新型番鸭呼肠孤病毒σc蛋白抗体间接elisa检测方法的建立及应用

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PBSPCRPEGrpmIU’-PCRSDS啊Spg此Phosphate—bufferedsalinepolymerasechainreactionpolyethyleneglycorevolutionsperminutereversetranscription-polymerasechainreactionSodiumdodecylsulfatelris(droxymethyl)-aminomethane，microgrammicroliter磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚乙二醇转|余反转录聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠三羟甲基氨基甲烷微克微升 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯II1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1呼肠孤病毒概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2禽呼肠孤病毒血清型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．3新型番鸭呼肠孤病毒(N．MDRV)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．4N．MDRV病毒特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．5N．MDRV病毒培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。51．6N．MDRV表达的主要蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．7N．MDRV与MDRV感染引起的病理变化比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．8禽呼肠孤病毒病检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．8．1血清学检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．8．2分子生物学检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．9番鸭呼肠孤病毒疫苗研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．9．1灭活苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．9．2活疫苗(弱毒苗)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．9．3基因工程苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．10MDRVoC基因研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一141．1l本研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．1．1菌株与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．1．2实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．1引物设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2．2N．MDRV培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．3病毒模板的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2．4RT-PCR扩增N．MDRVoC基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17 2．2．5重组克隆载体的构建与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·172．2．5．1N．MDRVaC基因的回收与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2．5．2N．MDRVaC基因的克隆与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．5．3重组质粒的序列测定与序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一192．2．5．4原核表达载体pET28a-aC的构建与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·192．2．6重组oC蛋白的表达与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”202．2．6．1重组6C蛋白的初步表达鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．6．2IPTG最佳诱导浓度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．6．3IPTG最佳诱导时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．2．6．4重组oC蛋白细胞定位分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．3重组aC蛋白免疫印记分析(WesternBlot)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．3．1SDS—PAGE电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·232．3．2WesternBlotj立程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··232．4重组aC蛋白间接免疫荧光分析(IFA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一232．5间接ELISA检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“242．5．1间接ELISA反应条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．5．1．1封闭液的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一252．5．1．2抗原包被浓度与血清稀释度的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一252．5．1．3一抗血清最佳作用时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一252．5．1．4酶标二抗最佳作用时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”252．5．2间接ELISA检测方法阴阳性临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．5．3间接ELISA检测方法重复性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．5．4间接ELISA检测方法敏感性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．5．5间接ELISA检测方法特异性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．5．6临床样品的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·263实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1RT-PCR结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．2重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2．1重组质粒pMD．18T-aC的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·273．2．2重组质粒pET-28a．aC的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27 3．3重组aC蛋白在大肠杆菌中的表达分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．283．3．1重组pET-28a-oC质粒转化进E．coliBL21(DE3)后的鉴定分析·．．．．．．．．．ODtO．283．3．2重组aC蛋白的初步表达鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“283．3．3重组aC蛋白诱导表达条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”293．3．3．1重组aC蛋白诱导表达IPTG最佳浓度的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．3．3．2重组aC蛋白诱导最佳时间的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3．3．3重组aC表达蛋白细胞定位分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3．3．4重组aC表达蛋白亲和层析纯化与切胶纯化比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．4重组aC表达蛋白免疫印记分析(WesternBlot)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．5重组aC表达蛋白间接免疫荧光分析(IFA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．6间接ELISA反应条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．323．6．1封闭液的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．6．2蛋白最适包被浓度与血清稀释度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．6．3酶标二抗最佳工作浓度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．6．4血清与二抗最佳反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．6．5间接ELISA检测方法阴阳性临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．7间接ELISA检测方法重复性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．7．1批内重复性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．7．2批间重复性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．8间接ELISA检测方法敏感性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．9间接ELISA检测方法特异性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．10临床样品的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．374讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯374．1目的基因的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯374．2N．MDRVaC蛋白基因的融合表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384．3N．MDRVaC蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384．4N．MDRVaC蛋白抗原特性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯394．5间接ELISA检测方法分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．405结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯406参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41 7致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·468作者简介及硕士期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯479附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘48 山东农业大学硕士学位论文中文摘要禽呼肠孤病毒aC蛋白是病毒外壳蛋白的主要成分，位于病毒表面，是病毒型特异性抗原，能够刺激机体产生保护性中和抗体，与病毒及病毒的吸附、增殖和合胞体的形成有关，能够产生CPE，引起细胞凋亡。因此，aC蛋白是建立抗体检测方法的重要目标蛋白。新型番鸭呼肠孤病毒从2001年开始出现，主要分布在在浙江、江苏、福建、广东和广西等地，鸭鹅主要发生以肝、脾出现大量出血性坏死灶为特征，又被称为“出血性坏死性肝炎”，发病日龄以5～10龄为主，死亡率在20／'o,-．15％，各品种鸭(如番鸭、麻鸭、北京鸭等)和鹅均可感染。新型番鸭呼肠孤病毒与经典番鸭呼肠孤病毒同属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，禽呼肠孤病毒群。