猪嵴病毒VP1基因序列测定与分析.pdf

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南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2016，47(4)：670-6731SSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．nf．yxb．tomDOI：10．3969／j：issn．2095—1191．2016．04．670猪嵴病毒佃j基因序列测定与分析易春华-，谢齐斌-，唐薇薇1，朱春刚I，秦长串2，伍和明1，韦达有P(1桂林市动物疫病预防控制中心，广西桂林541001；2临桂县动物疫病预防控制中心，广西临桂541007)摘要：【目的】对猪嵴病毒(PKV)VPl基因进行测序与同源性分析，确认其可能来源，为今后的生物学特性分析及仔猪腹泻防治工作提供科学依据。【方法】采用RT．PCR对GXPKV．1毒株VPl基因进行克隆，运用DNASTAR软件包qbMegalign程序对测序获得的v引基因进行核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析。【结果】GXPKV．1毒株VPl基因全长762bp，共编码254个氨基酸，与GenBank已公布的13株参考毒株VPI基因的核苷酸同源性为74．10／o-85．4％，推导氨基酸同源性为81．1％-93．3％。根据VPl基因推导氨基酸序列进行系统发育进化分析，发现GXPKV．1毒株与Gansu．2012、JSl419等国内参考毒株同属于同一亚群，而与瑞士分离株Swine．S．1—2007、泰国分离株THA．2008、美国分离株H24．2012．USA及四川分离株CHN．SC．2011-02等的亲缘关系较远。【结论】猪嵴病毒GXPKV．1毒株起源于国内流行毒株的传播，在新的环境下虽然其VPI基因核苷酸发生变异，但由于同义翻译，推导氨基酸的同源性仍然较高，说明碱基突变并未引起蛋白结构的改变。关键词：猪嵴病毒；VPI基因；序列测定；分析中图分类号：$852．659．6文献标志码：A文章编号：2095—1191(2016)04--0670--04Sequenceinl乏andanalysis“。聊t乏eneof。kobuvianalysisolVoroclne0DuwuusrIYIChun—hual，XIEQi—bin1，TANGWei—weil，ZHUChun—gang1，QINChang—chuan2，WUHe-ming1，WEIDa-youl‘(IGulinCenterforAnimalDiseasePreventionandControl，Guilin，Guangxi541001，China；2LinguiCenterforAnimalDiseasePreventionandControl，Lingui，Guangxi541007，China)Abstract：【Objecfive]ThepresentexperimentwasconductedtoanalyzesequenceandhomologyofVPIgeneofprocinekobuvirus(PKV)，andascertainitspossibleseuil3e，inordertoprovidescientificbasisforbiologicalcharacteris—ticsanalysisandpreventionofpigletdiarrheainfuture．【Method】TheV纠geneWasclonedfromstrainGXPKV-1usingRT—PCRtechnique．ThehomologyofitsnucleotidesequenceandthededucedaminoacidsequenceWasanalysedbyusingMegalignprograminDNASTARsoftwarepackages．【Restdt】Theresultsshowedthat，theGXPKV一1V纠genewas762bpinlength，encoding254aminoacids．They川geneofGXPKV-1sharednucleotidehomologyof74．1％-85．4％andaminoacidhomologyof81．1％-93．3％withthoseof13strainspublishedinGenBank．Thephylogeneticevolutionanalysisshowedthat，GXPKV—Istain，Gansu一2012andJSl419belongedtosamesubgroup，andGXPKV一1stainhaddistantge—neticrelationshipwithSwissisolatesSwine—S—l一2007，ThailandisolatesTHA-2008，UnitedStatesisolatesH24—2012一USAandSichuanisolatesCHN—SC一2011—02．【Conclusion】TheGXPKV一1strainisoriginatedinthespreadofpandemicstraininChina．Under山enewenvironment，thenucleotidesofPKVVPlgenemutate．