上形成微孔，允许病毒粒子的通过。CDV对CNS的持续感染可经过宿主细胞的加工，选择性传[50]播较远距离的神经细胞，可能以特定的方式装配、成熟，使它能逃脱免疫监视。N蛋白可与基质蛋白结合，对细胞融合产生抑制作用从而限制细胞融合和细胞裂[51][52]解，促进病毒持续性感染。Zuthriggen（1995）报道，CDV疫苗株感染细胞后，以细胞溶解方式传播，产生自我限制性感染，而致病性毒株感染细胞后却未能观察到细胞溶解现象，强毒株是以非细胞溶解型传播，通过集中溶细胞模型释放病毒颗[53]粒。说明病毒的持续性感染与其复制方式存在着某种联系。Plattet等（2005）研究CDVA75/17株在Vero细胞中表达的H和F蛋白的作用，发现H蛋白以受体依赖方式介导细胞融合，而F蛋白以非受体依赖方式介导细胞融合，说明A75/l7株的[54]F蛋白在病毒持续性感染中发挥着重要作用。Nakano等（2009）研究发现，中和抗体可阻止细胞内外病毒的扩散，但抗体的长时间暴露导致病毒表面抗原在细胞膜上内化，然后抗原从宿主细胞胞膜上消失。导致淋巴细胞介导的细胞毒性反应延迟或缺乏。由上可见，由于CDV的免疫抑制作用、CDV通过非溶细胞方式和限制性病毒出芽传播增殖，避免了宿主细胞的破坏，减少病毒蛋白抗原和细胞碎片的释放、病毒抗原在宿主细胞膜上的内化消失避免和延迟了机体的免疫应答反应，造成了病毒在机体内的持续性感染。1.3临床症状犬瘟热是宠物临床上危害犬的主要可致死传染病。犬瘟热的临床症状复杂多样，发病犬首先表现为上呼吸道感染症状。咳嗽、水样鼻分泌物、打喷嚏、体温升高、食欲差等类似感冒症状，因此常常误认为感冒，若不检测难以确诊。统计表明，犬瘟热的发病率为10.97%，但犬瘟热阳性病例数占出现上呼吸道感冒症状病例总数的41.95%，因此对出现以上感冒症状的患病犬进行CDV病毒的检测以排查犬瘟热是很有必要的。部分犬瘟热病例也可出现腹泻便血的胃肠道症状，需与犬细小病毒病鉴别诊断。此后，动物机体产生部分抗体可中和部分胞外病毒及由于CDV的免疫逃避机制，该病可有3天左右的平稳期，体温食欲有所好转，精神状态较好，但若不及时治疗或病情难以控制，病犬可快速发展为严重肺炎、体温升高到40℃以上，出血性肠炎、神经症状等全身性反应。体温升高，在整个疾病的发展过程中体温曲线呈马鞍形；呼吸道感染，病初为水样鼻液，后逐渐发展为粘液性、脓性鼻液，若不及时治疗控制可迅速发展成为严重的肺炎；多数出现结膜炎，眼睛出现浆液性脓性分泌物；部分出现严重的肠炎、足垫增厚；有的CDV感染病例出现神经症状，并且可能同时感染CPV；有的CDV感染犬只仅出现严重的神经系统障碍，表现肌[55]肉痉挛等神经症状，呼吸系统和消化系统症状轻微。6 第一章文献综述1.4诊断技术主要的CDV检测诊断技术包括：病毒分离培养技术、包涵体检测、荧光抗体技术、免疫组化技术、ELISA、胶体金免疫层析技术、RT-PCR、RT-LAMP。此外，还有琼脂扩散试验（AGP）、SPA协同凝集试验、免疫电子显微镜技术、血清中和试验、核酸探针技术等。1.4.1病毒分离技术1.4.1.1病毒培养分离CDV用的组织细胞有原代细胞及传代细胞系两大类。原代培养细胞主要有犬和貂的肺巨噬细胞、肾细胞、T淋巴细胞、鸡胚成纤维细胞等；传代细胞系主要包括：非洲绿猴肾细胞（Vero）、MDCK、BHK21、CRFK、B95a、及Hela等。CDV感染肺巨噬细胞可产生典型的葡萄串状细胞病变，分离成功率高；CDV在鸡胚绒毛尿囊膜上需经多次传代才能分离；较多学者使用Vero成功分离了CDV。病毒分离适用于剖检后检测，取病犬的肺、脑、脾脏、淋巴结等加入PBS研磨，反复冻融数次，离心取上清，加入双抗，按培养量10%接种细胞，逐日观察细胞CPE。[56]曾智勇等（2012）用正常的Vero细胞从胶体金检测CDV阳性病死犬病料中分离[14]CDV，传至第四代出现明显CPE，经鉴定成功分离到一株CDV毒株。王君玮（2008）用能表达SLAM的Vero-DST细胞进行貂、狐、貉的CDV分离培养，产生了明显CPE。1.4.1.2电镜观察电子显微镜观察是可直接观察犬瘟热病毒的方法，取病犬的肺、肝、脾脏、粪便或细胞培养物经处理后使用磷钨酸(PTA)负染观察。CDV有多种形态，多数为球形，直径多在150～330nm之间。成熟病毒粒子上有囊膜及纤突。此外，还有离子捕获电镜技术。1.4.1.3动物回归试验动物回归试验是确定病毒毒力、致病力等的重要技术，是病毒鉴定的重要方法，犬瘟热病毒分离成功后需通过动物接种，接种犬出现眼鼻分泌物、呼吸道感染、双相热等典型犬瘟症状，复制该病才能进一步确诊。犬瘟热病毒接种雪貂，其死亡率达100%。此外，病毒分离培养物还可以通过直接免疫荧光试验、RT-PCR等试验进行鉴定。1.4.2包涵体检测CDV在增殖的过程中，可在宿主细胞内形成一种蛋白质性质的特征性结构。通过HE染色，在普通光学显微镜下可观察到胞浆及核内暗红色或红色的包涵体，有[57]清晰的边界和匀质的边缘，一般呈圆形或椭圆形。犬生前取眼结膜、鼻粘膜、阴[58,59]道粘膜或外周血等,死后取膀胱、肾盂、胆囊等处的粘膜或其他组织器官制成涂[60]片染色镜检。荧光显微技术可见包涵体内CDV抗原。由于其他疱疹病毒、狂犬病、犬传染性肝炎等病毒也可在宿主细胞内形成包涵体，因此，包涵体检查仅能作为辅助手段，需与其他检测结果结合诊断CDV。7 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立1.4.3荧光抗体技术免疫荧光技术(FA)是检测犬瘟热病毒的国际公认手段，用于体外细胞培养物和病犬脏器中CDV的检测。FA结合了抗原抗体反应的特异性、敏感性与显微示踪技术，主要有：直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、补体结合免疫荧光技术等。其中，间接免疫荧光法第一步是抗体与抗原反应，再使用荧光素标记的抗抗体显示。主要试验过程是：样品（血液、粪便、组织涂片等）制备；丙酮固定；与荧光素抗体或[61]单抗孵育后；加荧光素标记的二抗(如羊抗鼠IgG)；显微镜观察判断结果。袁书[62]智（1994）用犬瘟热病毒免疫家兔制备抗血清，并制备了荧光素标记的IgG,建立[61]了检测犬瘟热抗原的荧光抗体技术，其特异性和敏感性高。杨百亮（2004）使用市售的CDV单克隆抗体和荧光素标记羊抗鼠IgG建立的间接荧光抗体技术，临床样品检出符合率为77%。样品检出率与样品的采样部位和采样时间有关。研究显示，病毒感染家犬后第3天便可从粪便或鼻内检测到病毒的存在,而眼和咽分泌物则需[63]要到7天左右。1.4.4酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA广泛应用于动物病毒性抗原和血清抗体检测。ELISA的主要原理是把特定的抗原或抗体吸附在固相载体上，封闭；加入血清与抗原样品进行免疫酶反应；[64]最后加入底物显色，酶标仪测定结果。孙婧等（2013）应用杂交瘤细胞技术，筛选两株MAbG12和A2分别作为捕获抗体和酶标抗体，建立了检测犬瘟热病毒夹心ELISA，该方法与RT-PCR符合率为100%。ELISA具有特异性强、准确度高、灵敏度高等优点，主要用数量较多的样品检测。ELISA在犬瘟热的流行病学调查、免疫效果评估及抗体水平监测中发挥了重要作用。1.4.5胶体金免疫层析技术[65]1971年，Faulk和Taylon首次将胶体金标记技术引入免疫化学。现在，免疫胶体金与固相膜结合，发展了以膜为固相载体的免疫胶体金快速诊断技术并以其携带方便、特异性强、操作简单、快速等优点广泛应用与宠物临床诊断，特别是病毒性疾病的快速诊断。胶体金具有可以通过物理吸附的作用吸附蛋白质的特性，这样的吸附不会影响蛋白质的功能。胶体金试纸条由以下构成：玻璃纤维素膜制成的样品垫、金标垫（喷涂有胶体金标记抗体）、NC膜（分别用CDV抗体和羊抗鼠IgG在其上包被两条平行抗体线，作为检测线和质控线）、吸水滤纸。胶体金试纸条的主要原理：被检样品中的CDV与金标垫上的胶体金抗体结合形成抗原抗体复合物，复合物随液体流动，与NC膜上的抗体结合形成肉眼可见的检测线，未被结合的复合物与羊抗鼠IgG结合也形成可见的对照线，为阳性结果。若样品中无CDV则不能形成抗原抗体复合物，胶体金抗体不能与检测线上的抗体结合形成可见检测线，但羊抗鼠IgG可与胶体金抗体结合，仅形成一条可见的质控[66]线。胶体金免疫层析试纸的灵敏度相对较低，以及采取的样品是眼、眼、口腔分泌物，而对于感染数周的病犬，病毒已从上皮细胞和血液中消退或消失，所以对亚[67]急性和慢性病犬胶体金试纸常得出假阴性的结果。1.4.6RT-PCR8 第一章文献综述RT-PCR是通过设计特异性引物，从基因组中扩增某一段核酸序列的方法。该[68]技术具有特异性强，敏感性高等特点，已广泛用于试验研究和临床诊断。王金福（2009）针对CDVN蛋白基因设计特异性引物，建立了RT-PCR检测方法，对45份可疑病例进行检测，比快速检测试纸多检测出4个阳性样，具有较高的敏感性。[69]易立（2009）根据疫苗株和野毒株在H基因上的差异，设计特异性引物，建立仅能扩增CDV野毒基因的RT-PCR方法，并与能检测所有毒株的RT-PCR方法结合，[70][71][72]建立了能区分疫苗株和野毒株的PCR试验方法。此外，熊炜、郭玲、王兰萍[73]等也建立CDV的RT-PCR检测方法。在RT-PCR的基础上，Shin等建立了巢式PCR。1.4.7实时荧光定量PCR荧光定量PCR（FlurogenicQuantitativePolymeraseChainReaction，FQ-PCR）[74]是在常规PCR技术的基础上发展新技术，分为探针法和染料法。该项技术将实时定量PCR仪与自动分析软件结合，构成实时荧光定量PCR检测系统。FQ-PCR的主要原理是利用反应体系中的荧光信号随PCR产物的积累而不断积累，从而对[75]PCR反应进程进行检测，实现对CDV的检测和定量分析。苏建青（2007）建立[76]的FQ-PCR能检测出达10TCID50的犬瘟热病毒。全传松（2014）建立TaqManFQ-PCR对CDV最低检出量为80copies/μL,是RT-PCR方法的100倍。FQ-PCR具有快速、准确可靠、高灵敏度、高特异性等特点，除可以检测血液、尿液、粪便、口鼻眼分泌物，还可对淋巴结、肝脏、肺、脑等组织样品进行检测，特异性检测CDV并实时监测样品的病毒含量。是临床诊断、病理研究和防控的重要技术手段。1.4.8环介导等温基因扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）[77]RT-LAMP检测方法是Notomi等（2000）最早报道的一种新的核酸扩增技术。LAMP技术采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温（60～65℃）条件下进行核酸扩增。具有操作简单、等温灵敏、省时快速、特异性强、结果易判定等优点，是近年来核酸扩增技术的研究[78]热点。2002年，Nagamine等（2002）对LAMP检测技术进行改进，引入1对环[79]引物，大大地提高了扩增效率。胡嘉欣（2012）针对N蛋白基因上的8个位点，-6设计6条引物，建立了CDVLAMP检测方法，可检测5.6×10ng/μL的RNA，敏感[80]性比RT-PCR高1000倍。杨天阔等（2012）首次建立了鉴别检测犬瘟热野毒株和疫苗株的RT-LAMP方法，灵敏度是RT-PCR的100倍。与传统PCR技术相比LAMP的特异性更强、灵敏度更高、检测时间更短、无需昂贵的设备、操作更简单，[79]有较好的应用前景。但LAMP对试验环境要求较高，实验室气溶胶问题是导致LAMP失败的重要原因，有待解决。犬瘟热的诊断应根据临床症状、病理变化并结合实验室检测进行。以上各种技术方法各有优点与缺陷。血清学检验方法，如中和试验、ELISA、间接免疫荧光在诊断方面仅能作为辅助手段。因高效价血清抗体产生可能是疫苗注射、亚临床和临床感染的结果。且CDV可导致免疫抑制，抗体效价很低。病毒分离与鉴定是确诊犬瘟热的根本办法，但分离试验耗时长且成本高，在临床诊断上的应用受到限制。9 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立直接免疫荧光技术和胶体金试纸在犬瘟热的临床诊断应用广泛，但对慢性或亚急性病例易出现假阴性结果，适用于CD急性病例的诊断。实时荧光定量RT-PCR具有更高的灵敏度，并且可做定量分析，但设备要求高，成本较高。RT-LAMP是一种较新的试验技术，无需昂贵设备，可直接肉眼判定结果，但环境要求高、易污染、易导致实验失败，尚有待解决。RT-PCR方法，是具有较高灵敏度的实验室检测方法，目前临床应用最广，适合于临床诊断，有较好的应用前景。综合考虑选择，直接免疫荧光诊断方法和胶体金免疫层析法适合于急性发病期的检测。RT-PCR、FQ-PCR和RT-LAMP具有较高的灵敏度，可以用于疾病早期、亚急性、慢性病例的检测。1.5犬瘟热疫苗研制1.5.1灭活苗灭活疫苗是将CDV细胞培养物、鸡胚培养物或阳性病变组织等灭活、加入佐剂及一系列安全性试验制备的疫苗。对于病毒变异导致的CDV的流行，灭活苗可[81]快速研制控制疾病流行。曾元根（2001）将提取自CDV病犬组织中的CDV毒种接种7～8日龄鸡胚，鸡胚收毒制成犬瘟热鸡胚灭活苗，用于免疫动物，试验表明[82]该灭活苗使犬可抵抗强毒感染。夏咸柱等（2000）将CDV细胞培养物通过静水压法制备了犬瘟热病毒高压灭活苗，其产生的中和抗体高于福尔马林灭活苗。刘景[83]利等（2009）使用患犬瘟热动物的脏器等组织制作的组织灭活苗，对发病狐进行紧急接种，30只有27只恢复健康。灭活疫苗制作工艺简单、免疫原性和稳定性高[84]等。但是灭活苗也有其缺点：仅能诱导产生体液免疫、灭活苗免疫保护期短、组织灭活苗往往具有较强的副作用、灭活苗所用的灭活剂（福尔马林、EEI、AEI、BEI等）都具有较强的致癌性，因此，灭活苗未得到广泛应用并逐渐被弱毒苗取代。1.5.2麻疹病毒疫苗犬瘟热病毒的N蛋白和F蛋白与MV有很高的同源性，具有共同的抗原决定[85,86]簇，MV可诱导犬产生杀伤CDV的CTL细胞，能抵抗CDV对免疫动物的攻击。