本研究利用新型番鸭呼肠孤病毒基因组模板，采用RT-PCR技术扩增aC基因，将扩增产物克隆到pET-28a(+)载体中，得到pET-28a-oC重组载体，通过Ecoli原核表达系统对其进行表达，得到大小为36kDa的aC蛋白，并且通过蛋白免疫印迹分析与间接免疫荧光对oC蛋白的抗原特性进行初步分析，实验结果表明新型番鸭呼肠孤病毒aC蛋白具有良好的反应原性。将纯化后的新型番鸭呼肠孤病毒aC重组蛋白作为包被抗原，通过优化筛选，确定了最适抗原包被浓度、最适封闭条件、最适血清稀释度、血清最适作用时间、酶标二抗最适稀释度和最适作用时间及底物最适显色时间，建立了检测新型番鸭呼肠孤病毒的间接ELISA检测方法。包被抗原与坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽流感H5N1和H9N2、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒阳性血清不产生交叉反应，表明建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性。对浙江、江苏等地康复群或者免疫群的870份血清样品进行检测，阳性样品检出率达到98．5％，表明该方法具有良好的敏感性。批内重复试验与批问重复试验的变异系数均小于10％，说明该方法具有良好的重复性。关键词：新型番鸭呼肠孤病毒：aC基因；原核表达；间接ELISA 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及初步应用TheestablishmentandpreliminaryapplicationofindirectELISA一·一lo●l●●J1·odetectionmethodoInewmuscoVVdUCKreovlruso乙proteinantibodyAbs仃actTheoCproteinofARVisthemaincomponentoftheviralcoatprotein,andit’Saspecificantigen．TheoCproteinCanstimulatethebodytoproduceprotectiveneutralizingantibodies．andithastherelationship埘t11thevirus-specificneutralizingsurfaceantigenandadsorption，proliferation，syncytialformationofthevirus．TheoCproteinisalsotheprotectiveantigen，anditisanimportanttargetproteintoestablishantibodydetectionmethod．Furthermore，theoCproteinisthemainsiteofARVbindingcellreceptor．ItCanproduceCPEandinducecellapoptosis．TheNewMuscovyDuckReovirusbegentoappearfrom2001．ThisvirusismainlyinZheiianz．Jianlzsu．Fuiian，Guan：dong，Guan。andother)laces．ThecharacteristicofthiZhejiangJiangsuFjantiuangdongtiuangxlandotherplacescnaractenstlcOttins，·diseaseislargenumberofhemorrhagicnecrosisinliverandsleep，SOitisalsocalled‘'theHemorrhagicNeerotizingHepatitis"．Theonsetdaysofageis5to10age：based，andthemortalitiesareupto2％,--15％．Allvarietiesofducks(suchasMuscovyduck，Shelduck，Beijingduck，etc．)andgeesemaybethedisease．Thisvirusalsobelongstoreoviridae，orthoreovirus，avianreovirusliketheMuscovyDuckReovirus．Inthisstudy,weusedtheoCgeneofN-MDRVasthetemplate，amplificationthisgenebyRT-PCRtechnology,andtheoCgeneWasclonedtothepET-28avectortoobtaintherecombinantvectorpET-28a-oC．WeusedtheprokaryoticexpressionsystemtoexpresstheoCgeneandobtainedmolecularweightoftheoCproteinWaS36kDa．TheproteinoChadhighreactionactivitythroughWesternBlotandIFAassay．ProteinpurifiedwascoatedwithcoatingsolutionandwedevelopedanindirectELISAdetectionmethodfordetectingN—MDRV．Wedeterminedtheoptimumblockingsolution，theoptimumconcentrationofantigen-coated，tlleoptimaldilutionofserum，meoptimaldurationofactionofserum，theoptimaldilutionandoptimumtimeofHRPsecondaryantibodyandtheTT 山东农业大学硕士学位论文optimumtimeofchromogcnicsubstrate．T11ecoatedantigendidn’thavecross-react、析tllDucktembusuvirus，Muscovyduckreovirus，H5N1andH9N2viruses，andthisindicatedthattheestablishmentofindirectELISAdetectionmethodhadgoodspecificity．Byusingthismethod，wetested870submissionserumsamplesofrecoveryorimmunedduckswhichGamefromZhejiangandJiangsu．Thedetectionratewas98．5％anditshowedthismethodhadgoodsensitivity．nlecoefficientsofvariationofintraandinter-assayrepeatthetestWaslessthan10％anditshowedthismethodhadgoodrepeatability．KeyWords：NewMuscovyDuckReovirus；oCgene；prokaryoticexpression；indirectEI，ISAIII 山东农业大学硕士学位论文l引言1．1呼肠孤病毒概述呼肠孤病毒(reovirus)是呼吸道肠道孤儿病毒(respiratoryentericorphanvirus)的简称，按照病毒来源的不同可分为哺乳动物来源和禽类来源两个主要的群，禽呼肠孤病毒又属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属。经过研究发现，哺乳动物与禽类来源的病毒存在共同的补体结合抗原与沉淀抗原，在血清学上这两者相互无关，而且在宿主范围、自然致病性(Rosenbergereta1．，1989)、血凝特性(Glasseta1．，1973)以及诱导细胞融合的能力(Bodeloneta1．，2001)等方面都有所不同。禽类的呼肠孤病毒病最早发生在美国、英国和加拿大。早在上世纪40年代，Pullis等人通过研究发现，某些禽类(例如鸡)的不明原因的关节炎可能是由病毒引起的；1954年，Fahey和Crawley等首次从患病的雏鸡体内分离得到Avianreovirus(ARV)，患病雏鸡表现为慢性呼吸道疾病，肝脏坏死及腿滑膜发生炎症；1957年，西弗吉尼亚大学的Dr．NormanOlson等发现一种对氯霉素、呋喃唑酮不敏感并能导致滑膜炎的病原体；1959年Olson发现这种特别的病原体对链霉素也不敏感。1972年，Walke等通过电镜观察这种病毒后将其命名为呼肠孤病毒。迄今为止，具有记录的ARV-Md感染的地区包括了南非，法国，以色列，意大利和中I雪(Malkinsoneta1．，1981；Heffels．Redmanneta1．，1992；Hueta1．，2004)。国内王锡坤于1985年首次证实我国存在呼肠孤病毒感染引起的疾病。1997年以来出现的番鸭传染病，也是番鸭的一种主要传染病，最早在福建莆田、福清等地发生，后来相继在广东佛山、浙江金华和我国各番鸭饲养区发生。雏番鸭10日龄即可感染该疾病，可能在脾脏中一直持续到6周龄，以在肝脏和脾脏中形成的小的白色坏死结节为特点(Malkinsoneta1．，1981；Heffels．Redmanneta1．，1992)。根据这种疾病所造成的器官损伤损伤，该疾病还被命名为“番鸭白点病”或者“番鸭花肝病”(Malkinsoneta1．，1981；Hueta1．，2004)。禽呼肠孤病毒不仅可以感染鸭，鹅也是其易感家禽，而且鹅呼肠孤病毒已经被普遍当作2-10周龄幼鹅的疾病病原体的代表。Palya等(2003)证明发生在匈牙利的鹅的疾病类似于先前报道的ARV-Md感染。这种病原体被称为鹅呼肠孤病毒(Goosereovirus，GRV)，并且现在被分类为由鹅分离得到的ARV分离株(ARV-Go)(Palyaeta1．，2003；B缸yaieta1．，2005；Chapl)eleta1．，2005)。在中国，鹅呼肠孤病毒感染首次被确认是l 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用在2001年(Wangeta1．，2002)。不像ARV-Go感染，这种与鹅源呼肠孤病毒(GRV)相关的疾病可以引起少于3周龄的幼鹅高达60％的死亡率。此外，发生在中国鹅的疾病损伤类似于近些年新出现的新型呼肠孤病毒感染。这些结果表明，中国的GRV分离株不同于前面所提到的匈牙利的ARV-Go，但是却与最近几年出现在中国的新型呼肠孤病毒相似。呼肠孤病毒的传播方式可分为两种，分别是水平传播和垂直传播。水平传播是带毒家禽之间直接或者间接引起的；垂直传播主要是通过卵的传播。在生殖器中已经证明该病毒的存在，但是经过卵传播的几率比较低(李巨银等，2011)。1．2禽呼肠孤病毒血清型禽呼肠孤病毒因为感染家禽的不同，从不同家禽分离得到的病毒株会有所不同，但是这些不同的毒株之间存在有共同的群特异性抗原，这种群特异性抗原可以通过荧光抗体实验(FA)、琼扩实验(AGP)和补体结合试验(FC)来进行检测。国内外对禽类呼肠孤病毒的研究比较多，而且对鸡源呼肠孤病毒分离株抗原的研究是最多的。Wood等在上世纪80年代初对来自日本、美国和法国的鸡呼肠孤病毒分离株抗原相关性进行了分析，通过对结果的分析发现鸡呼肠孤病毒存在有11个血清型，而且这些血清型之间存在大量的交叉反应；随后Robertson与Wilecx对澳大利亚分离的到的不同病毒株进行中和实验分析，发现这些病毒株之间存在很大程度的交叉反应，因此其认为有些群只能够作为病毒亚型，而不能够作为血清型。国内，吴宝成等在琼扩实验研究中发现，由番鸭分离得到的病毒株与鸡源分离株存在交叉反应，说明两者之间存在一定的抗原相关性；吴异健等采用血清交叉中和试验分析了CL(鸡源禽呼肠孤病毒)、YH和YB(鸭源禽呼肠孤病毒)以及S1133(禽呼肠孤病毒标准株)之间抗原的相互关系，结果表明4株禽呼肠孤病毒株之间存在有共同的群特异性抗原，但是这4株病毒株之间的中和抗原位点不对称。1．3新型番鸭呼肠孤病毒(N．MDRV)自2001年以来，在福建、浙江、广东和江苏等地鸭鹅中出现一种“出血性坏死性肝炎，，的疾病，该疾病的主要特征是肝、脾出现大量出血性坏死灶，发病日龄以5-10龄为主，死亡率在2‰15％，各品种鸭(如番鸭、麻鸭、北京鸭等)和鹅均可发生，经分离鉴定，该疾病的病原体被确定为一种新型的鸭呼肠孤病毒(NewMuscovyDuck2 山东农业大学硕士学位论文Reovirus，N—MDRV)。根据最新破译的N．MDRV全基因组序列，N．MDRV与经典鸭呼肠孤病毒(MDRV)主要区别在于编码oC蛋白的基因不同(见图1，WangDetal，2013)。N．MDRVaC蛋白由S1基因编码，该基因为三顺反子，3个读码框(openingreadingframe，ORF)相互重叠，依次编码p10、p18和aC；而经典MDRVaC蛋白由S4基因编码，该基因为双顺反子，依次编码p10和oC。ARVS1物RVS4N一狗RVSlGRvS1图1ARV、MDRV、N．MDRV和GRV基因组FigurelGenomeofARV，MDRV，N·MDRVandGRV1558由两种病毒oC基因序列同源性比较可知，oC蛋白序列在结构蛋白中同源性差异最大(核苷酸序列同源性最高为52％；氨基酸序列同源性最高为41％)(见表1)。1．4N-MDRV病毒特征电镜观察，病毒在细胞浆中增殖，呈大量散在、成堆和晶格状排列，病毒粒子星球形，具有特征的二十面体结构，无囊膜，双层衣壳，直径60-80nm(见图2，YunTetal，2013)；氯化铯浮密度为1．36．1．379／ml；病毒无血凝性，不能凝集鸡和鸽红细胞；对氯仿、胰蛋白酶、FUDR不敏感，但对pH3、紫外线、甲醛敏感；病毒对热具有一定的抵抗力，在60。C可存活8～10h，在56。C可存活22～24h，在37。C可存活15～16周，在220C3 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用表l四种呼肠孤病毒各蛋白核苷酸与氨基酸序列同源性比较TablelNucleotideandaminoacidsequencehomologycomparisonofeachproteinofthefourreovirus呼肠孤病毒oA013删MDRVN．MDRVGRVS1133815．12儿803GP10P18，NSPoNSnt髓nt缸nt施nt姐nt船nt舱77．190．459．868．938．329．448．338．031．614．178．089．487．598．i61．168．752．941．635．97．9NE84．697．099．610097．797．597．497．298．010097．396．993．897．088．897．694．794．697．497．598．310096．795．794．397．8可存活48～5l周，在4"Cn-I"存活3年以上，在．20℃可存活4年以上，在．80℃可存活10年以上；700A乙醇、O．5％有机碘和5％过氧化氢溶液可灭活病毒(陈华美，2006)。图2N．MDRV病毒粒子电镜照片Figure2ElectronmicrographofN—MDRVparticles43一H：图3ARV、MDRV、N．MDRV电泳图片Figure3NucleicAcidEiectrophoresisPicturesofARVMDRVandN．