呼肠孤病毒3型S1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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1、呼肠孤病毒3型S1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立中文摘要呼肠孤病毒3型(reovimstype3，Reo．3)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、正呼肠孤病毒属(0rthoreovims)、双链RNA病毒【¨。呼肠孤病毒3型是实验动物SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠的必须检测项目【21。其自然感染宿主比较广泛【3】，如人类、小鼠、大鼠、猴、牛等，可隐性感染动物并在体内产生抗体，给血液制品、单克隆抗体、细胞培养等外来致病因子的检定及动物试验带来一定的困难【4】。因此建立快速诊断方法十分必要。目前，检测呼肠孤病毒3型主要用酶联免疫吸附法(ELIS

2、A)检测，其抗原获得方法主要为细胞培养，但很难获得高滴度的病毒；病毒虽可在鸡胚内增殖，但没有规律性【51。本研究利用大肠杆菌表达系统pQE31表达呼肠孤病毒6l蛋白抗原部分，用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立ELISA方法，可用于呼肠孤病毒血清抗体的检测。用生物学软件DNAstar分析61蛋白，根据GenBank中报道的Reo．3S1基因序列(gi：61780)设计特异性引物，用一步法RT-PCR方法扩增S1基因的主要抗原片段SR，将其插入到pMDl8．T载体中，酶切鉴定后测序。将阳性重组质粒用勋乃I十勋，I双酶切后连接到同样双酶切的表达载体pQE．31上，转化

3、EcD，fM15(pREP．4)，IPTG诱导表达。对表达蛋白进行SDS．PAGE电泳和Westem-blot的结果表明，SR基因在EcD，fM15中获得表达，表达蛋白SR．61分子质量约为32kD，与预期大小相符，能与Reo．3阳性血清发生特异性反应，说明SR．6l有很高的抗原性。把表达的SR．61重组蛋白经初步纯化后用作包被抗原，建立了检测Reo．3血清抗体的间接ELISA方法，并确定了最适抗原包被浓度(0．6“g／mL)、最适血清稀释度(1：100)、血清最适作用时间(150min)、最适封闭液(8％脱脂奶粉)、最适封闭时间(45min)、酶标抗体最适稀

4、释度(1：8000)、酶标二抗最适作用时间(60min)、底物最适显色时间(10min)和判定界值(0．292)。包被的重组抗原不与EcT(鼠痘病毒)、SeV(仙台病毒)、MHV(小鼠肝炎病毒)、PVM(小鼠肺炎病毒)阳性血清发生交叉反应，表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10％，说明该方法具有很好的重复性。该诊断方法与国家实验动物检测中心建立的ELISA检测试剂盒比较，特异性、敏感性和符合率分别为98．5％、100％和98．7％。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景。本研究成

5、功克隆了Reo一3S1基因，进行了表达。利用表达的SR一6l蛋白成功建立了快速简便的ELISA诊断方法，为实验动物的质量控制、开发商品化试剂盒提供了技术支持。关键词：呼肠孤病毒3型；S1基因；原核表达：间接ELISAExpressionofS1GeneofreoVirustype3andEstablishmentofindirectELISAforDetectionofAntibodiesAgainstReo-3AbstractReoVimstype3(Reo一3)，aorthoreovimsoftheReoviridae，hasalineardouble。s

6、trandedRNAgenome．Reo一3isthemustdetectionprojectfortheSPFlevellaboratoryanimal，suchasrat，mouse，Caviaprocellusandhamster．Itsnatureinfectionhostisquitewidespread，suchashuman，rat，mouse，mom【ey，cattleandsoon，andcansilentinfectanimalandproducetheantibodyinViVo．Itbringsdimcultyfora11imaltes

7、tandtheextemalpathogenicfactorexaminationsuchasbloodproduct，monoclonalantibody，cellcultureetc．Thus，itisnecessarytoestablishaquickandaccuratediagnosticmethod．Ser0109icalmethods，suchastheenzyme—linkedimmunosorbentassay(ELISA)，arecommonlyusedtodetemlinewhetherlaboratoryanimalsareinfect

8、edwithReo．3．Theanti