因幼犬在6周龄以前免疫系统尚未发育成熟，接种弱毒苗易受母源抗体干扰。[87,88]Chalmrse、何洪斌等试验发现，当幼犬母源抗体效价等于或大于1:8时，对弱毒苗免疫接种会受到明显的干扰，而对中和抗体效价在1:2以下对照组犬的干扰轻[89]微。王权勇（2006）研究结果表明，出生后两日龄的幼犬抗体评价效价为1：12以上，出生后16日龄抗体效价达1:40，37日龄是抗体效价降到了1:20以下。当幼犬母源抗体为1：20时，幼犬对CDV具有易感性。此时，CDV疫苗可被母源抗体封闭，但MV疫苗不受母源抗体干扰且不会中和母源抗体。因此，可以先用麻疹弱毒苗进行免疫，当幼犬有6～8周龄时，接种了麻疹弱毒苗的幼犬可再接种犬瘟热[11]弱毒疫苗。1.5.3弱毒疫苗弱毒疫苗是自然筛选的弱毒株或人工致弱的弱毒株，经过培养后制备的活疫苗。弱毒疫苗的致病力很弱且具有该病毒完整的免疫原性。弱毒疫苗免疫后可以使10 第一章文献综述机体产生体液免疫和细胞免疫，且成本低、用量少、免疫原性好、使用方便、免疫期长，一般可以达1～2年，免疫后可以产生较强免疫记忆，加强免疫后抗体滴度可迅速升高。弱毒疫苗的使用也要注意很多问题，如：弱毒苗热不稳定，需保存在[90]较低的温度下以免失活；弱毒疫苗的免疫期可达1～2年，每年加强免疫一次；若疫苗毒力不稳定或基因变异导致毒力返强，疫苗接种会导致动物发病；大范围的[91]免疫接种造成的免疫压力可能促使基因变异，产生新野强毒株，使免疫犬也发病。母源抗体对弱毒疫苗免疫效果的影响很大，而幼犬的母源抗体滴度可能参差不齐。[92]乔贵林等（1997）试验显示，5周龄试验组免疫犬35d抗体效价多数小于1:9，8周龄以上试验组14天抗体效价大于1:30。可见小于6周龄时的免疫效果差，这也[93]与幼犬6周龄时其细胞介导的免疫应答才完全成熟有关。一般可在6～8周进行首次免疫并间隔2到3周再免疫2次，有条件的地方可以监测母源抗体含量以确定最佳免疫时机。此外，犬用弱毒疫苗应尽量避免使用于其他动物，国内外有小熊猫[94]接种犬瘟热弱毒苗出现死亡并从死亡动物上分离出相同的疫苗株。1.5.4基因工程疫苗犬瘟热发病率高，广泛流行于犬及其他动物。目前该病的治愈率极低，尚无特别有效的药物可用于治疗。控制CD的唯一有效途径是疫苗接种。目前，弱毒疫苗广泛使用于宠物犬的CD预防并起得显著的防疫效果。但是，CD弱毒苗对免疫犬存在一定程度的免疫抑制作用，并且有潜在的神经损伤危害，偶有接种过CD疫苗[95]的犬又发生CD的报道。对于更安全有效的新型CD疫苗的研制国内外的研究人员一直没有中断。应用分子生物学和遗传工程技术研究的新型CD疫苗，主要有亚单位疫苗、核酸（基因）疫苗、重组活载体疫苗。1.5.4.1亚单位疫苗亚单位疫苗是用基因工程技术体外表达某种病原体的有免疫活性的蛋白，加入适当佐剂研究的疫苗。CD亚单位疫苗的研究多数集中于F蛋白、H蛋白和N蛋白的研究，其中H蛋白是研究热点。研究表明，CDV表面糖蛋白在诱导宿主产生中和抗体抵抗CDV方面起重要作用，H蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之[33]一。是抗CDV免疫的重要的抗原，抗CDVH蛋白McAb具有中和病毒活性。在[96]CDV抗原的原核表达研究方面，乌仁高娃（2004）克隆了CDVF蛋白基因缺失疏水区的约1271nt左右的片段，构建了原核表达载体并成功表达了重组蛋白，试验[97]证明该蛋白产生了1:320的荧光抗体效价，具有某些中和性抗原表位。袁颖烁等（2013）部分克隆表达了H蛋白，Westernblotting及ELISA试验结果显示，表达的H蛋白能与抗CDV抗体特异性识别，具有良好免疫反应性，中和试验显示其具[98]有一定的免疫原性。国内学者对于CDV表达抗原免疫犬的试验研究较少。ErlingN[99]用体外表达纯化的H和F蛋白接种犬，证明接种犬可抵抗强毒感染。Viries等将表达的H和F蛋白形成直径100nm的颗粒，再加入皂角糖苷形成复合物。用上述抗原接种的犬产生了特异性抗体，攻毒试验中犬没有发病。说明囊膜糖蛋白可以作为亚单位疫苗用于CD的预防。本试验基于以上研究成果，成功克隆了H蛋白基因约1236nt的片段，构建了原核表达体系并进行诱导表达，试验表明本文表达的H11 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立蛋白免疫原性好，免疫的小鼠产生的抗体含量高，可与犬血清中的抗体特异性结合，具有良好的反应原性。1.5.4.2核酸疫苗核酸疫苗（又称DNA疫苗）是将目的基因插入真核载体，构建重组质粒后导入动物体内，借助宿主细胞的转录翻译系统合成蛋白，诱导机体产生免疫应答。核酸疫苗的免疫不受母源抗体的干扰，能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。可以将含有不同抗原基因的质粒混合起来联合免疫，也可以在同一载体上插入多种外源基因。核酸疫苗在体内存在时间长，可不断表达外源蛋白、易于构建和制备。目前CDV核酸疫苗的研究主要集中在H蛋白、F蛋白和N蛋白。但基因疫苗目前多处于实验室研究阶段，且面临一些问题，如：产生的细胞免疫和体液免疫水平相对[100-101][102]低；产生免疫耐受；有DNA随机整合的风险性等。核酸疫苗的临床应用仍然需逐步解决以上问题。1.5.4.3重组活载体疫苗基因工程重组活载体疫苗是指用基因工程方法将某种病原体的相关抗原基因整合到活载体基因组DNA的非编码区，而构成的活载体疫苗。接种动物后，特定的免疫原基因可随着重组载体基因的复制表达而表达。常用的活载体有痘病毒、腺病毒、麻疹病毒等。活载体疫苗可诱导产生体液免疫、细胞免疫甚至是粘膜免疫，避免了弱毒苗、灭活苗和亚单位疫苗的许多缺点。对于CDV重组活载体疫苗的研究已取得了一定成就，如美国批准了金丝雀痘病毒CDV重组疫苗进入市场。[103]Stephensers（1997）将CDV的H和F基因与痘病毒基因组整合构建重组疫苗，免疫幼貂后该重组疫苗诱导产生了中和抗体。犬腺病毒分为CAV-1和CAV-2。CAV-1为犬传染性肝炎病毒，引起犬传染性肝炎。CAV-2为犬传染性喉气管炎病毒，引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。国内犬瘟热重组活载体疫苗的研究多数基于腺病毒。[104]闫芳等（2004）以CAV-2作为载体构建的CDVH蛋白重组疫苗能够诱导免疫犬产生CAV-2抗体和CDV中和抗体。目前重组活载体疫苗的开发应用，着重于载体毒力致弱及多价或多联重组活载体苗的研究，以及进一步提高疫苗的安全性。1.6治疗犬瘟热的发病率高，动物一旦发病治愈率极低。本文统计的86例犬瘟热病例治愈了10例，治愈率11.62%。由于该病的发病及治疗时间长，仅12例有完整治疗记录，治愈了5例，治愈率41.67%。治疗犬瘟热主要原则是早发现早诊断、提高动物机体抵抗力、抗炎抗病毒、控制继发感染、控制中枢神经（CNS）病变。CDV可引起免疫系统的退行性病变从而导致免疫抑制，因此提高动物的免疫力对于疾病的恢复极为重要。发病早期可大剂量使用高免血清或单克隆抗体；配合使用重组干扰素和白蛋白等提高动物机体的抵抗力；同时使用敏感抗生素治疗呼吸系统的感染及肠道感染；脱水病例及时补充水与电解质；贫血严重的病犬输血疗法有一定的效果[105]；良好的护理也是提高治愈率的重要举措。若犬只出现CNS病变则治愈希望渺小，可选择人道安乐死以减少动物的痛苦。12 第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立犬瘟热（CD）的发病率近年来居高不下，临床资料统计显示，犬瘟热的阳性检出率为10.97%，治愈率仅为11.63%。早期准确快速的诊断对于犬瘟热的治愈具有重要意义。目前宠物临床诊断广泛使用的胶体金检测试纸具有方便、快速的优点，但其敏感性相对低，且存在一定的假阳性，仅适合于犬瘟热急性发病期的检测。RT-PCR方法是近年来应用较多的实验室检测方法，具有很高的特异性和灵敏度，可用于疾病早期、亚急性、慢性病例的检测。随着PCR仪的广泛应用，该方法适合临床推广应用。本研究根据GenBank公布的CDVN蛋白基因保守序列，设计并合成了一对特异性引物。成功建立了CDV快速诊断RT-PCR方法。试验与临床检测应用表明该方法特异性强，敏感性高，对于CD的早期检测有较大意义。2.1材料与方法2.1.1试验材料犬瘟热病料收集自疑似CDV感染的病犬，为眼分泌物、鼻液、唾液、肛门拭纸的混合物，共30份。样品静置沉淀或离心取上清，反复冻融3次，-20℃保存备用。JM109大肠杆菌、伪狂犬阳性病料、CPV阳性病料，由江西农业大学预防兽医学教研组保存。2.1.2试剂2.1.2.1主要试剂CDV胶体金检测试纸，购自韩国安捷公司；饱和酚、RNaseInhibitor、100bpDNATMLadder、Trizol、Taq×2PCRMix、dNTPMix、EasyPureQuickGelExtractionKit购自北京全式金生物技术有限公司；SalⅠ、EcoRⅠ、M-MLV购自Promega公司；λhindⅢ、PMD18-TVector、AmpicillinSodiumSalt购自TaKaRa公司；Tris、SDS、EDTA等购自Solarbio；Agarose购自西格玛公司；犬四联疫苗、犬用狂犬疫苗，购自荷兰英特威(中国)公司；LB培养基、氯化钙、氯化镁、异丙醇、无水乙醇、氯仿、冰醋酸等均为国产分析纯试剂。2.1.2.2相关试剂配制1）50×TAE储存液：Tris242g、冰醋酸57.1mL、0.5MEDTA(pH8.0)100mL，加入ddH2O定容至1000毫升，常温保存。使用时稀释成1×TAE电泳缓冲液。2）EB（溴化乙锭）储存液：10mg/mL，ddH2O，常温保存。3）Ampcillin储存液（100mg/mL）：0.5gAmpcillin加4mLddH2O充分溶解，定容为5mL，用0.22μm细菌滤器滤过除菌，-20℃冰箱保存。4）1%琼脂糖凝胶：Agarose1g加100mL1×TAE缓冲液，加热充分溶解，加10μLEB储存液充分混匀。13 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立5）LB肉汤培养基：称取2.5gLB肉汤培养基，加热溶解于100mlddH2O，121℃高压灭菌。6）LB固体培养基：LB培养基加2g琼脂粉。7）LA液体培养基：在LB肉汤中加入Amp溶液，使终浓度为100μg/mL。8）LA固体培养基：在高压灭菌且冷却到50℃左右的LB固体培养基中加入Amp贮存液，使Amp终浓度为100μg/mL，倒平板，4℃保存备用。9）0.1mol/LCaCl2：称取1.11gCaCl2固体，ddH2O充分溶解，定容至100mL，121℃高压灭菌。10）0.1mol/LCaCl2-MgCl2（80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2）：称取0.76gMgCl2固体，0.22gCaCl2固体，ddH2O溶解，定容至100mL，121℃高压灭菌。11）质粒提取试剂碱性裂解液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris、10mmol/LEDTA，pH8.0；碱性裂解液Ⅱ：2mL1mol/LNaOH、1mL10%SDS、7mLddH2O（现配现用）；碱性裂解液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、2mol/L醋酸。2.1.3设备高速台式冷冻离心机、PCR仪德国艾本德股份公司恒温箱、电泳仪施迅公司紫外分析仪北京君意东方电泳设备有限公司Nanodrop2000微量紫外分光光度计Thermo公司万用电炉北京科伟永兴仪器有限公司小型恒温震荡器上海苏坤实业有限公司2.1.4方法2.1.4.1引物设计根据GenBank公布的CDVN蛋白基因序列（登陆号：EF042819），利用DNAstar的MegAlign软件比对分析其保守序列，用PrimerPremier6.0设计一对特异性引物P1和P2，预扩增RNA片段464nt，引物由Invitrogen公司合成。引物引物序列（5’→3’）在上述N基因位置上游P1ATCAGTATCCTCTCCTTGTTC220～240下游P2GATAAGTCCTCAGCAATCCT664～6832.1.4.2RNA提取与cDNA模板制备使用Trizol法提取病料中的总RNA,具体操作步骤如下：1）病料样品反复冻融3次，高速离心取上清200μL于离心管中，加600μLTrizol；2）加入200µL氯仿，震荡混匀，12000rpm离心6min；3）取上清400µL，加入1000µL异丙醇，颠倒EP管混匀，12000rpm离心6min；4）弃上清，加入1000µL75%乙醇，12000rpm离心2.5min，室温放置10min干燥；5）用含有DEPC的ddH2O溶解沉淀，-20℃保存备用。14 第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立合成cDNA的反转录体系：5×RTBuffer4μLdNTP4μLP2(15μmol/L)1μLRibonucleaseinhibitor(40U/μL)0.5μLM-MLV(200U/μL)1μL总RNA5μLddH2O4.5μLTotal20μL反转录条件：42℃50min；70℃15min。2.1.4.3PCR反应体系及结果判定以P1、P2为引物，cDNA为模板，建立反应体系。同时设立阴性对照，体系如下：2×PCRMix12.5μLP1(15μmol/L)1μLP2(15μmol/L)1μLcDNA2μLddH2O8.5μLTotal25μL1）PCR退火温度优化为确定核酸扩增反应引物最佳退火温度，根据引物的Tm(P1Tm值为60℃，P2Tm值为58℃)值，设置PCR仪中心温度55℃，选取51.5℃、52.3℃、53.4℃、54.4℃、55.5℃、56.6℃、57.7℃、58.6℃为退火温度进行梯度PCR。