MDRV 山东农业大学硕士学位论文1．5N—MDRV病毒培养N．MDRV能够在DF．1细胞生长，病毒的效价可以通过DF一1细胞的噬斑进行测定(Igarahieta1．，1981；Okunoeta1．，1984)。将病毒接种于培养在六孔板的单层DF-1细胞，接种后24h开始出现细胞病变，表现为单层细胞凝聚成团，产生大量的合胞体：72h后病变已经非常明显，可见大量细胞脱落，漂浮在上清中，细胞变形(见图4，YunTeta1．，2013)。图4N．MDRV感染DF．1细胞(左)与正常DF．1细胞(右)比较Figure4ComparisonofinfectedbyN·MDRV(Ieft)andnormal(right)DF-1cells分离毒通过绒毛尿囊膜接种于6个10日龄的SPF鸡胚，每只鸡胚接种0．2m1分离毒，每天检测胚体的发育能力，7天左右可见胚体死亡，死亡率为100％，鸡胚可见有严重的皮下出血和肝脏坏死。1．6N—MDRV表达的主要蛋白N．MDRV包含10股双链RNA基因组片段，按照SDS．PAGE中迁移率的不同，可将基因组分为三个等级：L(大)，M(中)和S(小)。L，M和S基因组片段分别表达3个九(LA，XB，九C)，3个p(衅，gB，州S)和4个G(gC，aA，cB，aNS)主要翻译产物(见表1)。N．MDRV病毒在SDS．PAGE中具有禽呼肠孤病毒10个RNA片段的特征(L1．3、M1．3和S1．4)，但M1．3和S1—4片段的迁移率明显不同于经典呼肠孤病毒，而且最近研究表明早期和最近的水禽呼肠孤病毒分离株中，S系列基因片段的排列也不同(见图3，YunTetal，2013)。N．MDRV的S1基因为三顺反子，主要表达aC、P10和P18三个蛋白。鸡源的ARV，ARV-Md和ARV-Go缺失编码P17蛋白的基因组，它们的多顺反子基因组片段是S4片段，包含了两个编码P10和oC的重叠的开放阅读框(Kuntz—Simoneta1．，2002；B缸yaieta1．，2005)。最近几年出现在中国的呼肠孤病毒，包括N．MDRV(ZJ00M和J18病毒分离株)，DRV(091病毒分离株)和GRV(03G病毒分S 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用离株)，均是拥有三顺反子的编码P10、13C和功能上未知的P18蛋白的S1基因片段，这不同于舭Md和ARV-Go仅是拥有表达P10和13C两种蛋白的S4基因片段(Maeta1．，2012；Wangeta1．，2012；Yuneta1．，2012)。在MDRV中，oA，13B，13NS和oC蛋白分别由S1，S2，S3和S4基因组片段编码(Kuntz．Simoneta1．，2002)。但是，中国的N．MDRV、DRV和GPV分离株，相应的。系列蛋白是分别由S2，S3，S4和S1基因组片段编码(Maeta1．，2012；Wangeta1．，2012；Yuneta1．，2012)。表2N．MDRV各基因组表达蛋白Table2Theexpressedproteinaofeaeh8eneofN．MDRVN．MDRV的基因组共表达12种蛋白，其中非结构蛋白总共有4种，分别是．NS、P10、P18和13NS，其余的都是结构蛋白，在病毒的感染、传播、复制、增殖等过程中具有重要的作用。LA蛋白尬蛋白由N．MDRV的L1基因编码，L1基因全长3959bp，ORF位于Ll基因组的22—3902位氨基酸，由1293个氨基酸组成，分子量大小为142．2kDa，PI为6．307。LA蛋白能够形成内层核衣壳，主要作用是对病毒基因组和RNA聚合酶进行包裹，这与病毒进一步感染细胞有关。 山东农业大学硕士学位论文LB蛋白旭蛋白由N．MDRV的L2基因编码，L2基因全长3830bp，ORF位于L2基因组的15。3793位氨基酸，由1259个氨基酸组成，分子量大小为139．9kDa，PI为8．042。旭蛋白比较小，并且其具体作用并不是很清楚。Benavente(2007)在其文章中表述了L2的序列，这证明了九B蛋白的作用在很大程度上可能是一种RNA活性影响因子，而且通过跟其它呼肠孤病毒RNA比较发现，旭蛋白的大小、粒子的复制数目与其存在一定的相似。九C蛋白九C蛋白由N．MDRV的L3基因编码，L3基因全长3907bp，ORF位于L3基因组的13．3870位氨基酸，由1285个氨基酸组成，分子量大小为142．0kDa，PI为5．059。Joseph等(2002)研究中发现，地蛋白具有鸟苷酸转移酶的活性，而这种酶的活性与合成mRNA5’端帽子结构有关。衅蛋白衅蛋白是由N—MDRV的M1基因编码，M1基因全长2284bp，ORF位于M1基因组的13．221l位氨基酸，由732个氨基酸组成，分子量大小为82．1kDa，PI为8．297。衅蛋白是病毒内层衣壳中比较小的组分(Martinez—Costaseta1．，1997)。对于衅蛋白的具体功能尚且没有报道。pB蛋白“B蛋白是由N—MDRV的M2基因编码，M2基因全长2158bp，ORF位于M2基因组的30．2060位氨基酸，由975个氨基酸组成，分子量大小为73．1kDa，PI为5．106。Shapouri等(1996)研究发现，归蛋白可被蛋白酶水解成两部分，一部分是一个大的C一端片断归C，另一部分是一个小的N-端片断“BN，归蛋白与其分解产物分别形成病毒的颗粒结构。Ruben等(1996)研究了归蛋白及其分解产物的具体作用途径。他用巨噬细胞作为宿主，发现归，归N和归C蛋白都会被十四酰化(myristoylation)，而这三个蛋白经过十四酰化后在病毒的复制过程中起着重要的作用。归蛋白参与了病毒的侵入过程，具有转录酶的活性，因而可以提高ARV对巨噬细胞的攻击能力。rtNS蛋白州S蛋白由N．MDRV的M3基因编码，M3基因全长1996bp，ORF位于M3基因组的25．1932位氨基酸，由635个氨基酸组成，分子量大小为70．7kDa，PI为6．303。uNS蛋白是一种非结构蛋白。Femando等(2004)对州S蛋白进行了克隆和表达。Femando 新型番鸭呼肠孤病毒nC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用在克隆表达M3基因时发现，M3基因不仅只表达州S蛋白，而且还表达一种比州S蛋白要小的州SC蛋白。Femando还发现这两种蛋白的功能在病毒的感染期不一样。在病毒中州S的存在形式是同源多聚体，但在感染细胞时发生改变，成为与oNS能够结合起来共同发生作用的单体。州S和oNS这两个非结构蛋白在病毒的复制或装配期间会形成一个框架，这个框架能引导mRNA和未装配的病毒颗粒到病毒合成场所。P10、P18和oC蛋白云涛等(2013)验证了ZJOOM株的S1基因序列，S1基因是S组基因最大的一个基因，有三个开放的阅读框，包含1568bp，共编码P10、P18和oC蛋白三种蛋白，其中P10、P18为非结构蛋白，oC蛋白为结构蛋白，在病毒的分类鉴定中具有重要的作用。(1)P10和P18蛋白P10和P18蛋白属于非结构蛋白，存在于细胞膜。P10蛋白很小，分子量为10．2kDa，ORF位于273．761位氨基酸，P10蛋白包含97氨基酸，等电点(PI)为6．554。P10蛋白按照肽链上功能来区分，可以分为三个区域：跨膜结构区域、近端保守二半胱氨酸序列区域和内膜基本区域(Gustavoeta1．，2001)。Maya等(2003)的研究，P10蛋白的二半胱氨酸序列不经过十六酰化会失去膜结合功能，通过突变和功能分析证实了P10蛋白是膜融合蛋白，在P10蛋白的三个区域分别进行突变并没有使其失去对膜融合的能力，这说明这三个区域与膜融合的程度非常高。Maya还发现P10蛋白是目前第一个没有形成结构紧密并且稳定的多聚体膜融合蛋白，其结构非常之简单，因而可以称为“跨膜融合小蛋白”(fusion．associatedsmalltransmembrane，FAST)。P18蛋白由S1基因的第二个ORF编码，ORF位于571—1536位氨基酸，分子量为18．3kDa，包含162个氨基酸，PI为8．283。P18蛋白可通过感染细胞核膜孔复合体在核质内聚集，并能够不停穿梭于核内和胞浆之间，并且其核内P18蛋白C末端的氨基酸具有运输蛋白的功能(CostasC等，2005)。(2)oC蛋白无论在N．MDRV、MDRV、GRV，还是在其他禽类呼肠孤病毒中，oC蛋白是研究最多的蛋白。oC蛋白是由S1基因组第三个ORF编码的，ORF位于20．313位氨基酸，PI为5．995。oC蛋白为外衣壳蛋白，是一种结构蛋白，在呼肠孤病毒基因组编码的所有。类蛋白中是最小的。aC蛋白是由多聚体构成，N．MDRV的oC蛋白单体为36kDa，能够形成同源三聚体，AnaGrande等(2002)研究表明，形成的同源三聚体具有疏水性，R 山东农业大学硕士学位论文是aC蛋白稳定的重要原因之一，如果提高单价和二价盐浓度也可增强cC蛋白三聚体的稳定性。在病毒感染细胞的过程中，三聚体的形成具有重要的作用。Liu等(2003)对oC蛋白结构的研究发现，在其N．端存在一个七肽重复序列(heptapeptide)，并且这个七肽重复序列的第一个和第四个氨基酸具有疏水性，能够形成典型的Q．螺旋结构，结合低聚糖蛋白进一步卷曲，最终形成超螺旋结构(coiled．coil)。2～5个双性0【．螺旋连接起来，就构成了左手超螺旋结构，进而与七肽序列形成不溶性，从而大大提高了aC蛋白的稳定性。Grande等(2002)对cC蛋白的研究表明，新表达的cC蛋白在某种情况下会发生低聚化，而且与细胞的结合实验表明cC与受体结合的程度和低聚化有关。cC蛋白能够从被ARV感染细胞中提取，并能特异性结合禽类细胞，其携带有特异性中和反应的表面抗原，在某种程度上能产生群特异性中和抗原。Meanger等(1999)的研究认为cC蛋白还与病毒的传染力，以及ARV引导形成合胞体的活性有关。因而，cC蛋白在ARV的感染及其致病性有着重要的作用。cA蛋白cA蛋白由N．MDRV的S2基因编码，ORF位于S2基因组的16．1268位氨基酸，由416个氨基酸组成，分子量大小为46．1kDa，PI为8．544。cA蛋白位于病毒粒子内，是构成病毒核衣壳的重要微量成分(Yin等，2002)。cA蛋白的N端主要为p转角和p折叠，C端则主要是Q螺旋和p转角(Liu等，2003)。用单克隆抗体检测cA蛋白时发现，cA蛋白至少有两个抗原决定簇，分别是抗原决定簇I、II，通过改变溶液的条件，进一步发现抗原决定簇I是依赖构象抗原决定簇，而抗原决定簇II为非依赖构象的抗原决定簇(Wan等，2003)。但到目前为止，并没有发现这两个抗原决定簇的生物学功能。cA蛋白可以保证ARV免受宿主干扰素抑制，其作用机理是cA蛋白结合dsDNA，使宿主的解旋酶不能够对dsDNA进行解链，致使宿主干扰素的基因不能够正常的转录，进而抑制了干扰素的合成(Martinez等，2000)。有学者发现cA蛋白还具有磷酸酯酶的活性，能够非特异性的把三磷酸核昔(nucleosidetriphosphate，NTP)水解成二磷酸核苷(nucleosidediphosphate，NDP)或是核苷酸(nucleosidemonophosphate，NMP)及自由磷酸(‰等，2002)。一般的水解酶直接作用在NTP的Y位上的磷酸二酯键，形成NDP。cA不仅具有一般NTP水解酶的特性，而且还拥有很强的水解能力，能够彻底水解NTP成为NMP，并为基因的复制和转录提供足够的能量。cB蛋白9 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用cB蛋白由N．MDRV的S3基因编码，ORF位于S3基因组的31．1134位氨基酸，由367个氨基酸组成，分子量大小为41．4kDa，PI为6．630。aB蛋白是外衣壳蛋白，与6C蛋白一样为结构蛋白。aB蛋白携带有群特异型中和抗原决定簇，通过对氨基酸的序列分析可知，在aB蛋白的N．端和C．端分别存在两个相互独立的基序，分别是N．端的锌指基序，C一端的核昔酸结合基序。锌指基序具有稳定自身的作用，核昔酸结合基序则可以与dsDNA结合(Ni等，1993；Martinez等，1997)。6B蛋白通过oC蛋白来发挥作用，提高对细胞的感染能力。oNS蛋白oNS蛋白由N．MDRV的S4基因编码，ORF位于S4基因组的24．1127位氨基酸，由367个氨基酸组成，分子量大小为40．1kDa，PI为6．825。aNS蛋白为非结构蛋白，其具有RNA活性，能非特异性结合异源的单股RNA(single．strandRNA，ssRNA)。用单抗结合oNS蛋白发现有三个抗原决定簇(A，B，C)，进一步用SDS和2．巯基乙醇作用发现三个抗原决定簇中有两个是非依赖构象的抗原决定簇(B和C)，一个是依赖构象的抗原决定簇(A)(Hou等，2001)。研究发现，aNS蛋白可以改变自身结构，选择性聚集ssRNA，而且其中的一个非依赖构象的抗原决定簇(B)参与了ssRNA结合，这对于呼肠孤病毒复制的起始阶段起着重要作用。aNS蛋白还能够与州S蛋白共同作用，能够提高或者补充gNS蛋白的活性(Femando等，2004)。1．7N．MDRV与MDRV感染引起的病理变化比较MDRV分布于全国各地，各品种的鸭都可感染，该病毒可引起番鸭非常严重的疾病，死亡率高达10％,-,50％：N．MDRV主要出现在中国的浙江和福建这种番鸭大规模养殖的地区。这种病在4到26日龄的禽类中造成了5％50％的损失。因此，区分N．MDRV与MDRV感染对加强地区性的番鸭饲养管理具有重要的意义。番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染引起的临床症状主要是拉稀，软脚，关节肿胀以及生长受阻。患病番鸭精神沉郁，厌食，排白色或绿色稀粪；两脚软弱无力；部分病鸭趾关节或跗关节肿胀，喜蹲伏，头颈无力下垂：病鸭由于怕冷常挤成一堆，两周龄内患鸭能耐过的很少，部分病愈鸭较消瘦。病理变化主要是早期死亡的番鸭外观良好，病程越长，死鸭越瘦弱。剖检可见喉头有黏液，肺淤血水肿；肝脏暗红、肿大，密布灰白色、直径0．5～1．0inill的坏死点，其边缘不齐，无光泽(见图5A)；脾脏肿大，出现坏死点，直径2．O～3．0mm，有的连成一片，形成花斑状(见图5B)；肾脏有出血点或条形出血10 山东农业大学硕士学位论文斑；胰腺有细小出血点，少见坏死点；十二指肠臌气、肠道溃疡，有的病死鸭肠道后半段肠壁变薄，内有泡沫样物。部分病鸭有纤维素性胸膜炎、气囊炎，泄殖腔中有白色糊样粪便。通过电镜观察，可发现病鸭的肝脏、肺脏和肾脏等实质性器官发生不同程度的细胞病变，主要是细胞变性以及水肿等；脾脏等免疫器官的淋巴细胞以及浆细胞出现不同程度的坏死或凋亡。新型鸭呼肠孤病毒(N．MDRV)感染引起的临床症状主要是患病雏鹅、鸭精神萎顿，食欲减退以致废绝，绒毛杂乱无光泽，喙和蹼苍白，体弱消瘦，行动缓慢、腹泻；患病耐过鹅常出现跛行，跗关节、跖关节、趾关节、脚和趾屈肌腱等部位肿胀。解剖特征性病变主要是肝脏、脾脏、肾脏和胰腺等器官出现大量出血点和坏死灶，具体表现为弥漫性出血性坏死性肝炎(见图5C)；脾脏广泛出血、坏死(见图5D)；胰腺实质多发性灶状坏死；肾脏实质浊肿；肺充血、局灶性出血坏死。在慢性病例肿胀关节腔内充满清朗渗出液，有的病例关节腔内有纤维素性物。切片显微镜下可见，肝细胞崩解，腺泡组织破坏或完全消失；免疫器官如脾脏中脾髓结构完全消失，淋巴组织大部分萎缩消失，淋巴管扩张，淋巴细胞浸润，不见完整的淋巴小结。