fmdv结构基因的克隆和序列分析和vp1的表达及间接elisa方法的建立

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1、摘要口蹄疫(Foot-and·MouthDisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Fodt-∞d．MouthDiseaseVirus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄动物感染的一种烈性传染病，该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展，造成巨大的经济损失，因此世界各国相当重视对该病的研究和防治。口蹄疫病毒衣壳由VPl、VP2、VP3、VP44种结构蛋白各60个拷贝组成，其中VPI蛋白又称1D蛋白，其基因位于基因组的2977．3615位，编码213个氨基酸，VPI暴露在病毒颗粒的表面，是诱导产生中和抗体的主要成分。本试验以口蹄疫病毒的细胞培养毒为材料，通过RT-PCR方法获得了此株病毒结构基因的

2、核苷酸序列，同法获得了口蹄疫疫苗株结构基因的核苷酸序列。对此株口蹄疫病毒与参考毒株的VPI，VP2、VP3、VP4的各核苷酸序列进行了比较，发现主要差异在可以诱导产生中和抗体的Vial上，根据VPI基因序列绘制系统进化树(国际上通用VPI基因绘制系统进化树)，发现此株病毒属于。型FMDV的SEA拓扑型。将此株口蹄疫病毒与口蹄疫疫苗株进行比较发现，VPl完全相同，差异在VP2、VP3上。以已经构建好的plvlDl8．T-VPI质粒为模板，PCR扩增得到FMDVVPI目的基因，将目的基因克隆到pMDl8-T载体中，转化宿主菌TGl后得到重组质粒pMDl8-T-VPI，测序证明此VPl基因序列准确无

3、误。对重组质粒pMDl8．T-VPI和原核表达载体pET-30a(+)分别以相同的限制性内切酶Sacl和HindIIl消化，经连接酶连接，转化宿主菌TGI，筛选出阳性克隆pET-30《+)一VPl。随后将此阳性质粒pET-30a(+)-VPl转化宿主菌BL21(DE3)pLysS中，经IPTG诱导VPI基因的表达，收集不同时间的菌液进行SDS．PAGE、Westernblotting分析和dot-ELISA分析。结果表明VPI基因在大肠杆菌中获得了高效表达，表达的目的蛋白的分子量约为34ku，但表达产物未检测到抗原性。对重组质粒pMDl8一T-VPI和真核表达载体pBlueBacHis2A分别

4、以相同的限制性内切酶SacI和Hindlll消化后，经连接酶连接，转化宿主菌TGI，筛选出阳性克隆pBlueBaeHis2A—VPI。将pBlueBacHis2A．VPl质粒与Bae-N．BlueTMDNA共转染sf9昆虫细胞，噬斑筛选重组病毒，将纯化的重组病毒感染SD细胞，表达了32．6ku目的蛋白条带，dot-ELISA分析表明表达产物具有抗原性。以真核表达的融合蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法，用来检测动物体内FMD的抗体水平。关键词：口蹄疫病毒；克隆；序列分析；真核表达；昆虫细胞；转染；抗体；酶联免疫吸附分析东北农业大学农学硕．士学位论文CloningandSequenceAna

5、lysisofFMDVStructuralGeneandExpressionofVP1，DevelopmentofIndirectELISAAbstractFMDisavirulentinfectionsdiseasecausedbyFMDVthalinfectsartiodactylsuch∞cattle，sheep，pig，融a1．Outbreakandprevalenceofthediseaseendangerthegooddevelopmentofgrazieryseriouslyandeansegreatfinancialloss．soalltheworldhighlightstud

6、yandcontolofthedisease．CapsidofFMDViscomposedofVPl，VP2，VP3，VP4of60copies，ofwhichVPlproteiniscalled1Dprotein，too．Itsgeneisin2977—3615ofgenomeandcodefor213aminoacids．VPlislocatedonthesurfaceofvirusandisthemaincomponentthatinducesneu订alifinganfibody．·MaterialofthestudyWasFMDVfromeellculture。nucleotides

7、equenceofstmcturalgeneofFMDVandFMDvaccinestrainwereacquiredbyRT-PCR．ComparedW讹FMDVreferencestrains，itWasfoundthatthereWaSdifferenceinVPIgeuethatinducesneutralizingantibody，andPhylogenetictreeWaSdrawna