2）PCR反应与产物鉴定PCR程序：95℃预变性10min94℃变性1min56.6℃退火30s循环30次72℃延伸1min72℃延伸10minPCR扩增产物观察鉴定：取扩增产物7µL，并使用100bpMarker作为对照，1%琼脂糖凝胶电泳40min，取凝胶于紫外分析系统中观察并拍照记录结果。2.1.4.4重组质粒PMD18-T-CDVN构建与测序2.1.4.4.1目的片段胶回收TM按照北京全式金的EasyPureQuickGelExtractionKit说明书操作（所有离心在室温下进行）1)PCR扩增产物凝胶电泳，在紫外分析系统中，用刀片切下含目的条带的尽量15 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立小的凝胶，放入1.5mLEP管中称重，每100mg记为100μL。2)加入3倍体积的GSB，55℃水浴10min，期间颠倒EP管数次使胶块融化。水浴结束胶完全融化后，观察溶液颜色，若为紫色则加入适量3M醋酸钠，调整溶液颜色和GSB颜色相同（黄色）。可加入等倍体积的异丙醇以增加回收量。3)胶溶液室温放置2min左右，加入到吸附柱静置1min，10000×g离心1min，弃流出液。4)加入650μL溶液WashBuffer，10000×g离心1min，弃流出液。可再离心1～2min以去除残留的WashBuffer。5)将吸附柱置于干净的EP管中，开盖静置1min。加入30μL60～70℃的EB溶液，室温静置1min。6)10000×g离心1min，洗脱DNA，-20℃保存备用。2.1.4.4.2JM109感受态细胞制备感受态细胞的CaCl2制备法（0.1mol/LCaCl2和0.1mol/LCaCl2-MgCl2等提前预冷）：1）在JM109平板上取单个菌落，接种于3mL的LB肉汤培养基，37℃震荡培养12h，200r/min。2）取上述菌液50μL，接种于5mLLB肉汤培养基。37℃200r/min震荡培养2～3h，使细菌处于对数生长期。3）将5mL培养物试管分装在1.5mLEP管中，并立即放入冰浴中冷却10min，使之冷却至0℃。4）4℃4100r/min离心10min，弃上清回收细菌。每1mL初始培养物中加入0.6mL预冷的0.1MCaCl2-MgCl溶液（80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2）重悬细菌，置冰浴中30min。5）4℃4100r/min离心10min，弃上清回收细菌。6）每毫升初始培养物用0.06～0.1mL冰冷的0.1MCaCl2重悬，4℃保存。2.1.4.4.3目的基因片段T-A克隆将胶回收的目的基因与PMD18-T相连接，连接体系如下：PMD18-TVector1μL胶回收产物3μLddH2O1μLSolutionI5μL总共10μL加好体系混匀后，置于4℃连接过夜。2.1.4.4.4连接产物转化试验1）在无菌操作台中吸取200μL上述制备的JM109感受态细胞至1.5mLEP管中，加入连接产物10μL，轻轻旋转混匀，冰浴30min。2）将上述连接体系放入42℃的水浴中，刚好放置90s。期间禁止摇动试管，后迅速将管转移至冰浴中，使菌体细胞冷却1～2min。16 第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立3）加入800μLLB肉汤，置37℃、50r/min震荡培养1小时。4）4000r/min离心5min，弃上清，加100μLLB肉汤重悬。5）取上述菌液，均匀涂布于含100μg/mLAmp的LB平皿中，将涂布好的平皿置于室温，待菌液吸收后，37℃倒置培养12～16h。2.1.4.4.5阳性转化子筛选鉴定2.1.4.4.5.1质粒提取鉴定1）挑取转化培养的单个菌落，接种于LA平板培养。2）选取20个上述菌落，接种于3mL含氨苄的LB肉汤，震荡培养12h（37℃）。3）将培养菌液倒入1.5mL的EP管中，13000r/min，30s，离心回收菌体。离心结束后尽可能的吸干培养基。（以下离心均在4℃下进行）4）用100μL冰冷的碱性裂解液Ⅰ将菌体重新悬浮，剧烈涡旋震荡至完全悬浮。5）加入现配的碱性裂解液Ⅱ200μL，快速颠倒5次（但勿震荡），冰浴5min。6）加冰冷的裂解液Ⅲ150μL，反复颠倒离心管，使菌体成絮状物，然后冰浴5min。4℃，13000r/min，离心5min，取上清。8）加入等体积酚：氯仿，混合均匀，13000转/分钟，离心2min。9）取上清加入2倍体积的异丙醇，震荡混匀，室温放置2min。10）4℃，13000r/min，离心5min，弃上清留沉淀。11）加入70%乙醇，颠倒数次，4℃，13000r/min，离心2min，回收DNA干燥。12）加入50μL含RNaseA（0.1mg/mL）的TE重新溶解核酸，37℃水浴20min，-20℃保存。13）取上述提取的质粒进行凝胶电泳鉴定。2.1.4.4.5.2质粒酶切鉴定上述质粒用EcoRⅠ与SalⅠ进行双酶切鉴定，体系如下：10×bufferD2.0μLEcoRⅠ1.0μLSalⅠ1.0μL重组质粒4.0μLddH2O12.0μLTotal20.0μL37℃水浴反应2h，1%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。2.1.4.4.5.3质粒PCR鉴定质粒使用建立的RT-PCR方法进行鉴定：2×PCRMix12.5μLP1(15μmol/L)1μLP2(15μmol/L)1μL重组质粒0.5μLddH2O10μLTotal25μL17 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立2.1.4.4.6重组质粒测序取初步鉴定的PMD18-T-CDVN质粒JM109菌送上海Invitrogen公司测序，测序结果与GenBank收录的相关N基因序列进行同源性比较分析。2.1.4.5敏感性试验取经PCR检测为阳性，且测序鉴定为CDV的样品。提RNA反转录得cDNA，用微量紫外分光光度计测定cDNA的浓度。做10倍倍比稀释进行PCR扩增，验证本PCR检测方法的敏感性。2.1.4.6特异性试验CPV阳性病料、英特威狂犬疫苗、伪狂犬阳性病料及CDV阳性病料按RNA提取方法提取RNA获得cDNA，进行PCR扩增，凝胶电泳观察结果并记录。2.1.4.7临床样品检测应用对30例CDV感染疑似病例，用胶体金试纸和本实验建立RT-PCR方法同时进行检测，对统计结果进行分析。2.2结果2.2.1RT-PCR初步建立结果PCR扩增产物经凝胶电泳后，在紫外分析仪下观察（图2-1）。清晰的显示扩增出的条带在400bp至500bp之间，和预扩增的464bp符合。图2-1RT-PCR检测临床样品电泳图Fig2-1TheelectrophoresisresultsofRT-PCR1:阴性对照；2～4：病料样品；M：100bpDNAmarkerM：100bpDNAmarker，1:negativecontrol，2～4；samples2.2.2退火温度优化试验结果退火温度梯度PCR电泳结果见图2-2，由电泳图可见第3泳道（56.6℃）条带亮且无非特异性条带，选取该温度为最佳退火温度。18 第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立图2-2退火温度优化电泳图Fig2-2TheamplificationofPCRatdifferentannealingtemperature1～8温度从高到低分别为:58.6℃、57.7℃、56.6℃、55.5℃、54.4℃、53.4℃、52.3℃、51.5℃，M:100bpDNAMarker1～8Fromhightolowtemperatures:58.6℃、57.7℃、56.6℃、55.5℃、54.4℃、53.4℃、52.3℃、51.5℃，M:100bpDNAMarker2.2.3重组质粒PMD18-T-CDVN构建与测序结果2.2.3.1PMD18-T-CDVNPCR鉴定提取的重组质粒PCR扩增后的到一条约464bp的特异性条带，和预期的大小符合，初步确定重组质粒PMD18-T-CDVN构建成功，结果如下图2-3：图2-3质粒PMD18-T-CDVNPCR鉴定电泳Fig2-3IdentificationofplasmidPMD18-T-CDVNwithPCR从左到右分别为：空白对照；质粒PMD18-T-CDVN；100bpDNAMarkerFromlefttoright:blankcontrol,PMD18-T-CDVNplasmid,100bpDNAMarker19 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立2.2.3.2PMD18-T-CDVN双酶切鉴定重组质粒PMD18-T-CDVN经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后，结果如图2-4，可见酶切得到了两个条带，一条为PMD18-T载体的线性片段，大小约为2686bp，一条为CDVN片段，大小约为464bp，片段大小与符合预期，表明重组质粒构建成功。图2-4PMD18-T-CDVN双酶切鉴Fig2-4DoubleenzymedigestionofPMD18-T-CDVNplasmidM：λhindⅢDNAMarker；1,2：质粒PMD18-T-CDVN；3：质粒双酶切产物M：λhindⅢDNAMarker；1,2：PMD18-T-CDVNplasmid；3：Productsofrecombinantplasmiddoubleenzyme2.2.3.3PMD18-T-CDVN测序结果2.2.3.3.1重组质粒测序结果测序结果（GenBankaccessionKJ540921）如下：GATAAGTCCTCAGCAATCCTGTTCCTAACAAAATCAAGCCAGATTTTGTTCATTCTAAATTCCCCGACCACACGTCTCTGTTGGGTATACTTAATCCATCTCCTCATTTCCGAGTCGGCTGCGGTATCAGGAGCAGTCACTGCTTTAGCGAGCAGGATCCAAATTTGGGCCAAGATGGAAGCTAGCAATATATTGAATTGTTCAGCATCATCAACTTCTATGTCTACAATATCCTTATTCTCCAACCAGCCTAATTGCCCTTGAGCTTTCGACCCTTCGTCTACAATTTTGAAGAACTCATCTGCCTCAGAATCCAAACTTGCTCCTCTGGATGCAAATGTAAGACCACAAACAGAGTTGATGCTTGGGATTACCTCTACTAACTTGATGCTCACATCAGGGTCGTCTATGATCCTTTGGATCAACTGTCCAGGGGATTCCACGAACAAGGAGAGGATACTGAT2.2.3.3.2测序结果分析把PMD18-T-CDVN测序结果与相关序列进行分析。相关序列登录号为：kc667070、ab753775、af305419、ay466011、dq522030、ef042819、ef375619、gq503349、hm596313、hq850149、jf965338、jn896331、jx276747。KJ540921为本试验扩增产物测序结果。同源性分析结果见表2-1，该基因片段与其他地区相关核苷酸序列的同源性在94.8～98.5之间，说明本试验扩增的序列是CDVN蛋白基因序列。20 第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立表2-1扩增序列与相关基因同源性比较Table2-1Thehomologyanalysistorelatedgene2.2.4RT-PCR敏感性试验结果由图2-6可见，设定提取的cDNA的浓度为1，则1号至5号cDNA浓度分别0-1-2-3-4为：10、10、10、10、10，稀释1000倍时有特异性条带，即cDNA模板经1：310稀释仍可扩增出产物。通过微量紫外分光光度计测得4号cDNA的A260为0.075，计算得其浓度为2.475ng/µL。可见本试验建立的RT-PCR方法的敏感性较高。图2-6RT-PCR敏感性试验Fig2-6detectionlimitofRT-PCR0-1-2-3-4M:100bpDNAmarker；1～5：cDNA浓度分别为10,10,10,10,10；阴性对照；阳性对照0-1-2-3-4M:100bpDNAmarker,1～5：concentrationofcDNA10,10,10,10,10,negativecontrol,positivecontrol2.2.5RT-PCR特异性试验结果由图2-7可知，只有CDV阳性病料扩增出特异性464bp的基因片段，CPV阳性病料、英特威狂犬疫苗、伪狂犬阳性病料均未见特异条带。21 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立图2-7RT-PCR特异性试验Fig2-7SpecificitytestofRT-PCRM：100bpDNAMarker；1：CPV阳性病料；2：英特威狂犬疫苗；3：PRV阳性病料；4：CDV阳性病料M：100bpDNAMarker；1：PositivesamplesofCPV；2：NobivacRabiesvaccine；3：PositivesamplesofPRV；4：PositivesamplesofCDV2.2.6临床应用结果对30例疑似CDV感染病例进行犬瘟热病毒检测（表2-2）。胶体金试纸检测出了26例阳性、3例阴性、1例可疑。而本试验建立的RT-PCR方法检出27例阳性、3例阴性。