图5MDRV与N-MDRV感染雏番鸭病理变化比较Figure5ComparisonofpathologicalchangesofmuscovyducklingsinfectedbyMDRVandN-MDRV1．8禽呼肠孤病毒病检测方法由于呼肠孤病毒对番鸭引起的病变与很多其他病原体引起的病变有很多的相同点，仅依靠解剖鉴别存在很大的不确定性。因此，快速准确鉴别呼肠孤病毒引起的疾病的方法是有效防制呼肠孤病毒传染的前提。现在常用的用来诊断呼肠孤病毒的方法主要分为两大类，分别是血清学检测和分子生物学检测。而血清学检测又包括琼扩实验、酶联免1l 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白问接ELISA检测方法的建立及应用疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光实验(IFA)以及蛋白免疫印迹(WesternBlot)等：分子生物学检测包括反转录．聚合酶链反应(RT．PCR)、eDNA探针技术等。1．8．1血清学检测血清学检测针对的是感染家禽体内存在的抗体，具有快速准确的特点。琼扩实验是用来检测呼肠孤病毒的群特异性抗体，主要用来进行呼肠孤病毒流行感染情况的大范围检测；IFA既可以用来检测抗体，也可用来检测抗原，因为IFA能够对病毒准确的定量，因此主要用来进行呼肠孤病毒的定量检测；WesternBlot主要用来检测抗体。现在应用最为广泛的血清学检测方法就是酶联免疫吸附技术，简称ELISA。该方法原理是用病毒表达的一种蛋白作为抗原进行包被，用感染家禽的血清作为一抗，与抗原进行反应，用抗该家禽的血清作为二抗，与抗原抗体复合物进行反应，进而显色得到结果。这种方法具有敏感性高，简单易操作，省时省力等特点。自从2000年以来，针对ARV建立的ELISA检测技术已经很多，包括用oB和oC以及oNS蛋白建立的检测方法。Shien等(2000)用表达纯化的oB蛋白作为抗原，建立了oB．ELISA检测ARV的方法，用来检测鸡群中是否存在ARV感染以及免疫情况；Liu等分别用oC和oA蛋白(2000)与oC和oB蛋白(2002)建立不同的ELISA检测技术，用来检测ARV感染的细胞培养物或者组织样品，检测结果显示这种方法具有更高的特异性；ChelaPN等(2004)用oNS蛋白作为抗原制备了单克隆抗体，建立了相应的ELISA检测方法；耿宏伟等(2006)用MDRV表达的oC蛋白建立了检测MDRV的ELISA检测方法，经过与琼扩实验比较，发现该方法具有更好的特异性和敏感性。1．8．2分子生物学检测分子生物学是近年来发展起来的新的检测技术，包括RT-PCR和eDNA探针技术，在很大程度上提高了ARV检测的敏感性、特异性和准确性((Liueta1．，1997：Xieeta1．，199)。胡奇林等(2004)应用RT-PCR技术对MDRVS1基因进行了特异性扩增，扩增出300bp左右的目的条带，该方法可以检测到lpg的病毒核酸；严进等(2009)根据MDRV的oNS基因核算序列设计引物及TaqMan探针，建立了TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法，结果表明该方法具有良好的重复性、稳定性和特异性，并且灵敏度较高，可以检测到1．0×102拷贝／此的标准品，比普通PCR的灵敏度至少提高了100倍；李启强(2012)建立了检测MDRV的套式RT-PCR检测方法，通过对分离的MDRV检测结果12 山东农业大学硕士学位论文显示，该方法能够从MDRV中扩增出符合目的条带的特异性片段，检测的灵敏度可以达到O．1pg的病毒RNA。1．9番鸭呼肠孤病毒疫苗研究疫苗接种是预防畜禽传染病最有效的方法，安全有效的预防疫苗研究是预防兽医学研究工作的一个重点。国内外对番鸭呼肠孤病毒疫苗已经很多，主要是油乳灭活苗和弱毒苗，基因工程苗则比较少。1．9．1灭活苗灭活苗最主要的是安全，而且便于生产和储存，免疫后还能够减少病毒的重组与变异的危险。刘思伽等(2006)报道了采用MDRV分离株NH9908病毒株成功研制蜂胶佐剂灭活疫苗。实验结果表明，用蜂胶佐剂灭活疫苗免疫7d、14d、49d后攻毒保护指数分别为77．8、100、100；中和试验结果表明，保护率达95％。陈仕龙等(2012)报道了采用N．MDRV分离株JM85病毒株研制了油佐剂灭活疫苗。实验结果表明，油佐剂灭活疫苗具有较高的安全性以及良好的免疫原性，麻鸭在二免之后28d产生较高的中和抗体，能够维持比较长的时间：而种番鸭免疫后的子代雏番鸭能够产生母源抗体，可以抵抗强毒的感染。1．9．2活疫苗(弱毒苗)活毒苗生产方法简单，价格便宜，操作方法方便，主要通过气雾或皮下接种进行免疫。番鸭呼肠孤病毒活疫苗是预防控制番鸭呼肠孤病毒病的有效措施。林锋强等(2011)对番鸭呼肠孤病毒活疫苗诱导的免疫应答进行了分析，结果表明，弱毒接种1日龄雏番鸭4h后，即可在心脏、肝脏、脾脏以及血液中检测出病毒的RNA；8h后，在肺脏、肾脏和胰腺中也能够检测出弱毒RNA。通过实验结果可以发现，MDRV弱毒免疫4h后就能够在免疫器官中分布，弱毒进入番鸭体内后，可迅速分布于各个器官中，有利于刺激机体产生免疫力。1．9．3基因工程苗基因工程苗包括基因重组疫苗、基因缺失疫苗以及病毒抗体复合物疫苗。基因重组疫苗是指病毒微生物的免疫基因通过分子生物学方法将其分离，而后与载体DNA连接，实现遗传性状的转移与重新组合，再将含有目的基因的载体进行正常的复制与表达，从而将获得的增殖培养物或者含有目的基因的载体直接接种宿主动物，在宿主体内表达诱 新型番鸭呼肠孤病毒aC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用导免疫反应。基因缺失疫苗是指应用克隆技术，将病原微生物中与致病性有关的基因序列敲除或者失性，使病原微生物成为无毒或者弱毒，但病原微生物仍然具有良好的免疫原性。病毒抗体复合物疫苗是指由特异性高免血清或者抗体与适当比例的病毒相互作用，产生的抗原抗体复合物作为疫苗。基因重组疫苗不但具有活疫苗与灭活苗的优点，而且对载体病毒或细菌以及插入基因相关病毒的侵染均有保护力，同时一个载体可以插入多个目的基因，因此可用该技术生产多价疫苗或者多联苗。基因缺失疫苗同样具有活疫苗与灭活苗的特点，而且基因缺失株稳定性好，不会因传代复制而恢复毒力。病毒抗体复合物疫苗制备条件要求比较高，需要掌握好抗体或血清与病毒的比例。蒋慷慨等(2007)采用含有CMV启动子．增强子的pCI质粒与MDRV的oC、oB基因制备了oC、oB蛋白基因DNA疫苗。实验结果表明，其成功构建了pCIS3基因DNA疫苗质粒与pCIS4基因DNA疫苗质粒。1．10MDRVoC基因研究进展MDRV首次报道是在40年前，而且MDRV病毒分离毒株不完整的基因组序列已经有报道。最近二十年，MDRV毒株分子特性的研究主要集中在S系列基因组片段，对于S基因的研究已经取得了很多的进展，尤其是对MDRVS4基因表达的oC蛋白。Kuntz．SimonG等克隆番鸭呼肠孤病毒法国株(MDRV．89330)的小片段基因Sl，S3和S4，并测定其核甘酸序列及其相应的编码蛋白，尤其是S4基因编码oC蛋白的特性，并研究了其表达产物所诱导产生的免疫保护力，证明了S4基因编码的oC蛋白能够产生良好的免疫保护力。欧阳岁东等用RT-PCR技术扩增出MDRVMW9710病毒分离株的oC蛋白基因，并且插入到T．载体，通过测序分析发现13C蛋白基因的开放阅读框为810nt，编码由296个aa组成，蛋白大小为39．4Ku。用BLSAT分子生物学软件对oC蛋白基因分析，发现与法国的MDRV-89330的oC蛋白基因同源性高达93％，推导的aa的同源性也高达93％。同时也发现MW9710病毒分离株oC蛋白具有较大的疏水性与抗原性。余旭平等用RT-PCR技术扩增出MDRVZJ99病毒分离株的oC蛋白基因，成功获得843bp的特异性扩增片段。通过对扩增产物的测序发现，ZJ99病毒分离株的oC蛋白基因福建MW9710株对应基因的同源性为98％，与法国89330株对应基因的同源性为14 山东农业大学硕士学位论文93％；通过BLAST对比发现，ZJ99株编码的oC蛋白与MW9710和89330株相应蛋白分别具有94％、89％同一性和95％、93％相似性。孙美玉等采用杆状病毒对鸭呼肠弧病毒的oC蛋白进行了表达。证明用杆状病毒表达的oC蛋白具有较好的反应活性，既可作为诊断试剂和亚单位疫苗的重组抗原，也为进一步研究ARVoC蛋白的功能奠定了基础。邹光盛采用巴斯德毕赤酵母，对鸭呼肠弧病毒oC蛋白进行了表达。实验通过WestonBlot检测测出oC蛋白具有免疫活性，这与Kuntz．SimonG等用杆状病毒表达载体表达DRV法国株89330的S3，S4基因证明S4基因编码的oC蛋白具有产生良好的免疫保护力的结果相一致。1．11本研究的目的与意义MDRV的外衣壳蛋白oC蛋白是病毒的主要免疫蛋白，可诱导机体产生特异性保护性中和抗体，这就致使oC蛋白成为研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂和基因工程亚单位疫苗的候选抗原蛋白。N—MDRV的oC基因在分子大小和基因同源性方面与鸡呼肠孤病毒(鸡病毒性关节炎)存在很大的差异，研究表明，番鸭和鸡呼肠孤病毒不存在交叉反应，这就致使用来检测鸡呼肠孤病毒病的血清学诊断试剂不能用来检测N．MDRV。有研究表明N．MDRV与MDRV之间几乎不存在交叉反应，因此，用来检测MDRV的血清学检测方法同样不能用来检测N．MDRV。本研究利用pET-28a原核表达系统成功地表达了新型呼肠孤病毒oC蛋白，并制备了高效的兔抗oC多克隆抗体，经WesternBlot与间接免疫荧光实验验证，制备的oC蛋白以及兔抗oC多克隆抗体具有良好的反应活性。利用纯化的oC蛋白建立了N．MDRV的间接ELISA检测方法，经试验验证，该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。对临床送检的血清进行检测，检出率达到98．5％。2实验材料与方法2．1实验材料2．1．1菌株与试剂N-DRV病毒株ZJ00M由本实验室在浙江省发病番鸭群分离并保存，原核表达载体pET-28a(+)为Novagen公司产品，感受态细胞Transl0、BL21(DE3)均购自北京全式15 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用金生物技术有限公司。RNA提取试剂盒、OnestepRT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒、T载体连接试剂盒、ExTaqDNAPolymerase、NcoI和XhoI限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司(Takara)；质粒小量抽提试剂盒购自Omiga公司；卡那霉素、IPTG等试剂和培养基购自生工生物工程有限公司；Ni．NTA蛋白亲和层析柱购自Novagen公司；FITC标记的羊抗兔IgG购自中杉金桥生物技术有限公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。2．1．2实验动物SPF胚购自杭州荐亮生物制品有限公司，实验兔购自浙江省农业科学院实验兔场。2．2实验方法2．2．1引物设计与合成根据N．MDRV毒株ZJ00M分离株Sl基因序列(GenBank登录号：KFl54114)以及表达载体pET-28a(+)的特性，利用Oligo6．0软件设计一对特异性引物，引物序列大小为571．1533bp。引物由上海英骏公司合成，设计合成的引物如下：上游引物oC-NcoI(+)：5'-ACA￡￡4匹堡ATCGCAACGAGGTGATACGCCTG．3’，其5’端斜体下划线部分设计有NcoI位点；下游引物oC—XhoI(．)：5’．御rA￡丝鲤鱼GCCCGTGGCGAC’GGTGAAGCG吖AC．3’，其5’端斜体下划线部分设计有XhoI位点。2．2．2N．MDRV获取与培养病料来自浙江省的一个养鸭场，病死鸭肝组织具有出血性坏死斑，取肝组织病料用来接种SPF鸡胚。病料加入适量含有抗生素(青霉素10000U／ml，链霉素10000U／m1)的PBS(pH7．2)进行简单的研磨，得到20％(w／v)的混悬液。混悬液在12000rpm条件下离心10min，将上清接种到10日龄SPF鸡胚的绒毛尿囊膜，每只鸡胚接种0．2ml，鸡胚观察7d。进行细胞传代培养，将尿囊液接种到lml鸡胚成纤维细胞(DF．1)(细胞按照1：10的比例稀释)。将细胞放在37V孵化1h进行病毒吸收，换掉培养液，加入含有I％FBS的新的培养液。细胞在37。C／5％C02条件下培养48．72h，每天观察细胞病变(CPE)。将细胞冻融3次，低速离心去除细胞碎片，将上清液．70。C保存备用。分离度必须在细胞上培养3代才能够用于扩增与测序。2．2．3病毒模板的制备16 山东农业大学硕士学位论文病毒RNA参照Takara公司提供的RNA提取试剂盒说明进行提取：1)取2009L细胞上清液液，加入到1．5ml的离心管中；2)加入200I．tL的SolutionA，用振荡器剧烈震荡混匀后，室温放置5min；3)加入759L的SolutionB，混合均匀后，12000rpm离心5mira4)将上清液转移到新的CollectionTube(2ml，试剂盒中提供)，加入2509L异丙醇(1％冰乙酸)，上下颠倒混匀；将试剂盒中的SpinColumn安置于另一新的CollectionTube6)将上述操作4)的上清液转移至SpinColumn中，12000rpm离心lmin，弃滤液；7)将5009L的RinseA加入至SpinColumn中，室温静置lmin，12000rpm离心lmin，弃滤液；8)将800I-tL的RinseB加入至SpinColumn中，室温静置lmin，12000rpm离心1min，弃滤液；9)再次进行12000rpm离心lmin，空离；10)将SpinColumn安置于新的1．Sml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25止的ElutionBuffer，室温静置lmin；11)12000rpm离心lmin，洗脱病毒RNA，标记后放入．80"C保存。2．2．4RT-PCR扩增N．MDRVaC基因反转录合成cDNA：反应体系如下，先取病毒RNA5ttL，加入上下游引物各2此，98"C条件下作用30mira而后取79L引物变性液，加入29L5xM—MLVBuffer，O．5此dNTPMixture，O．25此RNaseinhibitor，0．25此RTaseM-MLV(RNaseH-)，总体系为10I_tL，于50℃30min，94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃lmin，35个循环，72℃5min，4"C结束，．80℃保存供PCR使用。PCR扩增：总体系为50止，在PCR管中加入2ttLeDNA，8ttLdNTPMixture，5pLBuffer，0．59LrTaq酶，上游引物lgL，下游引物l此，用无菌蒸馏水加至501-LL体系；反应条件如下，94。Clmin，94"C30s，56"C30s，72"C1min，35个循环，72"C5min，4"C结束。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，．80"C保存备用。2．2．5重组克隆载体的构建与鉴定2．2．5．1N．