表2-2RT-PCR临床应用试验结果统计Table2-1ComparisonoftheRT-PCRassayanddetectionplateofcolloidalgold编号胶体金RT-PCR编号胶体金RT-PCR编号胶体金RT-PCR1++11++21++2++12++22++3++13−−23++4++14++24++5++15++25++6−−16++26++7++17++27−−8++18++28++9+/-+19++29++10++20++30++合计89合计99合计99胶体金试纸阳性检出率：86.7%，RT-PCR阳性检出率:90%+：检测结果阳性；−：检测结果阴性；+/-：测试板条带显示不清晰，检测结果可疑统计结果显示，RT-PCR阳性检出率高于胶体金试纸的阳性检出率。说明本试验建立的RT-PCR方法检出率较高、技术稳定。可疑病例已表现出犬瘟热早期症状，但胶体金检测条带很淡，若不细看常漏诊。可疑病例通过RT-PCR技术可以扩增出特异性目的条带而确诊。因此RT-PCR对于CDV的早期诊断有较大优势。2.3讨论犬瘟热的诊断应根据临床症状和病理变化并结合实验室检测进行。中和试验、ELISA、间接免疫荧光等血清学检测方法在诊断方面仅能作为辅助手段，因为高效价血清抗体产生可能是疫苗注射、亚临床和临床感染的结果，不能作为感染野毒的依据，且CDV可导致免疫抑制，抗体效价很低。病毒分离与鉴定是确诊犬瘟热的根本的准确方法，但分离试验昂贵耗时长。直接免疫荧光技术和胶体金试纸在犬瘟热的临床诊断应用广泛，但对慢性或亚急性病例易出现假阴性的结果，适用于CD22 第二章犬瘟热RT-PCR检测方法的建立急性病例的诊断。实时荧光定量RT-PCR具有更高的灵敏度，并且可做定量分析，但成本高。直接免疫荧光诊断方法和胶体金免疫层析法适合于急性发病期的检测。RT-PCR灵敏度仅次于荧光定量PCR，随着PCR仪在临床上的广泛应用，本方法适合兽医临床用于犬瘟热的早期、亚急性、慢性病例的检测。研究表明尿液，粪便，口腔、鼻、眼分泌物中CDV含量很高，并且在发病全程都可以检测到，是获得病毒样品的常用部位。但是症状轻重不同、发病阶段不同、[106]不同时间，以上分泌物的量和病毒滴度不同，且临床采样过程中受人为操作等因素的影响，采集的检测样品的病毒含量会有差异，因此导致胶体金检测出现假阴性结果。RT-PCR技术的灵敏度高、特异性强，最大限度的消除干扰因素提高了CDV的诊断率。针对CDV的不同基因片段，已有较多研究人员建立了犬瘟热的RT-PCR[72]检测方法，并且报道了所建立的检测方法的敏感性，但敏感性高低不一。王兰萍[68]（2002）报道其建立的RT-PCR方法的最低检测量为10pgcDNA；王金福（2009）报道其RT-PCR方法cDNA的最大稀释度1000倍，本实验建立的RT-PCR方法的敏感性与王金福的报道相符。CDV核酸为不分节段的单股负链RNA。RNA的提取条件要求较高、其极易被污染、易被酶降解，所以在试验过程中应严格操作。试验表明反复冻融有利于细胞、病毒的裂解，可提高RNA的提取浓度，提高检测的准确性。此外，试验中还应设立阳性对照、阴性对照、空白对照以保证试验结果的可靠性。2.4小结1）根据CDVN蛋白保守基因序列，设计了一对特异性引物P1和P2，预扩增RNA片段464nt，成功建立犬瘟热RT-PCR检测方法。通过灵敏性试验和特异性试验，说明所建立的CDVRT-PCR方法具有较高的特异性和敏感度。2）应用本文建立的RT-PCR方法，对30例CDV感染疑似病例病料进行核酸扩增。检出27例阳性，阳性检测率为90%，比胶体金试纸的检出率高。23 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达血凝素蛋白（Hemagglutininprotein，H）是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的重要抗原。血凝素蛋白编码基因ORF起始于全基因序列的7079～7081nt位的ATG，Onderstepoort疫苗株ORF全长1815nt。多数毒株ORF全长1824nt，编码607个aa，分子量84kDa。H蛋白属于Ⅱ型糖蛋白，N端35～55位aa形成一个仅有的疏水性区域。本试验去除H基因N端高度疏水区489个核苷酸，设计引物克隆了南昌地区样品毒株长1236nt的H基因片段。成功构建PMD19-T-CDVH重组质粒并测序，证明成功克隆了CDVH基因片段并进行了同源性及进化树分析。本试验将克隆获得的H基因插入到原核表达载体pET32a，构建原核表达重组质粒pET32a-CDVH，建立了能表达H蛋白的原核表达体系。使用最佳浓度的IPTG对原核表达质粒进行诱导表达，对表达产物进行纯化。3.1材料与方法3.1.1菌株和质粒pMD19-TVector购自TaKaRa公司，pET-32a质粒、Rosetta菌、BL21菌、JM109大肠杆菌由江西农业大学预防兽医学教研组保存。3.1.2试验CDV样品收集自江西农大兽医院就诊犬的口鼻分泌物，RT-PCR检测阳性。3.1.3生化试剂RNaseInhibitor、100bpDNALadder、RNaseA、Trizol、Taq×2PCRMix、TMdNTPMix、EasyPureTMQuickGelExtractionKit、ProteinIsoNi-NTAResin购自北京全式金生物技术有限公司；SalI、EcoRI、ReverseTranscriptaseM-MLV购自Promega公司；λhindⅢ、PMD19-TVector、AmpicillinSodiumSalt购自TaKaRa公司；PrestainedProteinLadderMarker购自Fermentas公司，卡那霉素、Acrylamide、N,N'-Methylenebisacrylamide、过硫酸铵、SDS、TEMED、Tris碱、β-巯基乙醇、尿素、考马斯亮蓝R250、溴酚蓝、甘氨酸、Tris、SDS、EDTA、TristonX-100、氧化性谷胱甘肽（GSSG）、氧化型谷胱甘肽（GSH）、溶菌酶、PEG2000等购自Solarbio；CaCl2、MgCl2、氯仿、乙醇、乙酸等购自西珑化工；甲醇、冰乙酸购自天津富宇精细化工有限公司；饱和酚购自上海生工有限公司；Agarose购自西格玛公司；HRP羊抗鼠IgG、HPR兔抗犬IgG购自中衫金桥公司。3.1.4主要仪器设备恒温箱、电泳仪施迅公司双垂直板电泳槽北京六一仪器厂紫外分析仪北京君意东方电泳设备有限公司Nanodrop2000微量紫外分光光度计Thermo公司JY92-ZD超声细胞破碎仪宁波新芝生物科技有限公司小型恒温震荡器上海苏坤实业有限公司24 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达生化培养箱上海博讯实业有限公司脱色摇床其林贝尔仪器制造有限公司温控磁力搅拌器天坛市医疗器械厂PCR仪、高速台式冷冻离心机德国艾本德股份公司3.1.5培养基和部分试剂配制部分培养基与试剂配制同2.1.2.2。1）IPTG贮存液（800mmol/L）：取IPTG1.0g溶于2mL灭菌水中，定容为5mL，0.22μm细菌滤器过滤，置于-20℃冰箱备用。2）1.0mol/LTris-Cl(pH8.0)：称取60.55gTris溶于400毫升ddH2O，调PH为8.0，加ddH2O定容为500毫升,121℃高压。3）0.5mol/LEDTA：称取9.305gEDTA溶解于40mLddH2O中，调节pH至8.0，定容为50mL，灭菌，4℃保存。4）溴酚蓝蔗糖溶液：0.25%（m/v）溴酚蓝，40%（m/v）蔗糖。5）TE(pH8.0)：100mmol/LTris-Cl，10mmol/LEDTA，pH8.0，121℃高压灭菌。3.1.6质粒提取试剂配制1）碱性裂解液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris、10mmol/LEDTA，盐酸调节pH8.0，121℃高压灭菌，2）碱性裂解液Ⅱ：现配现用，2mL1MNaOH、1mL10%SDS、7mLddH2O。3）碱性裂解液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、2mol/L醋酸。4）70%乙醇：70mL无水乙醇，加30mL灭菌的蒸馏水，4℃保存。3.1.7蛋白电泳相关溶液配制1）30%丙烯酰胺（Acr-Bis）：Acrylamide14.5g、N,N'-Methylenebisacrylamide0.5g完全溶解与50mLddH2O，置棕色瓶，4℃保存。2)10%过硫酸胺(AP)：称取0.5g过硫酸胺，溶于双蒸水中，定容至5mL，-4℃避光保存。3）10%SDS：称取SDS10g加入到90mLddH2O中，恒温68℃搅拌至完全溶解，最后定容至100mL。4）1.5MTris-Cl（pH8.8）:称18.71gTris溶解在80mLddH2O，调节pH为8.8，定容至100mL，高压。5）0.5MTris-Cl（pH6.8）:称6.06gTris溶解在80mLddH2O，调节pH为6.8，定容至100mL，高压。6）1×蛋白电泳缓冲液：甘氨酸Gly18.8g，Tris3.02g，SDS1g，加水定容至1000mL，现配现用，短期内可反复使用两次。7）1×SDS凝胶上样缓冲液：双蒸水4mL，0.5mol/LTris-Cl(pH6.8)1.0mL，甘油0.8mL，10%SDS1.6mL，β-巯基乙醇0.4mL，0.1%溴酚蓝0.2mL，定容为8mL。8）考马斯亮蓝染色液：将0.25g考马斯亮蓝R250溶解于90mL甲醇:水(1:1)和10mL冰醋酸溶液中，滤纸过滤除去大颗粒，室温保存。9)脱色液：醋酸100mL、乙醇50mL、双蒸水850mL，充分混合，室温保存。25 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立10）蛋白电泳凝胶配制：试剂12%分离胶（10mL）浓缩胶（5mL）30%Acr-Bis4.0mL0.665mL10%AP50μL25μL1.5MTris-Cl2.5mL—0.5MTris-Cl—1.25mL10%SDS100μL50μL去离子水3.34mL3.05mLTEMED10μL5μL3.1.8蛋白纯化试剂配制1）磷酸盐缓冲液（PBS）:NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，溶解于800mLddH2O,调节pH7.4，定容为1000mL，121℃高压蒸汽灭菌。2）包涵体洗液Ⅰ:50mmol/LTris-Cl、1mmol/LEDTA、100mmol/LNaCl，用PBS溶解，pH8.0。3）包涵体洗液Ⅱ：:50mmol/LTris-Cl、100mmol/LNaCl、2mol/LUrea、0.1%TritonX-100，PBS溶解。4)溶菌酶（10mg/mL）：0.05g溶菌酶，用5mL10mmol/LTris-Cl（pH8.0）溶解。5）8M尿素（Urea）：40.048gUrea，用60mLddH2O溶解，定容至100mL，4℃避光保存。6）5M咪唑储存液：咪唑0.681g，加ddH2O溶解至2mL。7）平衡缓冲液：10mmol/LTrisbase、100mmol/LNaH2PO4、8mol/LUrea，pH8.0。8）洗涤液：用平衡缓冲液配制含10mmol/L咪唑的溶液。9）洗脱液：用平衡缓冲液和5M咪唑储存液配制50mmol/L咪唑洗脱液：100μL5mol/L咪唑，9.9mL平衡缓冲液，配10mL100mmol/L咪唑洗脱液：200μL5mol/L咪唑，9.8mL平衡缓冲液，配10mL150mmol/L咪唑洗脱液：300μL5mol/L咪唑，9.7mL平衡缓冲液，配10mL200mmol/L咪唑洗脱液：400μL5mol/L咪唑，9.6mL平衡缓冲液，配10mL10）20%乙醇：2mL无水乙醇，用8mLddH2O稀释。3.1.9蛋白复性试剂配制1）透析袋处理液2%（W/V)NaHCO3：20gNaHCO3，溶于1000mL蒸馏水中；1mmol/LEDTA（pH8.0）：0.0372gEDTA溶解于80mL蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。2）透析液A：20mmol/LTris-Cl，pH8.0。3）透析液B：20mmol/LTris-Cl，6mol/LUrea，pH8.0。4）透析液C：20mmol/LTris-Cl，4mol/LUrea，pH8.0。26 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达5）透析液D：20mmol/LTris-Cl，2mol/LUrea，pH8.0。6）透析液E：20mmol/LTris-Cl，1mol/LUrea，pH8.0。7）透析液F：20mmol/LTris-Cl，0.1mol/LUrea，2mmol/LEDTA，1mmol/LGSH，0.1mmol/LGSSG，pH8.0。8）透析液G:20mMTris-Cl,25mmol/LNaCl，pH8.0。3.1.10试验方法3.1.10.1引物设计根据GenBank数据库中的CDVH基因序列（登录号:HM749644.1），通过PredictProte网站在线分析蛋白质的结构（id=495008），去除N端高度疏水区的489个nt，选取富含二级结构的490～1725nt（HM749644.1位置）设计引物，并在上下游的5’端分别添加了EcoRI和SalI酶切位点及保护性碱基。预扩增基因片段大小为1236nt，编码412个氨基酸。上游CDVH-P1:CTGGAATTCGCATCGGCAGCAAATC下游CDVH-P2:ATCGTCGACACACCACAAATCGTCATCC3.1.10.2病毒RNA提取用Trizol法提取病料中的总RNA。具体操作步骤如下：1）把收集的样品置-20℃冰箱冻融3次以上，高速离心2min，吸取上清液200μL于EP管中，加600μLTrizol并在室温放5min；2）加入200µL氯仿混匀，震荡混匀，12000rpm离心6min；3）取上清400µL加入1000µL异丙醇，颠倒EP管混匀，12000rpm离心6min；4）弃上清加入1000µL75%乙醇，12000rpm离心2.5min，室温放置10min干燥；5）沉淀用20µL含DEPC的无菌ddH2O溶解，-20℃冰箱存放。3.1.10.3RT-PCR1)以南昌地区CDV阳性样品作为毒株来源，提取RNA。合成cDNA的反转录体系：5×RTBuffer4μLdNTP4μLP2(15μmol/L)1μLRibonucleaseinhibitor(40U/μL)0.5μLM-MLV(200U/μL)1μL总RNA5μLddH2O4.5μLTotal20μL反转录条件：42℃50min；70℃15min2)PCR反应体系及结果判定以CDVH-P1、CDVH-P2为引物，cDNA为模板，建立PCR体系，同时设立阴性对照。27 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立反应体系如下：2×PCRMix12.5μLH-P1(15μmol/L)1μLH-P2(15μmol/L)1μLcDNA2μLddH2O8.5μLTotal25μL3)PCR程序：95℃预变性5min94℃变性1min49℃退火1min循环32次72℃延伸2min72℃延伸10min产物经1%琼脂糖凝胶电泳40min，于紫外分析系统中观察结果。3.1.10.4H基因的克隆测序3.1.10.4.1PCR产物胶回收纯化TMPCR产物凝胶电泳，按照北京全式金EasyPureQuickGelExtractionKit说明书操作，方法同2.1.4.4.1目的片段胶回收3.1.10.4.2JM109感受态细胞制备感受态细胞的CaCl2制备法方法同2.1.4.4.23.1.10.4.3H基因片段T-A克隆将胶回收的目的基因与PMD19-T相连接，连接体系如下：PMD19-TVector1μLH片段胶回收产物3μLddH2O1μLSolutionⅠ5μLTotal10μL加好体系混匀后，置于16℃连接3小时。将连接成功的重组质粒命名为PMD19-T-CDVH。3.1.10.4.4连接产物转化试验方法同2.1.4.4.43.1.10.4.5重组细菌筛选鉴定3.1.10.4.5.1重组质粒PMD19-T-CDVH的提取鉴定1）挑取转化培养的单个菌落，接种于LA平板培养。2）选取20个上述菌落，接种于3mL含有LA肉汤，震荡培养12h（37℃）。3）将培养菌液倒入1.5mL的EP管中，13000r/min，30s，离心回收菌体。离心结束后尽可能的吸干培养基。（以下离心均在4℃下进行）28 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达4）用100μL冰冷的碱性裂解液Ⅰ将菌体重新悬浮，剧烈涡旋震荡至完全悬浮。5）加入现配的碱性裂解液Ⅱ200μL，快速颠倒5次（但勿震荡），冰浴5min。6）加冰冷的裂解液Ⅲ150μL，反复颠倒离心管，使菌体成絮状物，然后冰浴5min。4℃，13000r/min，离心5min，取上清。8）加入等体积酚：氯仿，混合均匀，13000转/分钟，离心2min。9）取上清加入2倍体积的异丙醇，震荡混匀，室温放置2min。10）4℃，13000r/min，离心5min，弃上清留沉淀。11）加入70%乙醇，颠倒数次，4℃，13000r/min，离心2min，回收DNA干燥。12）加入50μL含RNaseA（0.1mg/mL）的TE重新溶解核酸，37℃水浴20min，-20℃保存。13）取上述提取的质粒进行凝胶电泳鉴定。3.1.10.4.5.1重组质粒双酶切鉴定上述质粒用EcoRⅠ与SalⅠ进行双酶切鉴定，体系如下：10×bufferD2.0μLEcoRⅠ1.0μLSalⅠ1.0μLPMD19-T-CDVH4.0μLddH2O12.0μLTotal20.0μL37℃水浴反应2h，1%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。3.1.10.4.6重组质粒测序取经鉴定含质粒PMD19-T-CDVH的JM109宿主菌,送Invitrogen公司测序。使用DNAstar和MEGA5软件，把测序结果与GenBank收录的CDVH基因核苷酸进行分析。3.1.10.5重组表达质粒pET32a-CDVH的构建3.1.10.5.1表达载体pET32a与PMD19-T-CDVH双酶切用EcoRⅠ与SalⅠ对提取的质粒进行双酶切，体系如下。电泳后用试剂盒TMEasyPureQuickGelExtractionKit，回收带有粘性末端的线性基因片段。10×bufferD4.0μLEcoRⅠ2.0μLSalⅠ2.0μLPMD19-T-CDVH/pET32a质粒10.0μLddH2O2.0μLTotal20.0μL3.1.10.5.2表达载体与目的基因连接T4DNA连接酶连接带粘性末端的目的基因CDVH和表达载体pET32a，构建重组表达质粒pET32a-CDVH。29 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立连接体系如下：CDVH片段6.0μLpET32a双酶切产物2.0μLT4DNALigase1.0μL5×T4DNALigaseBuffer1.0μL总共10μL16℃连接过夜。3.1.10.5.3转化方法同2.1.4.4.4，感受态细胞为BL21和Rosetta。分别命名为BL21-pET32a-CDVH和Rosetta-pET32a-CDVH。3.1.10.5.4重组细菌筛选鉴定3.1.10.5.4.1重组质粒pET32a-CDVH的提取鉴定提取方法同3.1.10.4.5.13.1.10.5.4.2重组质粒pET32a-CDVH双酶切鉴定上述质粒用EcoRⅠ与SalⅠ进行双酶切鉴定，体系如下：10×bufferD2.0μLEcoRⅠ1.0μLSalⅠ1.0μLpET32a-CDVH5.0μLddH2O11.0μLTotal20.0μL37℃水浴反应2h，1%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。3.1.10.6目的基因诱导表达3.1.10.6.1诱导表达步骤1）挑取Rosetta-pET32a-CDVH平板的单个菌落，以及pET32a空载体转化细菌接种于LA液体培养基中，37℃，200r/min震荡培养过夜。2）按1:100接种2mLLA液体培养基中，37℃，200r/min震荡培养，2～3小时，至OD值约为0.6。3）加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200r/min震荡培养，诱导表达6h。4）诱导后，把浑浊的菌液分装于离心管，12000r/min，离心回收菌体。5）细菌沉淀加入1mLPBS，混匀，12000r/min，离心5min，重复洗涤3次。6）加入200μLPBS重悬，4℃保存备用。7）取100μL菌液，按1:1加入1×SDS凝胶上样缓冲液，沸水中煮10min。期间注意防止液体溢出或进水。3.1.10.6.2SDS-PAGE电泳1）将清洗干净的玻璃板按要求固定于电泳槽，将12%分离胶用200μL移液器注入到两玻璃板的夹层至离边缘2cm左右。用双蒸水或30%酒精封面，置室温凝固。30 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达2）当分离胶凝固时，可见水或酒精分层处有一条明显的白线，此时弃去封面液体，吸干。加入浓缩胶，插入点样梳子，置室温待凝固。3）凝固后，拔掉梳子。把胶安装在电泳槽上，并加入1×蛋白电泳buffer。4）将预先处理好的蛋白样品和蛋白Marker小心加入凝胶的加样孔中。5）连接电泳仪，先用电压60V电泳，待样品在浓缩胶底部浓缩成一条线后，调大电泳电压为110V，待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时，停止电泳。6）小心取下胶块，置于考马斯亮蓝染液中染色3～4小时。7）染色结束后，转移至脱色摇床（脱色液）中脱色。3.1.10.7目的基因诱导表达条件优化3.1.10.7.1IPTG诱导浓度优化试验方法按照3.1.10.6，诱导表达组共6个浓度，在菌液OD约为0.6处于对数生长期，依次加入IPTG至终浓度分别为：0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L。同时设立诱导表达空白对照组、32a诱导表达1.0mmol/L组。SDS-PAGE电泳观察记录结果。3.1.10.7.2最佳诱导表达时间试验试验方法按照3.1.10.6，H蛋白诱导表达试验组共6个试管，每支试管均加入1.0mmol/LIPTG进行诱导表达，从第2小时开始，每间隔1小时取出一支试管，离心制备电泳样品。最后进行SDS-PAGE电泳观察记录结果。3.1.10.8重组蛋白大量表达及初步纯化3.1.10.8.1大量诱导表达1）挑取Rosetta-pET32a-CDVH单个菌落，接种于5mLLA液体培养基中，37℃，200r/min震荡培养过夜。2）按1:100接种300mLLA液体培养基中，37℃，200r/min震荡培养，2-3小时，至OD值约为0.6。加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200r/min震荡培养，诱导表达6h。3)用30ml的离心管分装诱导表达后的菌液，冷冻离心机5000r/min离心10min。弃上清，用PBS缓冲液重悬，离心。重复洗涤3次后加入30mLPBS保存。4）向上述菌液中加入溶菌酶，使得菌液终浓度为1mg/mL，37℃温浴30min。3.1.10.8.2超声裂解菌体将溶菌酶处理后的菌液，放置在冰浴中进行超声裂解30min。取裂解后的菌液涂片，用革兰氏结晶紫染色1min，显微镜观察，若没有完整菌体则超声破碎完全。取1mL超声裂解菌液，12000r/min离心5min，沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白表达形式。3.1.10.8.3包涵体洗涤1）将超声破碎菌液取1.5mL于10个1.5mLEP管，12000r/min，离心10min，回收沉淀。重复加菌液操作一次。2）向离心后的沉淀中加入包涵体洗涤液Ⅰ各1mL，充分重悬沉淀，4℃放置20min，4℃，12000r/min离心10min，弃上清，重复2次。31 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立3）加包涵体洗涤液Ⅱ，充分混匀置冰箱冷藏室20min，12000r/min4℃冷冻离心10min，回收沉淀。重复两次。4）向每支EP管分别加入0.5mL8M尿素重悬，4℃放置12小时。4℃，12000r/min离心20min，取上清保存。3.1.10.9重组H蛋白过柱纯化TM按照全式金ProteinIsoNi-NTAResin说明书操作。1）装柱：取1.5mLNi-NTA介质混匀后加入层析柱，室温静置10min，待介质液体分层后，打开出液口，让乙醇流出。2）平衡：5mL平衡缓冲液平衡层析柱30min。3）上样：包涵体样品经离心后，过4.5nm滤器。然后加入层析柱，4℃静置2h，然后缓慢放出液体并收集。4）洗涤：用10mL洗涤液洗涤层析柱，收集流出液。5）洗脱：为了得到一个最佳洗脱条件，需要对洗脱液的咪唑浓度进行优化，用1mL不同浓度的咪唑（50mmol/L，100mmol/L，150mmol/L，200mmol/L等）梯度洗涤。6）用5mL平衡缓冲液洗涤层析柱。7）用5mL灭菌双蒸水洗涤层析柱。8）用5mL20%乙醇洗涤层析柱。9）加入3mL20%乙醇，层析柱保存于4℃。10)取30μL各步骤收集的流出液进行蛋白电泳。3.1.10.10重组H蛋白透析复性3.1.10.10.1透析袋处理操作过程中需佩戴手套1）把透析袋剪成10～20cm的小段，在500mL2%（W/V)NaHCO3中煮沸10min。冷却后用蒸馏水反复漂洗。2）在含1mmol/LEDTA（pH8.0）的沸水中煮10分钟，冷却后用ddH2O将透析袋内外反复冲洗，用橡皮筋扎紧一端。3.1.10.10.2透析复性1）把过柱后收集的蛋白溶液用透析液A适当稀释，装入透析袋中。用橡皮筋扎紧两端后悬挂在1L烧杯，向烧杯内加入透析液B，浸没透析袋。置于磁力搅拌器搅拌，4℃恒温箱透析12小时。2）按尿素浓度递减更换透析液C、D、E、F，均透析12小时。3）最后用透析液G透析12h，取出。4）用PEG2000对透析液进行浓缩，分装保存。3.1.10.10.3蛋白浓度测定用Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定蛋白溶液的浓度。32 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达3.1.10.11重组H蛋白免疫小鼠试验选取10只月龄、体型相近的昆明鼠，随机分成试验组和对照组两组，每组5只小鼠。免疫前三日，小鼠断尾采血，离心得血清，-20℃保存备用。试验组首次免疫使用完全弗氏佐剂乳化纯化蛋白，乳化剂与蛋白溶液的比例为1:1，使用注射器乳化完全。每只小鼠腹部皮下注射100μg蛋白。间隔14日免疫一次，共免疫四次，其中第2～4次使用不完全弗氏佐剂乳化。对照组使用生理盐水替代蛋白溶液乳化，免疫方案与试验组相同。第4四次免疫后10天断尾采血，离心获血清保存备用。3.1.10.12重组H蛋白免疫小鼠抗体效价检测小鼠血清倍比稀释，测定免疫后小鼠血清抗体效价。1）复性的H蛋白抗原稀释成7.5μg/mL，包被96孔酶标板，先放在37℃恒温箱中反应1小时，然后在4℃冰箱放置12小时。2）甩掉包被液，拍干，加入150μLPBST洗涤，洗涤3次。每孔加入150μL1%明胶封闭液，湿盒37℃，封闭2h。3）甩干封闭液，150μLPBST洗涤5次，加100μL倍比稀释的小鼠血清，湿盒37℃反应1小时。4）弃反应液，150μLPBST洗涤5次，加羊抗鼠二抗（1:5000），湿盒放置1h。5）弃二抗反应液，PBST洗涤5次，加入100μL底物工作液，避光反应15min。6）加入50μL终止液，轻微震荡5min后，酶标仪测定OD492。3.2结果3.2.1重组质粒PMD19-T-CDVH构建3.2.1.1目的基因PCR扩增以CDVH-P1和CDVH-P2为引物，通过初步优化条件进行PCR，琼脂糖凝胶电泳可见在1000～1500bp间约1236bp位置有一较亮条带(图3-1)，与预扩增的产物大小一致。