MDRV6C基因的回收与纯化取50IItLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，恒压120．150V，电泳30min后，在紫外17 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用线下观察，切下含靶基因片段的凝胶，放于1．5ml离心管中。具体回收方法如下：1)在离心管中加入4009L的BufferGM，在室温15．25"C条件下溶解胶块；2)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；3)将步骤1)中的溶液转移到SpinColumn中，12000rpm离心1min：4)将滤液再转移到SpinColumn中，12000rpm离心lmin；5)将7009L的BufferWB加入到SpinColumn中，室温12000rpm离心lmin，弃滤液；6)重复步骤(5)；7)将SpinColumn安置于CollectionTube上，室温12000rpm离心lmin；8)将SpinColumn安置于新的1．5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25止的ElutionBuffer，60℃静置lmin；9)室温12000rpm离心lmin洗脱DNA，．30℃冷冻保存。2．2．5．2N．MDRVaC基因的克隆与鉴定将回收纯化的目的基因克隆进pMD．18TSimpleVector，采用lO斗L的连接体系进行克隆，具体为SolutionI5lxL，目的基因41．tL，pMD．18T载体lI．tL；反应条件为16"C过夜连接。将连接产物转化到Transl0感受态细胞中，具体操作如下：1)取50此冰上融化的感受态细胞，加入连接产物5此，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；2)42℃热激。30s，然后快速转移至冰浴中2min，该过程不要动摇离心管；3)向离心管中加入950肛L无抗的LB培养基，混匀后置于37"C，180rpm培养1h，使菌体复苏；4)4000rpm离心2min，留200rtL上清吹悬菌体，加入到含有Ampi100I．tg／m1)抗性的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开；5)将平板置于37"C至液体被吸收，倒置平板，37"C过夜培养。挑取单个菌落，放入含有5mlAmp(1001．tg／m1)抗性的LB培养基的试管中，37"C，220rpm培养10h，使菌体大量繁殖。PCR反应总体系为50此，在PCR管中加入2pL菌液，8此dNTPMixture，5此Buffer，O．5此rTaq酶，上游引物11．tL，下游引物lp．L，用无菌蒸馏水加至50)xL体系；反应条件如下，94"Clmin，94"C30s，退火56"C30s，延伸72"C1min，35个循环，72"C5min，4"C结束。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照OMGA公司质粒抽提试剂盒的说明，提取质粒： 山东农业大学硕士学位论文1)取1．Sml菌液放置于离心管中，室温12000rpm离心lmin；2)加入250p,L的SolutionI／adNlaseA，用振荡器剧烈震荡混匀；3)加入250肛L的SolutionlI，上下颠倒混匀几次，直至得到清亮的液体，室温静置2min；4)加入350pL的SolutionlII，上下颠倒混匀几次，直至出现白色絮状沉淀；5)室温13000rpm离心10min；6)将HiBindMiniprepColumnI安装在2ml的CollectionTube上，将上清小心的转移至干净的HiBindMiniprepColumnI中，室温12000rpm离心1min，使上清完全的通过HiBindMiniprepColumnI进入到CollectionTube中，弃滤液；7)加入500pL的BufferHB洗涤HiBindMiniprcpColumnI，室温12000rpm离心lmin，使上清完全的通过HiBindMiniprepColumnI进入到CollectionTube中，弃滤液；8)加入700pL的DNAWashBuffer，室温12000rpm离心1min，使上清完全的通过HiBindMiniprepColumnI进入到CollectionTube中，弃滤液；9)重复步骤8)；10)室温13000rpm离心2min，进行空离；11)将HiBindMiniprepColumnI放置在新的1．5ml的离心管中，在抹中央加入30肛L的ElutionBuffer，室温静置2min；12)室温12000rpm离心2min，洗脱DNA，．30"C保存备用。将提取的质粒用NcoI、XhoI进行双酶切鉴定，酶切总体系为500L：质粒15p．L，10xKBuffer5pL，BSA5皿，NcoI、XhoI各2pL，用无菌蒸馏水加至50此体系；酶切条件为37"C过夜酶切。取3此酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。回收酶切产物，．80℃冷冻保存。2．2．5．3重组质粒的序列测定与序列分析将菌液PCR鉴定与酶切鉴定都为阳性的菌体送往英骏公司进行序列测定，用DNAStar软件将测序结果与GenBank上公布的N．MDRVZJ00MoC基因参考序列(KFl54114)进行比较，分析两者的同源性。2．2．5．4原核表达载体pET28a．oC的构建与鉴定1)重组表达载体的构建将冷冻保存的原核表达载体菌pET-28a(+)进行大量培养并且大量提取质粒DNA，对其进行NcoI、XhoI双酶切，取酶切产物琼脂糖凝胶上样电泳，将目的片段切下回19 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用收纯化，与冷冻保存的T载体酶切回收产物采用DNALigationKit进行连接，连接总体系为109L，SolutionI5皿，T载体酶切回收产物49L，pET028a(+)质粒酶切回收产物lgL，连接条件为16。C过夜连接。连接产物转化至Transl0感受态细胞，将菌液均匀涂布在含有卡那(100}_tg／m1)抗性的LB琼脂培养基上，37"C过夜培养，挑取单个菌落大量培养之后进行菌液PCR鉴定与酶切鉴定。2)重组表达载体的菌液PCR鉴定与酶切鉴定按照之前的菌液PCR方法对培养的菌液进行PCR鉴定，大量培养的菌体进行质粒DNA的提取，将提取的质粒DNA用NcoI、XhoI进行双酶切，将PCR产物与双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。3)重组质粒转化至E．coliBL21(DE3)将PCR鉴定与双酶切鉴定均为阳性的菌体质粒DNA，取1pL左右转化至表达宿主菌E．coliBL21(DE3)感受态细胞，将菌液均匀涂布在含有卡那(100}tg／m1)抗性的LB琼脂培养基上，37℃过夜培养，挑取单个菌落大量培养之后进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的茵体．80℃保存菌种，用于后面的重组蛋白的表达分析。2．2．6重组oC蛋白的表达与鉴定2．2．6．1重组oC蛋白的初步表达鉴定取51xL冷冻保存的pET28a-oC重组菌，接种于含有5ml卡那(100pg／m1)抗性的LB培养基的试管中，37。C，220rpm震荡培养培养5h，在OD值达到O．伽．8时，取1．0ml于1．5ml的离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，低温保存菌体作为诱导前空白对照。剩余的菌液按照1：1000的比例加入1．0mM的IPTG进行诱导，继续培养5h后取1．0ml于1．5ml的离心管中，12000rpm离心lmin，弃上清。在诱导前后的菌体中分别加入1509L的1xSDSLoadingBuffer，用加热器105"C加热5min，12000rpm离心1min，在SDS—PAGE胶上加入101xL上清液，同时加入PrestainedProteinMarker作为参考，80V电泳30min后，120v电泳90min，然后凝胶经考马斯亮兰染色lh，用清水煮沸5min脱色，重复3次，脱色后扫描保存图片。同时设立空载体对照。2．2．6．2IPTG最佳诱导浓度的确定取10I-tL冷冻保存的pET28a．oC重组菌，接种于含有10ml卡那(100pg／m1)抗性的LB培养基的试管中，37"C，220rpm震荡培养培养5h，在OD值达到0．6-42．8时，取1．0ml2n 山东农业大学硕士学位论文于1．5ml的离心管中，12000rpm离心lmin，弃上清，低温保存菌体作为诱导前空白对照。剩余的茵液按照每管1．0m1分装到6个1．5ml的离心管中，按照1：1000的比例加入IPTG进行诱导，每管的IPTG终浓度为0．4mM、0．6mM、0．8mM、1．0mM、1．2mM，继续培养5h，按照之前的方法处理样品进行电泳分析。2．2．6．3IPTG最佳诱导时间的确定取5rtL冷冻保存的pET28a-aC重组菌，接种于含有5ml卡那(1001xg／m1)抗性的LB培养基的试管中，37"C，220rpm震荡培养培养5h，在OD值达到0．6-4)．8时，取1．0ml于1．5ml的离心管中，12000rpm离心lmin，弃上清，低温保存菌体作为诱导前空白对照。剩余的菌液按照1：1000的比例加入最佳诱导浓度的IPTG进行诱导，剩余的菌液分别在lh、2h、3h、4h、5h各取出1．0ml菌液，按照之前的方法处理样品进行电泳分析。2．2．6．4重组aC蛋白细胞定位分析取5此冷冻保存的pET28a-aC重组菌，接种于含有5ml卡那(100lxg／m1)抗性的LB培养基的试管中，37"C，220rpm震荡培养培养5h。取1．5ml的菌液接种于200ml的卡那(100p,g／m1)抗性的LB培养基中，37。C，220rpm震荡培养培养5h，待OD值达到0．㈣．8时，按照1：1000的比例加入200p,L的IPTG，再按照最佳诱导时间进行诱导。获得菌体蛋白的方法如下：1)将诱导的菌液分装在4个50ml的离心管中，7800rpm离心10min，弃上清。2)每个离心管中加入5ml的非变性BindingBuffer(pH8．0)，将沉淀的菌体蛋白充分重悬，将两管合并成一管，得到两管分别为10ml的菌液；3)将菌液冻融一次；4)每个离，tb管中加入100I．tL的溶菌酶(终浓度100I-tg／m1)，30"C作用30min，期间要注意摇晃几次，使溶菌酶能够充分作用；5)超声破碎：功率为9W，破碎时间5s，间隔时间5s，连续破碎10min，破碎两次，得到透明不黏稠的破碎菌液，该过程在冰上操作；6)将破碎菌液分装到1．5ml的离心管中，4"C，12000rpm离心30min；7)取上清到50ml的离心管低温保存，沉淀放在冰上保存；将获得的菌体蛋白进行细胞组分分析，将沉淀用变性BindingBuffer(pH8．0)溶解完全，4"C，12000rpm离一tb30min。对非变性上清与变性上清用Ni+．NT’A蛋白亲和层析柱进行纯化，纯化过程如下：21 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用1)将Ni+-NTA蛋白亲和层析柱分别放置于两个特定的柱子里，用非变性BindingBuffer和变性BindingBuffer平衡两次；2)将非变性上清与变性上清分别加入到非变性BindingBuffer和变性BindingBuffer平衡的Ni+柱里；3)将柱子放置于摇床上，摇晃混匀30min，使Ni+与蛋白能够充分完全的结合；4)过滤BindingBuffer，分别加入5ml非变性WashBuffer(pH8．0)与变性WashBuffer(pH6．3)洗柱子，洗两次；5)取两个干净的1．5ml离心管放置于两个柱子下面，分别用lml非变性ElutionBuffer(pH8．0)和变性ElutionBuffer(pH4．5)洗脱蛋白。将洗脱的蛋白各取150pL，加入150I．tL2xSDSLoadingBuffer混匀煮沸后进行SDS．PAGE电泳。根据电泳结果，对目的蛋白进行切胶回收，提高目的蛋白的纯度以及浓度。具体回收方法如下：1)纯化的蛋白加入同体积2xSDSLoadingBuffer，煮沸5-10min，用大孔的梳子制孔，然后进行SDS．PAGE电泳：2)电泳结束后用去离子水浸泡凝胶，于微波炉中加热30S(注意不要使水沸腾)；3)脱色摇床上轻摇3-5min；4)重复步骤2)和步骤3)两次；5)用0．25mol的KCI进行显色，1-2min后在凝胶上可见乳白色条带，将条带切下放入50ml离心管，4"C保存备用。重组oC蛋白的洗脱过程如下：1)把膜杯在60℃洗脱缓冲液中浸泡至少lh；2)将过滤板塞到玻璃管底部，使其底部平整，套上白色硅胶接头；3)将玻璃管插入洗脱模块，确保玻璃管上缘与环孔齐平，用灰色的小帽盖上不用的环孔：4)将浸泡好的膜杯插入装满洗脱液的硅胶接头内，用枪头反复的吸取洗脱液以除去透析膜上的气泡；5)在玻璃管内装满洗脱液，将要洗脱的凝胶(一般凝胶高度lcm)放入玻璃管内；6)将整个洗脱模块放入洗脱槽内，加入约600mL洗脱缓冲液至没过接头上缘，同时在上槽内加入约100mL洗脱缓冲液；’’ 山东农业大学硕士学位论文7)盖上洗脱槽盖子，接通电源，设每管电流9mA，蛋白洗脱约4h。8)洗脱完毕后，打开盖子，取下灰色小帽，将上槽缓冲液漏掉。用枪头快速吸去玻璃管内的缓冲液，并保证此过程没有搅动过滤板下的溶液；9)小心取下整个接头和膜杯，用枪头将膜杯内的液体吸出至0．5mlEP管内。2．3重组酊蛋白免疫印记分析(WestemBlot)2．3．1SDS．PAGE电泳制备DS—PAGE胶：取两块配套玻璃板装配好，固定在制胶架上，加12％配制好的分离胶至其2／3体积处，用水封口；待分离胶凝固后将水吸去，加入配制好的5％浓缩胶，插入梳子，待凝。加样：将2xSDSLoadingBuffer处理好的样品取15此加入到凝胶中，加入PrestainedProteinMarker作为参考；电泳：80V电泳30min后，120V电泳90min，至样品完全迁移到分离胶的最底部，终止电泳。2．3．2WesternBlot过程1)转膜：剪2张滤纸和1张NC膜，其大小略小于凝胶大小，将NC膜和滤纸用转膜液润湿，按照电转印正极一滤纸一凝胶—．NC膜一滤纸一电转印负极的顺序安装，50mA电转印2h；2)封闭：将上述NC膜用PBST洗10min，放入含5％脱脂乳的封闭液中，4。C封闭过夜；3)一抗孵育：弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次5min，然后将其放入封闭液1：2000稀释好的一抗(阳性对照采用N．MDRV自然感染康复鸭阳性血清，待检血清为兔抗多克隆血清)中，于37℃温育1h；4)二抗孵育：弃去一抗，用PBST洗涤NC膜3次，每次5min，再用PBS漂洗一次。将NC膜移至用PBST1：1000稀释好的二抗(阳性对照采用HRP标记羊抗鸭IGg，待检血清采用HRP标记的山羊抗兔IGg)中，37"C温育lh；5)DAB显色：弃去二抗溶液，用PBST洗涤3次，每次5min。于一干净平皿中按照先后加入10mlPBS，100此DAB显色液，10此显色液增强剂，10rtL30％H202，混合均匀。将NC膜放入显色液中30s左右，显色完全之后，放入去离子水中终止显色。2．4重组oC蛋白间接免疫荧光分析(IFA)23 w新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用1)将生长旺盛的培养鸡胚原代成纤维细胞(DF．1)，接种于6孔板，待细胞生长到覆盖孔底80％左右，接种N．MDRV病毒，同设阴性、阳性对照；2)病毒接种24h后PBS洗三次，加4％多聚甲醛室温固定30min；3)用DBS-NP40洗三次，每次2ml，摇床轻摇5min，晾干；4)将兔血清用DBS．NP40100倍稀释作为一抗，阳性对照用DBS-NP4050倍稀释的康复番鸭血清，每孔500I_tL，37"C孵育1h；·5)用DBS．NP40洗三次，每次2ml，摇床轻摇5min，晾干；6)将FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，用DBS．NP40200倍稀释，每孔加5001．tL；阳性对照加5001．tL用DBS—NP40100倍稀释的FITC标记的羊抗鸭IgG，37"C孵育lh；7)用DBS．NP40洗三次，每次2ml，摇床轻摇5min，晾干；8)加5001．tL碱性甘油后在荧光显微镜下观察。2．5间接ELISA检测方法的建立禽呼肠孤病毒病已经成为影响我国养鸭业发展的重要疫病之一。N．MDRV是呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属的成员，它与传统的禽呼肠孤病毒(avianreovirus，ARV)在致病性和免疫原性方面存在很大的差异。在前面的研究中，N．MDRVoC蛋白具有良好的反应原性与免疫原性，而且经过回收纯化，oC蛋白完全可以用来作为诊断抗原。本研究以重组的N．MDRVaC蛋白为包被抗原，建立了N．MDRV间接ELISA检测方法，并且建立了间接ELISA检测试剂盒。间接ELISA的基本操作程序：1)抗原包被：将切胶回收纯化的抗原用包被液作适当稀释，包被ELISA板，每孔加包被液1009L，4。C过夜包被，用PBST洗三次，将洗液用吸水纸吸干；2)抗原封闭：将封闭液加到ELISA板，注意每孔都加满，37"C封闭2h，用PBST洗三次，将洗液用吸水纸吸干；3)加入待检血清：待检血清用封闭液按照一定比例进行稀释，将稀释的血清加入到ELISA板，每孔100rtL，37"C孵育一定时间，用PBST洗三次，将洗液用吸水纸吸干；4)加入酶标二抗：将酶标二抗用封闭液按照一定比例进行稀释，将稀释的酶标二抗加入到ELISA板，每孔1001．tL，37。C孵育一定时间，用PBST洗三次，将洗液用吸水纸吸干；5)加底物溶液：将配好的显色液按照每孔1001．tL加入到ELISA板，37"C孵育10min，然后用2M的H2S04按照每孔501．tL加入到ELISA板终止显色反应，立即测定OD450。24 山东农业大学硕士学位论文2．5．1间接ELISA反应条件的优化2．5．1．1封闭液的选择常用的封闭液主要由4中，分别是5％明胶、5％脱脂乳、10％牛血清与10％马血清。按照间接ELISA的操作方法，抗原按照1：800、l：1600、1：3200与1：6400进行包被，血清采用1：100进行稀释，二抗选择用1：1000进行稀释，同时设立阴性对照，对这四种封闭液进行选择，确定最佳的封闭液。2．5．1．2抗原包被浓度与血清稀释度的选择切胶纯化后的蛋白用包被液按1：200、1：400、1：800、1：1600：1：3200、1：6400、1：12800和l：25600稀释，一抗阳性血清和阴性血清分别用稀释液按1：25、l：50、1：100、1：200、1：400稀释，采用方阵滴定法确定抗原蛋白包被浓度和一抗血清的稀释度，酶标二抗作1：1000倍稀释，一抗、二抗均37℃反应60min，加底物后37℃显色10min，测定阴、阳性血清OD450值。选择阳性血清与阴性血清OD450比值(P／N)值最大，且阴性血清OD450较小的抗原浓度和血清工作浓度，从而确定抗原最适包被浓度和血清稀释度。2．5．1．3一抗血清最佳作用时间的选择用最适的抗原浓度包被酶标板，用最适一抗稀释度37℃分别作用15min、30min、45min、60min，用HRP标记羊抗兔二抗1：1000稀释作用60min，用已知的阳性血清和阴性血清进行ELISA检测，以确定一抗血清最适作用时间。2．5．1．4酶标二抗最佳作用时间的选择用最适的抗原浓度包被酶标板，用最适一抗稀释度作用最佳时间，用HRP标记羊抗兔二抗1：1000稀释分别作用15min、30min、45min、60min，用已知的阳性血清和阴性血清进行ELISA检测，以确定二抗最适作用时间。2．5．2间接ELISA检测方法阴阳性临界值的确定利用前面已经优化好的ELISA检测方法对收集的阴性血清进行检测，计算出OD450值的平均值X(．)和标准方差(SD)，根据公式：临界值上限=阴性血清OD450值的平均值X(．)+3x标准方差SD，临界值下限=阴性血清OD450值的平均值X(．)+2x标准方差SD．计算出临界值。根据统计学原则，样本的OD450值>阴性样本OD450值的平均值X(．)+3x标准方差SD时，可以在99．9％的水平上判断为阳性。2．5．3间接ELISA检测方法重复性实验 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用按照已经确定的间接ELISA操作程序，随机选取6份血清，重复4次，计算批内、批间变异系数，以检测其重复性。2．5．4间接ELISA检测方法敏感性实验将阳性血清做l：100、1：200、1：400、1：800、1：10005个稀释度稀释，其他条件按最佳反应条件进行。2．5．5间接ELISA检测方法特异性实验用N—MDRVcC蛋白包被ELISA板，分别加入经典呼肠孤病毒阳性血清、坦布苏病毒阳性血清、禽流感病毒血清、新城疫病毒血清以及新型番鸭呼肠孤病毒阳性血清进行检测，检验其特异性。2．5．6临床样品的检测用已经建立的间接ELISA检测方法，对来自浙江、江苏等地的870份送检血清进行检测。3实验结果3．1I弭PCR结果取5pLPCR产物经琼脂糖凝胶电泳，获得与预期大小相符的963bp的条带(见图6)。表明引物设计合理，RT-PCR反应条件正确，能成功扩增与目的片段大小一致的条带。1_图6o<3基因PCR扩增结果Figure6AmplificaitonofoCgeneandIdentificationofrecombinantplasmid1．PCR扩增产物：M．DL150001．AmplificaitonofoCgene；M．DL15000lⅪ图7菌液PCR扩增结果Figure7theProductsofcoenobiumPCRidentification1．菌液PCR扩增产物；M．DL150001．theProductsofcoenobiumPCRidentification；M．DL15000 山东农业大学硕士学位论文3．2重组质粒的鉴定3．2．1重组质粒pMD一18T-aC的鉴定取5此冷冻保存的pMD—18T-oC重组菌，接种于含有含有5mlAmp(100I_tg／m1)抗性的LB培养基的试管中，37"C，220rpm培养10h，使菌体大量繁殖。菌落PCR产物电泳可见一条大小与目的条带大小一致的条带(见图7)，菌落PCR结果表明目的片段已被成功克隆进pMD．18T-oC载体中。将上述通过菌落PCR鉴定为阳性的菌落送英骏公司进行测序，将测序结果与标准株进行比较，结果扩增的目的片段与报道的ZJ00M株oC基因的核昔酸序列同源性为100％，测序报告如下：GATCGCAACGAGGTGAIACGCCTGATACl’TTCCCTCCTCCCCTACCAGTCAAGCGACGTCGATCATTTGACGACACAGATCAAATCCCTCCAAAGCGCCGTCGACTCACTCAAAGAATCACAAGTGGTGGTGTTGAGACGCCTGACTACGA兀ACGTCGACGGTGGCAGATCTACAATCAACAACTGAATTGTTGACCTCACAGGTGGCAGGACTTAGTTCCCGTGTGGCTTCAGTGACTGATGAGGTAGTCCATGTAGAITCAG，rI’ATTG(孔气TCTACGATCACTAATCTTGACAATGTCCGGTCCGAGCTATCCTCTCTCTCCTCCCAAGTCTCGTCGCAGACGCCCACTCTAACGAATCTTACGTCAACCGTTTCATCTCAGTCTCl7TTCGATTTCTGATCTCCAGCAACGAGl’TACGGCCTTAGAACGATCGGGTGGTGTGCCGACGCGGlTTGAAGCTCCCTTGCAACTACAGAACGGAGTCGTCTCACTCCAAGCCTCCCCCTCTTTCTGTTCT丌GTCTCCGATCCTCTCCGGACCTGCTGATGCTGCTGTCTTCAGGGTTGGTGAGTGGCTGGGAACTGTCACATCTGGTCAAAGTCAGTCATCTGCAATCATGAACGTGCGGATTCA丌CAn_rGGGCAGCGGACCATGTrGCTTATGTCCTCGCAAATG仉蛆’TCACTATTCCGCCAGGTTCGGGTGCGTClTTGCAGCl’AGATGTGAATCGCAI：AACGACCCCTGCCA：丌GACGTTGCTATGGTAACTCCTTCTGCTGCGTTTGCTTCTGCTTCCTlm虹GGCTGAC朋隗GCTTTCAAAGACTCTAAGACAGGAGAAGTCCATGC，r，rTACACACllACTGGCTCT丌TC(讼TCACCTTClTTCTCTATCGCTTGGGTCCCGG7I’TGCTTCAGAAACTCGTA御阿ArCAAATAATGGCG”陵CGCTTCACCGTCGCCACGGGCC3．2．2重组质粒pET-28a-oC的鉴定连接产物转化至Traml0感受态细胞，涂布与适合pET-28a-oC重组菌生长的平板上，27 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用有单菌落长出，挑选单个菌落进行菌落PCR鉴定，同时将同一菌落接种于含卡那抗性的LB液体培养基中，37"(2，220rpm过夜培养后，进行质粒的提取，将提取的pET-28a．oC质粒进行NcoI／XhoI双酶切鉴定。经初步筛选的阳性重组质粒双酶切鉴定结果显示两条大小约为5300bp和963bp条带，与理论预期相符(见图8)。结果表明oC基因插入正确，表明重组表达载倒_l9M图8oC基因PCR扩增结果及重组质粒酶切鉴定图Figure8AmplificaitonofoCgeneandIdentificationofrecombinantplasmid1．PCR扩增产物；2．重组质粒酶切；M．DL150001．AmplificaitonofoCgene；2．Identificationofrecombinantplasmid；M．DL150003．3重组cC蛋白在大肠杆菌中的表达分析3．3．1重组pET-28a．oC质粒转化进E．coliBL21(DE3)后的鉴定分析重组pET-28a-oC质粒转化进表达宿主菌E．coliBL21(DE3)后，按照常规方法培养，提取质粒DNA，进行菌液PCR与NcoI／XhoI双酶切鉴定双酶切鉴定。电泳结果显示，菌液PCR结果与双酶切均产生了大小约为963bp的条带，而双酶切则产生了5300bp与963bp的条带，表明重组质粒转化成功，可进一步用于蛋白的表达研究。3．3．2重组cC蛋白的初步表达鉴定将培养的带有重组pET-28a．oC质粒表达宿主菌在诱导前后分别取1．0ml，离心去掉上清，设立空载体诱导表达对照。进行SDS．PAGE电泳，结果表明，带有空载体质粒表达宿主菌在诱导5h后出现非特异性条带，带有重组pET-28a-cC质粒的表达宿主菌诱导5h后在36KDa左右出现一条特异性蛋白条带，与预期的蛋白分子量大小一致(见图9)，说明表达的蛋白是正确的，表明重组的oC蛋白在表达宿主菌E．coliBL21(DE3)中能够获得较高的表达。 山东农业大学硕士学位论文‰M1iUI：{0。97,。。；一遴．二—_；；lk图9重组oC蛋白SDS．PAGE电泳图Figure9SDS—PAGEofoCrecombinantproteinM．蛋白低分子量标准：1．pET-28a质粒BL21(DE3)菌体诱导前；2．重组质粒BL21(DE3)菌体诱导前：3．pET-28a质粒空载体BL21(DE3)菌体诱导后；4．重组质粒BL21(DE3)菌体诱导后M．ProteinLadder；1．PlasmidofpET-28ainBL21(DE3)beforeinduced；2．RecombinantplasmidinBL21(DE3)beforeinduced；3．PlasmidofpET-28ainBL2I(DE3)afterinduced；4．RecombinantplasmidinBL2I(DE3)afterinduced：3．3．3重组aC蛋白诱导表达条件优化3．3．3．1重组aC蛋白诱导表达IPTG最佳浓度的优化确定5个不同浓度IPTG对培养的带有重组pET-28a．aC质粒的表达宿主菌进行诱导，诱导之后样品经过1×SDSLoadingBuffer煮沸处理，进行SDS．PAGE电泳。结果显示，5个不同浓度IPTG的诱导结果，浓度为1．0mM的IPTG诱导结果最好，目的蛋白的表达量最高(见图10)。Ⅵm图10最佳IPTG诱导浓度的确定Figure10DeterminationoftheoptimalconcentrationofIPTGinductionM．蛋白低分子量标准；1．未加IPTG诱导茵体；2．0．4mMIPTG诱导菌体；3．0．6mMIPTG诱导菌体；4．0．8mMIPTG诱导菌体；5．1．0raMIPTG诱导茵体；6．1．2mMIPTG诱导菌体M．ProteinLadder；1．Thalluswithno1PTG；2．Thallusinducedwith0．4mMIPTG；3．Thallusinducedwith0．6mMIPTG；4．ThallusinducedwithO．8mMIPTG；5．Thallusinducedwith1．0mMIPTG；6．Thallusinducedwith1．2mMIPTG凌霉静*锵 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用3．3．3．2重组oC蛋白诱导最佳时间的优化用最佳诱导效果的IPTG浓度对培养的带有重pET028a-oC质粒的表达宿主菌进行诱导，在不同的时间段分别取1．0ml诱导的菌液，12000rpm离心低温保存，设置5个诱导时间段，样品经过I×SDSLoadingBuffer煮沸处理，进行SDS．PAGE电泳。结果显示，5个不同时间段的诱导结果，在5h后诱导结果最好，目的蛋白表达量最高(见图11)。图ll最佳诱导时间的确定FigurellDeterminationoftheoptimaliuducedtimeM．蛋白低分子量标准；1．空载体对照菌体；2．未诱导菌体：3．诱导1h菌体；4．诱导2h菌体；5．诱导3h菌体；6．诱导4h茵体；7．诱导5h菌体；M．ProteinLadder；1．Thallusofemptyvectorcontrol；2．Thallusnotinduced；3．Thallusinducedlh；4．Thallusinduced2h：5．Thallusinduced3h：6．