图3-1H基因PCR扩增电泳Fig3-1TheelectropherogramofPCRforamplificationM：100bpDNALadder；1：阴性样品；2：阳性样品M：100bpDNALadder；1：negativesample；2：positivesample33 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立3.2.1.2重组质粒PMD19-T-CDVH双酶切鉴定PMD19-T-CDVH用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，电泳结果如图3-2。只有两条条带，一条为大小约2692bp的PMD19-T载体线性片段，一条为大小约1236bp的CDVH基因片段，酶切片段大小与预期相符合，表明已成功构建了重组质粒。图3-2PMD19-T-CDVH双酶切电泳图Fig3-2DoubleenzymedigestionofPMD19-T-CDVHplasmid1-2：分别为12号和15号PMD19-T-CDVH质粒；3：λhindⅢDNAMarker；4：12号质粒双酶切产物；5:15号双酶切产物；6:100bpDNAMarker1-2：12and15plasmid；3：λhindⅢMarker；4：Doubleenzymedigestionofplasmid12；5:Doubleenzymedigestionofplasmid15；6:100bpDNAMarker3.2.2CDVH基因片段测序结果与分析3.2.2.1重组质粒CDVH基因片段测序结果测序结果（GenBankaccessionKM114053）如下：GCATCGGCAGCAAATCCCATCACTTTATCAGCACTCTCCGGGGCCAGAGGTGACATATTCCCGCCGTACAGATGCAGTGGAGCTACTACTTCAGTAGGCAGAGTATTCCCCCTATCCGTATCATTATCCATGTCTTTGATATCAAGAACATCAGAGATAATCAATATGCTAACCGCTATCTCAGACGGAGTGTATGGTAAAACTTATTTGCTAGTGCCTGATTATATTGAAGGGGAGTTCGACTCGCAAAAGATTCGAGTCTTTGAGATAGGGTTTATCAAACGGTGGCTGAATGACATGCCTTTACTCCAGACAACCAACTATATGGTCCTCCCGGAAACTTCCAAAGCCAAGGTATGTACTATAGCAGTGGGTGAGCTGACACTAGCTTCCTTGTGTGTAGATGAGAGCACCGTATTGTTATATCGTGACAGCAACGGTTCACAAGATGGTATCCTAGTAGTGACATTGGGAATATTTGGGGCAACACCTATGGATCAAGTTGAAGAGGTGATACCTATCGCTCACCCATCAGTGGAGAGAATACATATAACAAATCACCGTGGGTTCATAAAAGACTCAATAGTAACCTGGATGGTGCCTGTATTGGTCTCTGAGAAACAAGAGGAGCAAAAAAACTGTCTGGAGTCTGCTTGTCACAGAAAATCCTACCCTATGTGCAACCAAACGTCATGGGAACCCTTTGGAGGAGGGCAGTTGCCTTCTTATGGGCGGTTGACATTACCTCTAGATCCAAGCATTGACCTTCAACTTAACATATCATTTACATATGGTCCGGTTATACTGAACGGAGACGGTATGGATTATTATGAAAGCCCACTTTTGGACTCCGGATGGCTTACCATACCTCCTAAGAACGGGACAGTCCTTGGATTGATAAACAAAG34 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达CAAGTAGAGGAGACCAGTTCACTGTGACCCCCCATGTGTTGACATTTGCGCCCAGGGAATCAAGTGGAAATTGCTATTTACCTGTTCAAACATCCCAGATTATGGATAAAGATGTCCTTACTGAGTCCAATTTAGTGGTGTTACCTACACAGAATTTTAGATATGTCATAGCAACATATGATATATCCCGGGGCGATCATGCAATTGTTTATTATGTTTATGACCCAATCCGGACGATTTCTTATACATACCCATTTAGACTAACTACCAAGGGTAGACCTGATTTCCTAAGGATTGAATGTTTTGTGTGGGATGACGATTTGTGGTGT3.2.2.2H基因同源性分析使用MegAlign，把CDVH基因测序结果与GenBank收录的相关H基因序列进行分析（结果见表3-1）。相关序列登录号及来源为：AB250736Japan，AF378705Onderstepoort，AB212966Vaccinestrain，DQ226O88Italy，AB301066Thailand，GQ2114374Austria，Z47762American，HM563059Portμgal，Z47761Danish，AF112189Switzerland，JN381191Guizou，HM749644Asia-1，DQ191766Taipei，JN896331Chinaasin-1，EU545142Heilongjiang。KM114053为本试验扩增产物CDVH基因测序结果。在核苷酸水平上，本试验扩增的核苷酸序列与其他序列的同源性在89.5%～98.9%之间，与黑龙江分离株的同源性高，与日本分离株和Onderstepoort疫苗株的同源性低。在氨基酸水平上，同源性为88.1%～99.0%，与日本分离株的同源性低。表3-1H基因核苷酸和氨基酸同源性分析Table3-1ThehomologyanalysisofHgenewithrelatedgene注：左下部分为氨基酸同源性，右上部分为核苷酸同源性3.2.2.3进化树分析使用MEGA5对测序结果进行进化树分析，结果见图3-3，主要有两个大分支，本试验克隆的H基因序列属于Asia-1型，与黑龙江分离株的亲源关系较近，与Onderstepoort疫苗株和Vaccine株的亲源关系较远。35 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立36HM749644/Asia-136JN896331/Chinaasia-194DQ191766/TaipeiKM11405310098EU545142/Heilongjiang20JN381191/Guizouz47762/American8345HM563059/Portugal98z47761/DanishAB301066/ThailandAF112189/Switzerland3641GQ214374/AustriaDQ226088/ItalyAF378705/OnderstepoortAB212966/vaccinestrain10055AB250736/Japan0.01■标记的为本试验参考毒株，▲标记的为本试验扩增H基因，●为疫苗参考株图3-3CDVH基因进化树Fig3-3Phylogenetictree3.2.3重组质粒pET32a-CDVH双酶切电泳结果pET32a-CDVH用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，电泳结果如图3-4。可见两条大小接近5900bp和1236bp的条带，酶切片段大小符合预期。图3-4pET32a-CDVH双酶切电泳图Fig3-4DoubleenzymedigestionofpET32a-CDVHplasmid1：质粒pET32a-CDVH双酶切产物；2:质粒32a；3：λhindⅢDNAMarker1：ProductsofpET32a-CDVHplasmiddoubleenzyme；2:32aplasmid；3：λhindⅢDNAMarker3.2.4诱导表达试验3.2.4.1IPTG浓度优化试验结果在菌液OD约为0.6处于对数生长期时，设置IPTG诱导表达浓度为：1.5mmol/L、1.0mmol/L、0.8mmol/L、0.6mmol/L、0.4mmol/L、0.2mmol/L，诱导表36 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达达6小时。SDS-PAGE电泳结果见图3-5，可见一条大小约64kDa的蛋白条带，IPTG终浓度1.0mmol/L时表达量最大。图3-5IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响Fig3-5TheeffectofIPTGconcentrationsonexpressionlevelsofrecombinantproteinM：蛋白Marker；1：32a空载体诱导表达产物；2：空白对照组；3～8IPTG浓度分别为：1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2（mmol/L）M：ProteinMarker；1：Inducedexpression32a；2：blankcontrolgroup；3～8（IPTGmmol/L）：1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.23.2.4.2最佳诱导表达时间试验诱导表达试验组共6个试管，均加入1.0mmol/LIPTG进行诱导，从第2小时开始，没间隔1小时取出一支试管，最后进行SDS-PAGE电泳观察。结果见图3-6，诱导表达6h的表达量最大。确定重组蛋白的最佳诱导表达时间为6h。图3-6诱导时间对重组蛋白表达量的影响Fig3-6TheeffectofinducingtimeonexpressionlevelsofrecombinantproteinM：蛋白Marker；1：质粒32a1.0mmol/LIPTG诱导表达组；2～7：pET32a-CDVH质粒分别诱导表达2h,3h,4h,5h,6h,7hM：ProteinMarker；1：32aplasmidwith1.0mmol/LIPTG；2～7：TheexpressionresultswithIPTGinduced2h,3h,4h,5h,6h,7h37 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立3.2.5重组蛋白表达形式试验结果取超声波裂解的菌液，冷冻离心机12000r/min离心5分钟，取沉淀和上清进行电泳。结果见图3-7，所表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀，上清中重组蛋白的含量少。图3-7重组蛋白表达形式鉴定Fig3-7Identificationofexpressionfromoftheexpressedprotein1：pET32a-CDVH诱导表达组；2：上清；3：沉淀；M：蛋白Marker；4:32a空载体未诱导组；5:质粒32a诱导表达组1：TheproteinofpET32a-CDVH；2：supernatant；3：sediments；M：ProteinMarker；4:32aplasmid；5:32aplasmidwithIPTG1.0mmol/L3.2.6蛋白纯化试验3.2.6.1包涵体洗涤初步纯化结果重组蛋白用包涵体洗涤液多次洗涤后，8M尿素充分溶解，离心分别取上清和沉淀电泳，结果见图3-8，可见经洗涤初步纯化的蛋白纯度较高，杂蛋白的浓度低，且包涵体多数已溶解在尿素中。图3-8包涵体洗涤初步纯化效果观察Fig3-8Preliminarypurificationofinclusionbody1：上清；2：沉淀；M：蛋白Marker1：Supernatant；2：Sediments；M：PrestainedProteinLadderMarker38 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达3.2.6.2Ni柱纯化结果重组蛋白过Ni柱纯化，使用150mM咪唑洗脱，纯化后取30μL洗脱液用于SDS-PAGE电泳，鉴定纯化蛋白的纯度。结果如图3-9，纯化的重组蛋白纯度较高。图3-9重组蛋白过柱纯化Fig3-9Thepurificationoftherecombinantprotein1：pET32a-CDVH诱导表达组；M:蛋白Marker;2:8M溶解粗蛋白；3～4：纯化的蛋白1：TheproteinofpET32a-CDVH；M:ProteinMarker;2:Thepreliminarypurificationofinclusionbodythatsolutionwith8Murea；3～4：Purifiedprotein3.2.7重组H蛋白免疫小鼠抗体效价检测将小鼠血清作2倍稀释，稀释度为1:800～1:102400，蛋白包被浓度为7.5μg/mL，进行间接ELISA测定小鼠血清中抗重组H蛋白抗体的抗体滴度，测定结果见表3-2。所免疫小鼠的血清抗体效价在1:102400以上，抗体滴度高。