Thallusinduced4h：7．Thallusinduced5h3．3．3．3⋯重组oC表达蛋白细胞定位分析用最佳诱导效果浓度的IPTG对培养的带有重组pET-28a．oC质粒的表达宿主菌进行最佳诱导时间的诱导，通过超声破碎获得茵体蛋白采用两种方法收集，上清用非变性BindingBuffer，离心的沉淀采用变性BindingBuffer进行溶解。将获得的两种溶液用Ni+-NTA蛋白亲和层析柱进行纯化，纯化之后的蛋白进行SDS．PAGE电泳。结果显示，采用非变性BindingBuffer溶解的蛋白中，目的蛋白的含量很少，条带很暗；而采用变性BindingBuffer溶解的沉淀中，目的蛋白的含量很高，条带很粗很清晰(见图7)。结果说明目的蛋白存在于菌体的包涵体中，只能够采用含有尿素的变性BindingBuffer进行溶解。3．3．3．4重组oC表达蛋白亲和层析纯化与切胶纯化比较确定目的蛋白存在的形态，对目的蛋白进行常规的Ni+-NTA蛋白亲和层析柱纯化回收。取回收的目的蛋白用2xSDSLoadingBuffer煮沸处理，进行SDS．PAGE电泳。结果显示，纯化回收的目的蛋白中具有一定的杂带，蛋白纯化的效果不是很好，这将直接影30 山东农业大学硕士学位论文响后面的WesternBlot实验与间接免疫荧光实验(IFA)。对亲和层析纯化回收的目的蛋白进行切胶回收，进一步提高目的蛋白的纯度已经浓度。切胶回收的方法如上所述，通过对目的蛋白的切胶回收，结果显示，目的蛋白的纯度获得了较大的提高，经过亲和层析纯化的蛋白纯度为80％，而经过切胶回收之后的目的蛋白的纯度达到92％，而蛋白的浓度则提高了1．6倍(见图8)。3．4重组oC表达蛋白免疫印记分析(WestemBlot)设立阳性对照与阴性对照，用制备的兔抗多克隆血清对表达回收的重组oC蛋白进行WesternBlot分析。阳性对照采用N．MDRV自然感染康复鸭阳性血清作为一抗，阴性对照采用空载体诱导表达蛋白作为一抗，待检血清为兔抗多克隆血清。结果显示，阳性对照在36KDa具有条带，阴性对照则没有结果，待检血清在36KDa也具有明显的条带，与预测的结果相一致(见图12)。表明制备的重组oC蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。M95·-一72——一55—43—3日【DB一34一图12重组oC蛋白WesternBlot鉴定Figure12WesternBlotofoCrecombinantproteinM．蛋白低分子量标准；1．重组oC蛋白兔血清；2．pET028a(+)质粒空载体；3．鸭血清结果M．ProteinLadder；1．o(2ProteinofRabbitanti—serum2．PlasmidofpET-28a(+)；3．Duckanti-scram；3．5重组oC表达蛋白间接免疫荧光分析(IFA)设立阳性对照与阴性对照，用制备的兔抗多克隆血清对表达回收的重组oC蛋白进行IFA分析。阳性对照采用N．MDRV自然感染康复鸭阳性血清作为一抗，待检血清为兔抗多克隆血清。结果显示，阳性对照具有明显的结果，待检血清也具有明显的结果， 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用而阴性对照则没有结果(见图13)。结果表明，血清能够与新型鸭呼肠孤病毒感染的DF．1细胞发生特异性反应，表明制备的血清具有良好的特异性和反应原性。图13重组oC蛋白IFA实验结果(10x10)Figure13IdentificationofoCrecombinantproteinbyIFA(10x10)A．正常DF．1细胞；B．新型呼肠孤病毒感染的DF．1细胞A．NormalDF-1Cells；B．DF-1CellsinfectedbyN—MDRV3．6间接ELISA反应条件的优化3．6．1封闭液的选择按照间接ELISA的操作方法，对5％明胶、5％脱脂乳、10％牛血清与10％马血清这4种封闭液进行实验，结果见表。通过对结果的分析，5％的脱脂奶粉封闭效果最好。表3最佳封闭液的确定Table3Determinationoftheoptimalblockingsolution 山东农业大学硕士学位论文3．6．2蛋白最适包被浓度与血清稀释度的确定aC蛋白最适包被浓度和血清稀释度方阵滴定测定的阳性血清与阴性血清的比值(P／N)见表1，由表可以看出，当抗原做1：12800，血清做1：100稀释时，P／N值最大为8．26，且阴性血清的非特异性反应并不明显(相对OD450值为0．073)，阳性血清的OD450值为0．603。蛋白包被浓度在l"12800与1：25600之间OD450值下降比较大，而血清在l"100与1：200之间OD450值下降比较大。通过以上的分析，选择蛋白在1：12800，血清在l"100作为最佳稀释度，oC蛋白最适包被浓度为0．078125肛g／mL。表4抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释浓度的确定nhle4neterminatinnofthennfimUmconcentrationnfgnti唧．enatedanddillltinnnfRen]rft3．6．3酶标二抗最佳工作浓度的确定根据最佳抗原包被浓度与最佳血清稀释浓度的确定结果，将纯化的oC蛋白与N-MDRV阳性血清按照最佳稀释度进行稀释后按照ELISA方法进行操作，酶标抗体做l：500、1：1000、1：2000、l：4000、1：8000、1：16000和1：320007个稀释度进行ELISA实验，测定其OD450值。通过对OD450值的分析以及间接ELISA的判定标准，选择1：1000作为二抗的最佳稀释度。 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用表5酶标二抗最佳稀释度的确定Table5DeterminationoftheoptimaldilutionofHRPsecondaryantibody3．6．4血清与二抗最佳反应时间的确定用重组oC蛋白以其最佳抗原包被浓度条件下包被ELISA板，4℃过夜，用5％脱脂奶粉封闭2h，将血清以及二抗都做最佳稀释倍数，分别在37℃下反应0．5h，lh，1．5h，2h，然后进行ELISA测定，测定其OD450值并求P／N值，以确定血清与二抗的最佳作用时间。通过测定，最终确定血清的最佳作用时间是1h，二抗的最佳作用时间是lh。3．6．5间接ELISA检测方法阴阳性临界值的确定对90份的N．MDRV的阴性血清经ELISA检测，对各检测结果的OD450值进行统计学分析，主要分布在0．100．0．199之间，占总样品数的64．8％。以阴性血清的OD450值为横坐标，分为10组，以各组血清份数为纵坐标，得到N．MDRV的阴性血清OD450值分布直方图(见图13)。这些数据经统计学方法处理，样品平均值【X(．)】与标准差(SD)分别为X(．)=0．161，SD=0．024，得到置信区间上限为X(．)+3SD=0．233，我们把0．233作为N．MDRV阴性血清的上限；X(．)+2SD=0．209，我们把0．209作为N．MDRV的可疑界限。根据统计学原理，当测定结果大于X(．)+3SD时，我们可以在99．9％的水平上判定为阳性。因此，我们得出ELISA的判定标准，即OD450值大于等于0．233时判定为阳性，0D450值小于0．209判定为阴性，OD450值介于0．233与0．209之间的判定为可疑，需要重新检测。 山东农业大学硕士学位论文图13N-MDRV阴性血清0D4s0值分布直方图Fit,urel3DistributionhistogramofN．MDRVnegativeserum0D．。nresults3．7间接ELISA检测方法重复性实验3．7．1批内重复性实验对随机选取的6份番鸭血清进行间接ELISA测定，进行四次批内的重复，结果经统计学分析其变异系数在1．67％．6．30％，说明同一批样品在在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。表6批内重复性实验结果Table6Resultsofintra-assayrepetitiveexperiment0．5470．5080．5350．553O．2640．5380．4960．5030．54l0．2860．5240．4870．5010．5370．2580．52l0．48l0．5220．5320．2880．5330．4930．5150．5410．2740．012O．0120．0160．009O．0152．25％2．43％3．1l％1．67％5．47％F0．4170．3660．368O．373O．3810．0246．30％3．7．2批间重复性实验用不同批包被抗原对6份番鸭血清在4个日期内进行重复性实验，结果经统计学分析其变异系数在5．25％．8．14％，说明同一批样品在在不同批次试验中变异程度很小，具35ABCDE 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用有较好的重复性。表7批间重复性实验结果Table7Resultsofinter-assayrepetitiveexperiment3．8间接ELISA检测方法敏感性实验用N．MDRVoC蛋白在最佳包被浓度包被ELISA板，用最佳封闭条件进行封闭，将阳性血清做1：100、1：200、1：400、1：800、1：10005个稀释度稀释，其他条件按最佳反应条件进行，进行检测方法的敏感性实验。结果显示，oC重组蛋白当阳性血清稀释到1：800时，通过ELISA显色后依靠肉眼已经难以分辨结果的阴、阳性，但是酶标仪仍然可以检测出，当阳性血清稀释到1：1000时，酶标仪检测的结果为仞性。表8敏感性实验结果Table8Resultsofsensitiveexperiment阳性血清稀释倍数阴性血清l：100l：200l：400l：800OD450值0．6730．6060．4480．2633．9间接ELISA检测方法特异性实验l：lOoo0．165用N．MDRVoC蛋白在最佳包被浓度包被ELISA板，用最佳封闭条件进行封闭，用坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽流感H5N1和H9N2、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒 山东农业大学硕士学位论文阳性血清以及新型番鸭呼肠孤病毒阳性血清按照1：100进行稀释，其他条件均按照最佳条件进行试验，对间接ELISA检测方法进行特异性检测。结果显示，坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽流感H5N1和H9N2、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒阳性血清结果均小于O．17，而新型番鸭呼肠孤病毒阳性血清的结果为0．665，阴性对照为O．156，这说明包被的抗原不与坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽流感H5N1和H9N2、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性反应，而与新型番鸭呼肠孤病毒阳性血清发生特异性反应。该结果证明了建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性。3．10临床样品的检测对来自浙江、江苏等地的870份来自康复群或者攻毒群血清进行检测。这870份血清的来源，均是近几年发现有呼肠孤病毒感染，采集血清后剖检发现新型番鸭呼肠孤病毒的症状，并且采集并料提取RNA。对这些剖检怀疑为N—MDRV感染的血清用RT-PCR与建立的间接ELISA检测方法进行检测。检测结果发现，这870份的血清中，用RT-PCR检测来自浙江的469份血清样品阴性血清只有1份，其余的均为阳性，而用间接ELISA检测方法检测阴性血清只有1份，可疑的血清具有l份，剩余的均为阳性血清；用RT-PCR检测来自江苏的401份血清样品没有阴性血清，均为阳性，而用间接ELISA检测方法检测没有阴性血清，可疑的血清具有1份，剩余的均为阳性血清。用建立的间接ELISA检测方法检出率为98．5％。通过间接ELISA检测表明，该方法具有很高的检出率，没有检测出来的两份血清可能是由于血清存放的时间太长，导致血清中的抗体水平下降。通过对近几年的呼肠孤病毒病的流行病学调查以及RT-PCR检测结果和间接ELISA检测结果表明，在浙江、江苏等地流行的呼肠孤病毒主要是N．MDRV，这与云涛等在其文章报道N．MDRV已经成为优势毒株的结论相符合。我们所建立的间接ELISA检测方法对N．MDRV进行检测，具有很高的检出率，因此，这种方法具有应用于临床的重要意义。4讨论4．1目的基因的选择N-MDRV的基因组分为L，M和S三个基因组，其中L基因中的L1，L2和L3分别表达尬，LB和九C三种蛋白：M基因中的M1，M2和M3分别表达嶂，“B和州S三种蛋白；S基因中的Sl，S2，S3和S4分别表达(aC，P10，P18)，aA，aB和aNS 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用六种蛋白，这十二种蛋白中非结构蛋白总共有4种，分别是州S、P10、P18和aNS，其余的8种都是结构蛋白；8种结构蛋白中尬，旭，九C，衅和(sA是核蛋白；剩下的pB，oB和oC是外衣壳蛋白，其中oB和oC与中和抗体的产生有关。归蛋白可被蛋白酶水解成一个大的C．端片断“BC与一个小的N．端片断gBN，归蛋白与其分解产物分别形成病毒的颗粒结构，而且uB蛋白参与了病毒的侵入过程，具有转录酶的活性，因而可以提高ARV对巨噬细胞的攻击能力。oB蛋白携带有群特异型中和抗原决定簇，在oB蛋白的N．端和C．端分别存在两个相互独立的基序，分别是锌指基序与核昔酸结合基序，而且oB蛋白通过aC蛋白来发挥作用，提高对细胞的感染能力。aC蛋白能够从被ARV感染细胞中提取，并能特异性结合禽类细胞，其携带有特异性中和反应的表面抗原，在某种程度上能产生群特异性中和抗原。有研究认为aC蛋白还与病毒的传染力，以及ARV引导形成合胞体的活性有关，由此可以推断，csC蛋白在ARV的感染及其致病性有着重要的作用。因此，很多科研学者将aC蛋白基因插入到表达载体上，通过表达宿主菌用IPTG对csC蛋白进行表达，得到了目的蛋白。为此，参照已经发表的N．MDRV的基因序列以及查阅文献的内容，选择aC蛋白基因作为本研究的目的基因。4．2N．MDRVcsC蛋白基因的融合表达基因的融合表达是指将一段目的基因连接到特定的载体上，将带有目豹基因的载体转化到表达宿主菌里面，然后对表达宿主茵进行培养，用IPTG进行诱导获得的细菌表达蛋白。目．的蛋白与具有亲和力配对的多肽或蛋白构成重组融合蛋白，利用固定化亲和层析纯化目的蛋白。本研究采用的是pET表达系统中的pET-28a表达载体，这种表达载体能够在E．coli中克隆表达重组蛋白，是一种强大的原核表达载体。N．MDRV6C蛋白基因克隆到pET-28a表达载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导表达。而在非诱导条件下，N．MDRVaC蛋白基因则处于沉默状态而不会被转录，更不会被表达。在诱导条件下，一般诱导3-5h目的蛋白就可达到最佳表达量，而且改变条件也会影响蛋白的表达，比如降低诱导物的浓度则会降低目的蛋白的表达量，而降低诱导的温度，则会增加目的蛋白的可溶性。pET-28a表达载体本身带有组氨酸(His)标签，可以用固定化的镍离子亲和层析柱进行目的蛋白的纯化。4．3N．MDRV6C蛋白的纯化对目的蛋白的初次表达，一般都是采用原核表达系统，特别是以E．coli表达宿主菌38 山东农业大学硕士学位论文的蛋白表达系统。而采用原核表达系统表达的蛋白则会出现在细胞内聚集，形成包涵体的现象，本研究所表达的蛋白在表达宿主菌内就是以包涵体的形式存在的。包涵体本身不只是有目的蛋白，主要包括非活性的重组蛋白，还含有一些质粒的DNA，RNA，ANA聚合酶其它的菌体蛋白。包涵体的形成有好的一方面，也有不好的一方面。好的一方面是形成包涵体以后可以有效的防止目的蛋白的重组或者降解，从而有利于目的蛋白的纯化；不好的一方面是包涵体不容易溶解，必须采用高浓度的尿素进行溶解。在菌体破碎离心之后就可以达到目的蛋白的初步分离，菌体破碎的越完全，则越有利于目的蛋白量的提高。菌体的破碎一般采用溶菌酶、冻融、匀浆、超声等酶学或物理学方法破碎菌体。本研究采用冰浴超生与溶菌酶共同作用的方法来破碎菌体，最后采用高浓度的尿素来溶解包涵体。目的蛋白的纯化采用镍离子亲和层析柱与溶解有目的蛋白的溶液混合，将带有His标签的目的蛋白结合到层析柱上，然后将目的蛋白采用梯度洗脱，将目的蛋白洗脱下来。常用的梯度洗脱有两种方式，第一种是pH值由高到低进行梯度洗脱；第二种是采用咪唑浓度由低到高进行梯度洗脱。由于咪唑洗脱的目的蛋白不能够用分光光度计测浓度，因此本研究采用第一种的pH值由高到低进行梯度洗脱。将洗脱的目的蛋白进行切胶回收可以进一步提高目的蛋白的纯度及浓度。4．4N-MDRVaC蛋白抗原特性分析oC蛋白是N。MDRV的外衣壳蛋白，能够刺激机体产生特异性保护性中和抗体。因此，确定N．MDRVaC蛋白的反应原性以及免疫原性对于用aC蛋白来确定N．MDRV病具有重要意义。常用来确定蛋白抗原特性的实验方法主要有两种，分别是WesternBlot与IFA。WesternBlot又称蛋白免疫印迹分析，是用抗体检测蛋白的重要方法之一，是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。IFA又称间接免疫荧光，是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。本研究采用这两种方法来确定重组oC蛋白的抗原特性。而通过这两种实验方法发现，重组oC蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，可以用来作为诊断N．MDRV病的一种特异性抗原。本研究所用的目的蛋白是通过原核表达系统进行表达的，并且通过切胶回收提高目 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用的蛋白的纯度以及浓度，这样可以避免采用细胞培养物的全病毒作为抗原所带来的很多问题，比如浓度低、容易进行扩散、病毒纯化不容易以及最严重的交叉反应等问题。4．5间接ELISA检测方法分析ELISA检测方法具有操作简单、快速、敏感性高以及抗原在酶标板上可以保持较长时间的活性等优点。本研究N．MDRVoC重组蛋白进行了初步应用，对用重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法的一系列条件进行了探索，最终确定了建立间接ELISA检测方法的各项条件。在间接ELISA试验中，封闭液采用5％的脱脂乳封闭效果最好，有效的封闭了载体表面的残留活性部位。因为抗原的包被浓度以及血清的稀释浓度直接关系到间接ELISA检测方法的敏感性与特异性，所以我们采用方阵实验来确定抗原的最佳包被浓度以及血清的最佳稀释浓度，最终确定抗原的包被浓度为0．078125J-tg／mL，血清的最佳稀释浓度为1：100，酶标二抗的最佳稀释浓度为1：1000。血清与包被抗原的最佳作用时间也是关系到整个实验结果好坏的一方面，因此我们通过比较确定，血清与抗原作用的最佳时间为1h，与酶标二抗作用的最佳时间也是1h。底物显色时间的长短对结果也有一定的影响，我们确定底物显色时间为10min效果最好。从特异性、敏感性以及重复性的实验结果来看，我们确定的反应条件是合适的。本研究采用N．MDRVoC重组蛋白建立间接ELISA检测方法，实验证明完全可以用作诊断抗原检测新型番鸭呼肠孤病毒病。这种抗原与多种病毒均没有交叉反映，具有很强的特异性以及极高的敏感性。对浙江、江苏等地的870份RT-PCR检测为阳性的血清进行间接ELISA检测，结果也显示，本研究所建立的间接ELISA检测方法具有很高的阳性检出率。5结论1成功构建了pET-28a-oC重组融合表达载体，表达的蛋白大小为36KDa，而且该基因表达的蛋白基本以包涵体的形式存在。2WesternBlot与IFA实验证明，表达的重组oC蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，可以用来作为诊断N．MDRV病的一种特异性抗原。3以N．MDRVoC重组蛋白初步建立间接ELISA检测方法，通过各项试验探索了最佳反应条件，为临床应用奠定了基础。4对浙江、江苏等地送检的血清检测，检出率高达98．5％。40 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山东农业大学硕士学位论文favianreoviruses．I．Pathogenicityandantigenicrelatednessofseveralavianreovirussolates．AvianDiseases，1989，33：35—544．ShienJH．，YinHS，LeeLH．Anenzyme—linkedimmunosorbentassayforthedetectionofantibodytoavianreovirusbyusingproteinsigmaBasthecoatingantigen．ResVetSci．2000，69(2)：107—12．ShmulevitzM，AmeenZ，DaweS．SequentialpartiallyoverlappinggenearrangementinthetricistronicS1genomesegmentsofavianreovirusandnelsonbayreovirus：implicationsfortranslationinitiation[J]．JournalofVirology，2002：609—618．WanC．P．，JuiH．S．，LiuH．J．，CharacterizationofmonoclonalantibodiesagainstavianreovirusSl133proteinoAsynthesizedinEscherichiacoli．VeterinaryMicrobiology,2003，91：309．323．WangS．，ChenS．Y，ChenS．N．，ZhuX．L．，LinF．Q．2010．CloningandeDNAsequenceanlysisoftheS3geneofanovelduckreovimsstrainNP03inChina,JournalofAgriculturalBiotechnology,18(3)：567—572Wang，D．，Xu，E，Ma,G，Zhang,C．，Huang，Y，Li，H．，Zhang，D．，2012．CompletegenomicsequenceofanewMuscovyduck—originreovimsfromChina．J．Vir01．86，12445．Wang,Y，Zhou，J．，Yan，W，Qian，Z．，Zhuang，G，Qin，s。，Wang，J。，Zhu，G，2002．Primarystudiesonthegoslinghemorrhagic—necrotichepatitis．Chin．Poult．24，9-11(inChinese)．WoodGW，NicholasrA，Herbertcn．Serologicalcomparisonsofavianreoviruses【J】．JComPathol，1980，90：29—38．XieZX，AminA．AmplificationofavianreovirusRNAusingthereversetranscriptase．polymerasechainreaction．AvianDiseases，1997，41：654．66．YinHS，SuYP，LeeLH．EvidenceofnucleotidylphosphataseactivityassociatedwithcoreproteinsigmaAofavianreovirusS1133【J]．Virology．2002，293(2)：379．85．Yun，T．，Ye，W．，Ni，Z．，Chen，L．，Yu，B．，Hua,J．，Zhang，Y，Zhang，C．，2012．Completegenomicsequenceofgoose—originreovirusfromChina．J．Vir01．86，10257．45 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用致谢岁月如梭，转眼间，三年的研究生求学生活即将落幕，回首过往的三年，收获了许多。值此论文完成之际，首先谨向我的导师山东农业大学动物科技学院崔言顺教授和浙江省农业科学院畜牧兽医研究所张存研究员致以崇高的敬意和诚挚的感谢!感谢崔言顺教授、张存研究员在生活、学习、工作等方面，给予我无微不至的关怀和教育。导师严谨和求实的科研态度，渊博的理论知识、丰富的实践经验、严谨的治学态度、敏锐的洞察力以及对科研的执着精神，使我在学习中受益匪浅。感谢浙江省农科院畜牧兽医研究所为我提供了一个实验的平台，优越的实验条件和良好的学习环境使得我课题顺利进行；感谢云涛老师、余斌老师、陈柳老师、叶伟成老师、倪征老师、华炯钢老师、张燕老师、王一成老师、袁秀芳老师实验上给予指导与帮助，感谢山东农业大学李建亮老师对本实验给予的意见和指导。在此课题完成过程中和生活中得到了师兄袁朋，师姐刘娟、张会娟、杨少艳；师妹霍亚飞、张玉瑶、王晓芳、韩宏宇、卢悦、郑霞、朱凤珠、刘晓、郑文卿、陈媛嫒；同学许艳芬、王帅、张伟、伊惠、王一新、钱微、曹慧敏、杜雪等的帮助与支持，在此表示由衷的感谢。感谢多年来父母对我含辛茹苦的培养和无微不至的关怀，没有你们就没有我的今天，在此向你们致以崇高的敬意!感谢我所有亲人朋友对我的支持和关心，谢谢你们!本研究凝聚着许多人的心血，在此向浙江省农业科学院畜牧兽医研究所和山东农业大学动物科技学院的所有领导、老师和同学致以诚挚的谢意! 山东农业大学硕士学位论文作者简介及硕士期间发表论文情况硕士期间发表论文情况：陈海鹏，云涛，张存幸，余斌，陈柳，叶伟成，倪征，崔言顺幸．《新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白的原核表达及其抗原特性初步研究》，《浙江农业学报》，文章已录用。47 新型番鸭呼肠孤病毒oC蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用附录主要试剂的配制原核表达主要试剂：氨苄霉素(Amp)贮存液：按10mg／mLL匕例将氨苄霉素粉剂溶于去离子水中，过滤除菌，分装，．20℃冻存。卡那霉素(K30)贮存液：按10mg／mLLL例将卡那霉素粉剂溶于去离子水中，过滤除菌，分装，．20℃冻存。LB液体培养基：胰蛋白胨2．Og，酵母提取物1．09，氯化钠1．89溶于200mL灭菌水中，高压灭菌待用，待冷却时，加氨苄NlOO一120“g／ml浓度，lmL40％葡萄糖，备用。LB固体培养基：胰蛋白胨2．Og，酵母提取物1．09，氯化钠1．89，琼脂粉39，加蒸馏水至200mL，高压灭菌后，待冷却后，加氨苄Nloo．120肛g／mL浓度，lmL40％葡萄糖，倒固体培养基，备用。纯化柱变性BindingBuffer：尿素：8M，Na2HP04：0．1M，Tris‘HCh0．01M，pH8．0，4"C保存。纯化柱变性WashBuffer：尿素：8M，Na2HP04：0．1M，Tris·HCI：0．01M，pH6．3，4。C保存。纯化柱变性ElutionBuffer：尿素：8M，Na2HP04：0．1M，Tris·HCI：0．01M，pH4．5，4"C保存。30％丙烯酰胺：丙烯酰胺14．59，N，N’．亚甲双丙烯酰胺0．59，两者溶于40mL超纯水中，然后定容至50mL，0．45I．tm滤膜过滤后，装于棕色瓶，保存于4。C。10％SDS(WⅣ)：将109SDS溶于100mL灭菌去离子水中，可以适当加热助溶。10％过硫酸铵：过硫酸铵0．59溶于5mL双蒸水中，分装后一20"C冻存。1．Smol／LTris．Cl(PH8．8)：Tris36．339溶180mLddmO中，用HCl调PH值至8．8，定容至200mL。1．Smol／LTris．Cl(PH6．8)：Tris36．339溶180mLddmO中，用HCl调PH值至8．8，并定容至200mL。lxSDS．PAGE电泳液：Tris39，甘氨酸18．89，SDSlg，溶于1LddH20中。10％分离胶的配制(10mL)：水3．3mL，30％丙烯酰胺溶液4．0mL，1．5mol／LTris 山东农业大学硕士学位论文(pH8．8)2．5mL，10％SDSIOOg,L，10％过硫酸铵100肛L，TEMED4p,L。浓缩胶的配制(4mL)：水2．7mL，30％丙烯酰胺溶液0．67mL，1．0mol／LTris(pH6．8)0．5mL，10％SDS40p．L，10％过硫酸铵40旺，TEMED4此。考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2500．59，甘油125mL、冰醋酸50mL溶于300mL超纯水中，定容至500mL，用滤纸过滤除去杂质，室温保存。Westernblot转移缓冲液：甘氨酸1．139，Tris0．3039，甲醇20mL，jJllddH20至100mL，现用现配。5％脱脂奶粉：脱脂奶粉59，溶于100mLPBST中，现用现配。底物显色液(100xDAB)：3，3，5，5．四甲基联本胺(TMB)，用无水乙醇配成lmg／ml浓度后．20"C保存。用时用底物缓冲液20mL，加200pLDAB稀释，同时加入30％H20220此，显色增强液20此，现用现配。终止液(2mol／LH2S04)：H2S04(化学纯)11．1mL逐滴加入到88．9mL去离子水中。PBS(1×)缓冲液：磷酸二氢钾，0．249，氯化钾0．29，磷酸氢二钠1．449，氯化钠89，混匀后力H900mL去离子水，调节PH至7．3左右，定容至1L，高压灭菌后分装，室温保存。PBST：pH7．4的PBS，0．05％Tween．20，混匀后备用。间接ELISA实验主要试剂：包被液(1L)：Na2C03：1．599，NaHC03：2．939，调pH到9．6，4"C保存。底物显色液：A液：0．1M柠檬酸：取19．29柠檬酸加入至JJlL去离子水中溶解；B液：0．2M磷酸氢二钠：取28．49无水磷酸氢二钠加入到lL去离子水中；TMB溶液(10mg／m1)：取10mgTMB溶解至sJlml的DMSO中。取2．43ml的A液与2．57ml的B液混合，用去离子水稀释到10“，然后力ILK501xL的TMB溶液，混匀后力I]／X．101xL30％H202，混合均匀，现用现配。49