表3-2重组H蛋白免疫小鼠血清抗体滴定Table3-2Theimmunedmiceserumantibodytitration稀释度P1N1P2N2P3N3P4N4P5N51:8002.4920.2002.3820.1072.3270.2572.3160.1662.2580.1641:16002.4700.1312.4650.0882.3480.1932.3570.1252.2770.1081:32002.5230.1012.4780.0742.3900.1242.4380.0922.3230.0961:64002.4760.0852.4480.0762.3630.1152.3720.2322.3200.1201:128002.4920.0862.4590.0722.3450.0962.3450.0802.4100.0781:256002.5090.0802.4650.0732.3870.0862.3830.0842.3620.0831:512002.4390.0662.3740.0672.1450.0982.1200.0712.3740.0811:1024002.4670.0752.4620.0821.7960.0982.0230.0952.3680.098P:重组H蛋白免疫小鼠试验组；N：生理盐水对照组39 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立3.3讨论3.3.1CDVH基因片段的选择[107]对于H基因的克隆表达，刘刚（2008）克隆了H基因816nt和459nt大小的片段，分别插入到pET-30a构建重组表达载体并在Rosetta中获得了表达，经鉴[108]定所表达的蛋白有较好的反应原性。王好（2008）将克隆的大小为453nt的CDVH基因片段与pGEX-4T-1质粒构建重组表达质粒也在Rosetta菌中获得表达。马丽敏[109]（2012）采取去除H基因N端高度疏水区，设计引物克隆了全长1353nt的基因[107][110]序列，重组质粒pET-28a-Hema在DE3菌株中高效表达。但是，刘刚、莫小见、[96]乌仁高娃等曾尝试表达完整H基因，使用多种表达质粒和多种大肠杆菌表达载体，且优化了多个表达条件却均未获得成功。分析表达失败的可能原因有：H蛋白全基因大小约为1.8k，超过了大肠杆菌表达载体的编码能力；H基因含有大量大肠杆菌的稀有密码子，影响了重组蛋白的翻译表达；N端高度疏水区可能与细胞膜结合，进而影响细菌的正常生物学功能。本研究用PredictProte网站在线分析蛋白质的结构（id=495008），去除N端高度疏水区的489个nt，选取富含二级结构的490～1725nt（HM749644.1位置），保留主要抗原表位，设计引物克隆H基因，用于构建原核表达体系。3.3.2重组表达系统选择外源基因的表达系统主要有原核表达和真核表达系统。1977年，Itakura等成功地在E.coli中表达了一种哺乳动物生长激素抑制素，首次实现外源基因在原核细[111]胞的体外表达。原核表达系统的应用较早，它的应用也很成熟，具有遗传背景清楚、周期短、易操作、易体外培养、使用安全等优点。此外，大肠杆菌表达宿主表达效率高，可大规模培养，广泛应用在蛋白质结构和功能分析、抗体生产和蛋白[112]质相互作用的研究。表达载体包含表达载体和表达宿主菌。pET表达载体系统在大肠杆菌表达载体中最强大，含有外源基因表达的必要控制元件，包括T7启动子、S-D序列、终止密码子等元件。pET32a用于克隆构建高水平表达带有107个Trx标签的载体，含有多个克隆位点（包括EcoRⅠ和SalⅠ）可将带有粘性末端的外源基因序列插入到T7启动子之下，能表达融合蛋白。同时在融合蛋白中含有His标签，有利于融合蛋白的纯化。密码子是影响外源基因在大肠杆菌中表达效率的重要因素，在原核生物中，由于不同tRNA含量的差异产生了对密码子的偏爱性，AGA、CCC、GTC等是大肠杆[113]菌的稀有密码子。蛋白质的翻译中稀有密码的连续出现易发生密码子错配，抑[114]制蛋白的合成。本试验成功构建pET32a-CDVH重组表达质粒后，分别转化表达宿主菌BL21和Rosetta，通过优化表达条件重组质粒在Rosetta宿主菌中获得高效表达，但是在BL21中没有看到重组蛋白的大量表达。分析CDVH基因核苷酸序列发现，该段基因含有67个稀有密码子，其中两个连续的10个，三个连续的1个。Rosetta菌株可增强含有E.coli稀有密码子的重组质粒的蛋白表达水平，适用含稀有密码子的外源基因的表达。因此，本试验使用Rosetta作为表达宿主菌获得成功。40 第三章犬瘟热病毒部分H基因的原核表达3.3.3包涵体及复性包涵体是细菌表达的蛋白在胞浆内凝结而成的强折光性，无活性固体颗粒。包涵体的形成避免了外源蛋白被蛋白酶降解，但需要通过溶解、透析复性等才能恢复其活性。本试验中包涵体经离心富集后，使用含EDTA和TritonX-100等的包涵体洗涤液将可溶性菌体蛋白大量洗涤除去。然后用8M尿素充分溶解包涵体。本试验构建的重组表达系统表达的融合蛋白带有His标签，又因Ni柱在变性与非变性条件下均可纯化带His标签的重组蛋白。因此，使用Ni+柱可进一步纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白最后通过梯度透析的方法恢复蛋白质活性。试验显示纯化复性后的蛋白纯度较高，动物免疫试验证明该蛋白能诱导小鼠产生高水平的抗体滴度。3.4小结1）去除H基因N端高度疏水区的489个核苷酸设计引物，成功克隆了长1236nt的H基因片段。构建了PMD19-T-CDVH重组质粒并测序，证明成功克隆了南昌地区样品毒株的H基因。扩增的H基因与相关基因的核苷酸同源性为89.5%～98.9%。本试验克隆的H基因序列属于Asia-1型，在核苷酸水平上与黑龙江分离株的亲源关系很近，与Onderstepoort疫苗株和Vaccine株亲源关系较远。2）成功构建了原核表达质粒pET32a-CDVH。诱导表达产物浓度高，诱导表达产物以包涵体的形式存在。产物经包涵体洗涤、Ni柱纯化、透析复性获得浓度为0.561mg/mL的蛋白溶液。3）使用复性的重组H蛋白免疫小鼠，ELISA测定小鼠血清抗体。结果表明：免疫小鼠的血清抗体效价在1:102400以上，抗体滴度高。证明表达的重组H蛋白免疫原性良好，具有一定的研究价值和使用价值。41 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立第四章犬瘟热间接ELISA方法的初步建立酶联免疫吸附试验（ELISA）广泛用于动物血清抗体的检测，以监测动物群体的抗体水平。现有的ELISA试剂盒多通过细胞培养获得全病毒，包被酶标板建立方法。但是用这种方法制备试剂盒对各种条件要求高、耗时长、成本高。基因工程技术的普遍应用与成熟，为克隆表达重组蛋白抗原替代全病毒，建立ELISA方法提供了选择。犬瘟热病毒H蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白。本文以试验表达且纯化复性的重组H蛋白免疫小鼠，证明该蛋白诱导小鼠产生了高滴度的抗体，有良好的免疫原性。本章试验以重组H蛋白作为抗原包被酶标板，优化试验条件，建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法。4.1材料与方法4.1.1试验设备与试剂MK3酶标标仪购自Thermo公司；96孔酶标板购自JETBIOFIL；HRP羊抗鼠IgG、HPR兔抗犬IgG购自中衫金桥公司；明胶、柠檬酸购自天津大茂化学试剂厂；H2O2购自西陇化工股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯试剂；CDV阴性血清为剖腹产未哺乳犬血清；阳性血清为CDV感染发病痊愈犬血清。4.1.2相关试剂配制1）PBS（磷酸盐缓冲液）NaCl8.0g，Na2HPO41.44g，KCl0.20g，KH2PO40.24g，用800mLddH2O溶解，定容至1000mL，pH7.4，121℃高压灭菌。2）抗原包被液（0.05MNa2CO3-NaHCO3pH9.6）Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加ddH2O900mL，调节pH9.6，定容至1000mL。3）PBST:每1000mLPBS中加入0.5mLTween-20，混匀。4）封闭液：1%明胶：称取1g明胶加热溶解于100mLPBS中。1%BSA：称取1gBSA溶解于100mLPBS中。5%脱脂奶粉：称取5g脱脂奶粉加热溶解于100mLPBS中。5）0.1M柠檬酸缓冲液19.2g柠檬酸溶解于900mLddH2O中，定容至1000mL，4℃保存。6）0.2M磷酸盐缓冲液取28.4gNa2HPO4·12H2O完全溶解在900mLddH2O，定容至1000mL。7）Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH5.0）0.1M柠檬酸缓冲液24.3mL，0.2M磷酸盐缓冲液25.7mL，ddH2O50mL，调pH至5.0。6）稀释液：BSA1g，PBST1000mL。42 第四章犬瘟热间接ELISA方法的初步建立8）底物工作液（需现配现用）8mg邻苯二胺（OPD）充分溶解于20mLNa2HPO4-柠檬酸缓冲液，同时加入30%双氧水30μL，避光瓶保存。9）终止液（2MH2SO4）8.99mLddH2O水中加入1.11mL浓硫酸4.1.3试验方法4.1.3.1间接ELISA操作步骤1）将纯化复性的蛋白用抗原包被液稀释后包被酶标板。每孔100μL，37℃孵育1小时，4℃包被过夜。2）倒掉包被液，在纱布上拍干，加入150μLPBST洗涤，静置3分钟，拍干，重复3次。每孔加入150μL封闭液，37℃湿盒，封闭2h。3）弃封闭液，拍干，150μLPBST洗涤5次。加稀释液稀释的犬血清100μL，37℃湿盒反应1h。4）弃血清，拍干，150μLPBST洗涤3次。加入酶标二抗100μL，轻微震荡混匀，37℃湿盒反应1小时。5）弃二抗反应液，拍干，150μLPBST洗涤5次，每孔加入100μL底物工作液，37℃湿盒避光反应15min。6）每孔加入50μL终止液，轻微震荡5min后酶标仪测定OD492。4.1.3.2间接ELISA相关试验条件确定4.1.3.2.1抗原包被浓度和犬血清稀释倍数优化按4.1.3.1方法，其中以1%明胶为封闭液，HPR兔抗犬二抗稀释度为1:5000。重组蛋白浓度分别稀释为2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL共5个浓度各包被16孔，犬阴阳性血清做1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120二倍稀释，按照方阵滴定方法进行滴定试验，计算P/N值。4.1.3.2.2HPR兔抗犬IgG稀释倍数优化以4.1.3.2.1确定的包被浓度和血清稀释倍数为条件，1%明胶封闭。酶标二抗分别稀释为1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000。犬阴阳性血清各做3个重复进行ELISA试验，计算P/N值确定最佳二抗稀释倍数。4.1.3.2.3最佳封闭液确定按上述步骤确定的试验条件进行ELISA。分别使用1%明胶、1%BSA、5%脱脂奶粉作为封闭液进行试验，每组均做8个重复，计算P/N值确定最佳封闭液。4.1.3.2.4显色时间的确定底物分别作用10分钟、15分钟、20分钟，终止反应，测定OD492，确定最佳显色时间。4.1.3.3间接ELISA阴、阳性血清临界值确定试验对五份犬阴性血清用本文建立的间接ELISA进行检测，每个血样做8个重复，数据进行统计学分析。计算阴性血清OD492的平均值（X）和标准差（SD）。当43 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立OD492>X+3SD时，可以在99.9%的水平上判定阳性。犬阴阳性血清临界值=X+3SD，判断标准为：血清样品OD492值大于该临界值为阳性，小于等于判定为阴性。4.1.3.4重复性试验用该间接ELISA对6份犬血样进行检测，每个血样均做8个重复，计算检测结果变异系数以试验该方法的稳定性。4.1.3.5特异性试验用本文的ELISA方法检测CDV-McAb、CPV-McAb、五联血清、猫血清、阴性血清、阳性血清，验证该方法的特异性。4.1.3.6犬血样检测使用该间接ELISA方法检测本实验室收集的背景清晰的犬血清样品，评价该抗体检测方法的应用效果。4.2结果4.2.1抗原包被浓度和犬血清稀释倍数优化方阵滴度结果以1%明胶为封闭液，HPR兔抗犬二抗稀释度为1:5000，重组蛋白浓度分别稀释为2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL，犬阴阳性血清做1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120二倍稀释，按方阵滴定方法进行ELISA试验,结果见表4-1。表4-1抗原包被溶度及血清稀释倍数优化试验结果Table4-1Determinationfortheconcentrationofcoatingantigenandserumdilution抗原包被浓度2.5μg/mL5μg/mL7.5μg/mL10μg/mL15μg/mL血清稀释倍数PNPNPNPNPN1：401.7990.0711.8830.0721.9430.0871.9580.0891.9390.0951：801.3600.0561.4300.0661.5170.0631.5510.0741.5710.0741：1600.9500.0471.0060.0511.0660.0561.1120.0671.1190.0641：3200.5700.0520.6720.0580.6950.0600.6800.0690.7680.0741：6400.4040.0460.3780.0530.4340.0550.4690.0600.4920.0721：12800.2520.0470.2940.0600.2980.0590.3360.0630.3300.0691：25600.1610.0420.1760.0540.1970.0570.2080.0610.2130.0711：51200.1190.0510.1340.0580.1400.0630.1520.0660.1540.074注释：P为阳性血清，N为阴性血清以上结果表明，当重组蛋白包被浓度为7.5μg/mL，血清稀释倍数为1:80时，阳性血清OD492为1.517，阴性血清OD492为0.063，P/N为24.097。综合考虑，确定重组蛋白包被浓度为7.5μg/mL，血清稀释倍数为1/80。4.2.2二抗稀释倍数优化试验结果抗原包被浓度7.5μg/mL，血清稀释倍数为1/80，酶标二抗分别稀释为1:2000、44 第四章犬瘟热间接ELISA方法的初步建立1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000。阴阳性血清各做3个重复，进行间接ELISA。结果（OD492）见表4-2。表4-2酶标二抗稀释倍数优化结果Table4-2Determinationoftheworkingconcentrationofthetanti-dogIgGantibody二抗稀释倍数PNP均值N均值P/N值1：20002.3302.3372.3270.1030.1010.1042.3320.10322.641：30002.1472.1402.1850.0880.0850.0852.1570.08625.081：40002.1842.1952.1720.0900.1000.0932.1840.09423.231：50001.6901.7431.7180.0770.0670.0701.7170.07124.181：60001.5071.6561.6750.0690.0770.0771.6130.07421.801：80001.2651.3391.2750.0570.0630.0631.2930.06121.201：100001.4571.5321.5380.0630.0650.0651.5090.06423.581：120001.0011.0471.0290.0600.0570.0571.0260.05817.69结果显示，当酶标二抗稀释度1:5000时，P/N值较大，且阳性血清OD492值小于2.0，利于增加ELISA的敏感性，且本着节省试剂原则，故选择酶标二抗的稀释度为1:5000。4.2.3最佳封闭液确定使用1%明胶、1%BSA、5%脱脂奶粉作为封闭液，37℃封闭2h，每组做8个重复，按上述确定的条件进行ELISA试验，计算P/N值确定最佳封闭液。结果见表4-3，结果显示：1%明胶封闭液的P/N值最大，故选1%明胶为封闭液。表4-3ELISA封闭液确定试验结果Table4-3Determinationofsuitableblockingsolution封闭液5%脱脂奶粉1%明胶1%BSAPNPNPN10.8360.0361.6290.0851.3210.07421.0750.0372.0180.0751.3160.08630.9930.0482.0040.0630.9000.06640.7120.0481.5250.0641.0900.07951.0620.0541.9660.0831.2700.08361.0050.0522.0310.0781.3600.08071.0230.0472.0180.0811.3670.08881.0230.0512.0030.0801.3800.045平均值0.9660.0471.8990.0761.2510.075P/N值20.68524.98716.6845 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立4.2.4显色时间的确定加底物OPD后分别作用10min、15min、20min，然后终止反应，测定OD492。结果（OD492）见表4-4。结果表明显色时间为15min时，阳阴性血清P/N值最大。表4-4底物显色时间试验结果Table4-4DeterminationofChromogenictime显色10min显色15min显色20minPNPNPN10.5960.0480.7840.0630.8560.06720.6310.0500.8420.0560.8680.07030.6310.0580.8610.0560.8670.10540.6660.0560.8760.0650.8800.07950.6400.0640.8590.0590.9630.07860.6050.0620.8250.0570.9090.07370.5940.0570.7970.0580.8690.07280.5960.0530.7920.0630.8410.058P/N0.620/0.0560.830/0.0600.879/0.075平均比值11.07113.83311.7204.2.5间接ELISA阴阳性判定临界值计算使用本研究的ELISA，检测5份CDV阴性血清，并统计结果，犬阴阳性血清临界值=X+3SD。结果（OD492）如表4-5，计算得临界值=0.082+3×0.006=0.100，OD492大于0.100时判定为阳性，小于或等于0.100判为阴性。表4-5阴、阳性血清临界值的确定Table4-5Determinationofthecutoffvalueofpositiveandnegativeantisera血清1血清2血清3血清4血清510.0900.0880.0760.0890.09620.0820.0710.0820.0820.08130.0880.0720.0740.0770.08640.0790.0850.0810.0930.09550.0800.0750.0820.0820.08560.0790.0690.0790.0830.07970.0750.0720.0870.0850.08280.0930.0720.0810.0850.084平均值0.0060.0070.0040.0050.006标准差0.0830.0760.0800.0850.08646 第四章犬瘟热间接ELISA方法的初步建立4.2.6重复性试验重复性试验结果如表4-6。求每个血样的平均值（X）和标准差（S），计算变异系数，变异系数（CV)=标准差(S)/平均值(X)×100%，结果显示变异系数在3.0%～7.3%之间，小于10%，表明本试验建立的间接ELISA重复性良好。表4-6重复性试验结果Table4-6DeterminationoftherepeatabilityoftheindirectELISA血样1血样2血样3血样4血样5血样610.5300.8821.7220.1910.0960.08920.5610.9031.7460.2090.0810.08230.5730.9521.7490.1990.0860.07740.5500.8681.7200.2130.0950.09350.5720.9221.7480.1920.0850.08260.5460.9151.6860.2140.0790.08370.5280.9261.6910.1940.0820.08580.5480.9351.9010.2090.0840.085平均值0.5510.9131.7450.2030.0860.085标准差0.0170.0280.0680.0100.0060.005变异系数3.1%3.0%3.9%4.8%7.3%5.7%4.2.7特异性试验结果用本研究的ELISA方法检测CDV-McAb、CPV-McAb、五联血清、猫血清、阴性血清、阳性血清。试验结果（OD492）见表4-7，结果显示：CPV-McAb、猫血清、阴性血清为阴性，CDV-McAb、五联血清、阳性血清为阳性。表明建立的间接ELISA特异性良好。表4-7特异性试验结果Table4-7DeterminationforthespecificityoftheindirectELISACDV-McAbCPV-McAb五联血清猫血清阴性血清阳性血清OD4920.9840.0901.6600.0750.0641.121判定结果+−+−−+4.2.8样品检测结果使用间接ELISA方法检测本实验室收集的背景清晰的犬血清样品，检测结果见表4-8。疫苗免疫犬的抗体含量较高，CDV感染发病初期犬血清中CDV抗体呈阳性，免疫不全的幼犬的抗体含量低。47 犬瘟热病毒H基因原核表达与及间接ELISA的建立表4-8临床血样检测结果Table4-8Thebloodtestresults编号血样背景资料OD492编号血样背景资料OD49213个月犬0.2888CD发病中1.414210个月免疫犬0.9679CD发病中0.81238个月免疫犬0.62710CD发病中0.5414免疫犬1.12111CD发病中0.7465免疫犬0.72712CD发病后期1.1086免疫犬1.12113CD好转病例0.32977年犬2.26014CD好转病例0.664注：“CD发病中”为首次就诊时采取的血液4.3讨论酶联免疫吸附试验（ELISA）具有特异性强、敏感性高、适宜一般技术人员操作等优点，适用于大批量血液样品的检测，广泛用于动物群体抗体水平监测。尽管犬瘟热疫苗已经应用多年，并且已经让犬瘟热的发病率大大下降，但是幼犬犬瘟热的发病率一直居高不下，并有已注射过疫苗的犬感染犬瘟热的报道。对于幼犬感染犬瘟热并发病，除了没有注射疫苗外，另一个原因是疫苗受母源抗体干扰，即疫苗的注射时机不合适，造成免疫失败。监测犬体内抗CDV抗体的含量对于幼犬的免疫以及评价免疫效果有重要意义。H蛋白决定着宿主特异性，H蛋白可识别、吸附于宿主细胞表面的CD150/SLAM或CD46受体，是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一。有多位研究学者以犬瘟热病毒重组N蛋白、F蛋白、单克隆抗体、细胞培养犬瘟热病毒为基础，建立了ELISA抗体检测方法。但是以H蛋白为抗原建立间接ELISA抗体检测方法的报道较少。本试验构建了CDVH蛋白高效原核表达质粒。通过Rosetta表达宿主菌,成功表达了重组H蛋白，使用Ni柱，获得了纯度较高的重组蛋白。通过试验，建立了高敏感性和特异性的间接ELISA抗体检测方法。试验表明该方法重复性良好，初步应用于检测14个背景清楚的犬血样，检测结果符合预期结果，说明该方法有一定的应用前景，适用于犬血清样品的CDV抗体检测。但后期还需要通过检测大量血清样品并与其它ELISA检测方法进行比较,以进一步验证本试验方法的特异性、稳定性和敏感性。48 全文总结全文总结1.成功建立了犬瘟热RT-PCR快速诊断法。试验证明：该法敏感性高，可检测cDNA模板最低浓度2.475ng/µL；特异性强，检测CPV阳性病料、英特威狂犬疫苗、伪狂犬阳性病料均未见特异条带，仅有CDV阳性病料扩增出特异性464bp基因片段；对30例疑似CDV感染病例的检测结果显示，本文建立的RT-PCR检测方法的阳性检出率为90%，而胶体金试纸法阳性检出率为86.7%，说明本文建立的RT-PCR方法检出率较高。胶体金检测为可疑的病例通过RT-PCR检测，可以扩增出特异性目的条带，因此RT-PCR对于CDV的早期诊断有较大优势。对扩增的基因片段的测序结果的核苷酸同源性分析显示，同源性为94.8%～98.5%，证实本法可靠。2.成功克隆了南昌地区CDV样品1236nt的H基因片段。经测序分析显示，本文扩增的H基因与相关基因的核苷酸同源性为89.5%～98.9%。氨基酸同源性为88.1%～99.0%，没有基因缺失和插入；进化树分析表明该H基因片段属于Asia-1型，与黑龙江分离株的亲源关系很近，但与Onderstepoort疫苗株和Vaccine株的亲源关系较远。3.成功构建了原核表达质粒pET32a-CDVH，且在Rosetta宿主菌中获得高效表达。表达的H蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经洗涤、Ni柱纯化、透析复性获得浓度为0.561mg/mL的蛋白溶液。小鼠免疫试验，间接ELISA测定小鼠血清中抗重组H蛋白的抗体效价，血清抗体效价在1:102400以上，抗体效价高，说明重组H蛋白具有良好的免疫原性。4.建立了CDV重组H蛋白间接ELISA抗体检测方法。ELISA试验条件为：重组蛋白包被浓度为7.5ug/mL、1%明胶封闭、血清稀释倍数为1：80、酶标二抗稀释倍数为1：5000、阴阳性血清判定的OD值为0.100。该间接ELISA检测方法的重复性良好，特异性强。对背景清楚的犬血清样品的检测结果表明，疫苗免疫犬的抗体含量较高，CDV感染发病初期犬血清中CDV抗体呈阳性，免疫不全的幼犬的抗体含量低。说明本文建立的重组H蛋白间接ELISA检测结果符合预期，具有较好的应用前景。49 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致谢致谢本试验研究及论文是在导师邬向东副教授的悉心指导下完成的。在这三年里，无论是在学习上还是生活上，邬老师都给予了大量指导和无私的帮助。老师渊博的学识、严谨的治学、乐观的心态、强烈的责任心和宽大的胸怀深深地感染着我。感谢邬老师的教育和激励。感谢预防兽医教研组的全体老师，感谢老师们在学习和试验中的指导和帮助。同时，在这里非常感谢江西农大兽医院陈如圣院长、邓琍、杨文忠、邹一云等在我学习和生活中的帮助。感谢预防兽医学所有师兄师姐在我试验过程中的指导和建议，特别要感谢同门师姐刘婉婧及师兄陶明江、郑教雀；感谢2012级研究生黄滔、田光玲、李德峰、张田生、曾文斌、刘悦欣、聂小伟、谢笑芳、张黎、樊云燕、孙明等的一路陪伴；感谢师弟余恩超、熊家明、陈茂金和师妹潘美慧等在我试验中的帮助；感谢预防兽医的所有师弟师妹们。这里还要感谢同窗好友朱书梁和魏伟的陪伴和支持。特别感谢家人多年来无私的支持和鼓励，你们的支持和理解是我坚持和前进的最大动力！同时感谢所有关心支持我的亲友们，谢谢你们！57 作者简介作者简介张祥华，男，1988年10月出生，江西赣州人。2007年考入宜春学院生命科学与资源环境学院动物医学专业，2011年获农学学士学位。2012年考入江西农业大学动物科学技术学院预防兽医学专业，研究方向：兽医免疫学基础理论与应用。论文发表情况：《一例犬驱虫出现不良反应的病例分析》养犬，第一作者；《2012年至2014年南昌部分地区犬瘟热流行病学调查》养犬，第一作者；《犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用》生物灾害科学，第二作者。58
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