howevermostofwhichiSsynony．mousmutation，SOthehomologyofaminoacidarestillhigh．itindicatesthatbasevariationdoesn’tcausechangeofpro-teinstructure．Keywords：procinekobuvirus(PKV)；’，PJgene；sequencing；analysis0引言【研究意义】猪嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKV)是一种新病毒，属于RNA科、嵴病毒属成员，于2007年首次在匈牙利被发现(Reutereta1．，2008)。迄今为止，收稿El期：2015-09-01基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻20140112)作者简介：+为通讯作者，韦达有(1965一)，高级兽医师，主要从事动物传染病防控研究工作，E-mail：1006072593@qq．com。易春华(1985-)，主要从事动物传染病与分子病毒学研究工作，E-mail：359275009@qq．com 4期易春华等：猪嵴病毒VPI基因序列测定与分析·67卜爱知病毒(Aichivirus，AiV)和牛嵴病毒(Bovinekobuvirus，BKV)已被国际病毒分类委员会(ICTV)认定为嵴病毒的官方成员，而猪嵴病毒尚属于嵴病毒属的候选病毒(梁丹洁，2014)。自2007年以来，在我国、泰国、日本、韩国、巴西和荷兰等国家(Yueta1．，2009；Khamrineta1．，2009，2010；Parketa1．，2010；Barryeta1．，2011)均有检测出猪嵴病毒的文献报道。嵴病毒可感染人类及牛、猪、羊、蝙蝠、狗、猫、小鼠等动物(Reutereta1．，2008)，但是否具有跨种间传播有待进一步证实。而关于嵴病毒是否是引起猪群腹泻的原因目前也尚无定论，须通过基因生物学特性研究进一步验证。【前人研究进展】猪嵴病毒属于RNA病毒，单股正链且无囊膜，病毒颗粒的直径20-30nlTI。猪嵴病毒基因组成包括5’．端非编码区(5'-UTR)、1个大的开放性阅读框(OIu)、3’．非编码区(3'-UTR)及Poly(A)尾，其核苷酸全长8210bp[含Poly(A)序列]，编码2488个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白经病毒蛋白酶作用，可裂解为非结构蛋白(2A．2C、3A．3D)和结构蛋白(Ⅵ，o~Ⅵ，1)。在5’．UTR区发现基因冲突现象，前108个碱基可形成一个茎环二级结构域(SLA—C)，是嵴病毒极具特色的地方，且该区域在传染性病毒粒子的产生及RNA复制过程中发挥重要作用(Sasakieta1．，2001)。VPl蛋白可刺激宿主并促使机体产生中和抗体，是猪嵴病毒的主要免疫原蛋白。陈蕾等(2012)曾对一株猪嵴病毒CHN／2012a(登录号JX294863)的VPI表l引物序列Tab．1Sequenceofpfimer基因进行生物学分析，结果表明，VPl蛋白属于稳定蛋白，稳定系数35．93，属信号肽，无跨膜区，具有氨基酸选择偏向性。【本研究切人点】近几年，猪场发生仔猪腹泻的情况日益严重，且在腹泻猪群中以猪嵴病毒感染率非常普遍，但由于对猪嵴病毒的了解非常有限，无法确定其与近年来仔猪腹泻的发生是否关联。【拟解决的关键问题】通过对猪嵴病毒GXPKV．1株的VPI基因进行序列测定与分析，确认其可能来源，为今后的生物学特性分析及仔猪腹泻防治工作提供科学依据。1材料与方法1．1试验材料猪嵴病毒疑似病料(猪粪便、肠样及肠系膜淋巴结)由桂林市动物疫病预防控制中心到辖区各县(区)采集、保存。，营,RNA抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL2000DNAMarker、胶回收试剂盒购白天根生化科技(北京)有限公司，TaqDNA合成酶、dNTPs、M：gCh购自北京全式金生物技术有限公司，M—MLV反转录酶、HIR抑制剂等购自宝生物工程(大连)有限公司。1．2引物设计与合成参照GenBank中猪嵴病毒全基因的核苷酸序列，利用Oligo6．0及PrimerPrimer5．0软件合成1对以PKV3D基因为参照的特异性检测引物(Kobu-U／Kobu-L)和1对扩增猪嵴病毒VPI基因的特异性引物(VPl．U／VPl一L)，引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成，其序列如表1所示。1．3猪嵴病毒基因RT．PCR扩增1．3．1病料处理无菌采集伴有腹泻症状猪群的组织病料(肠系膜淋巴结或猪肠粘膜等)，对采集的组织病料进行研磨、离心取上清液进行病毒提取或-70℃保存备用。1．3．2猪嵴病毒RNA提取猪嵴病毒RNA采用动物组织总IⅢA提取试剂盒提取，具体操作步骤按照提取试剂盒说明。1．3．3合成反转录eDNA利用随机引物N9进行反转录(RT)，反应总体系25．0斗L：5xBuffer5．0斗L，随机弓I物N92．0斗L，dNTPmix(2．5mmol／ixL)2．0斗L，RNasin酶抑制剂0．5仙L，M．MLV反转录酶(200U／“L)0．5斗L，RNA模板15．0斗L。然后置于PCR仪中进行反转录(42℃1h，95oC5min)，合成的cDNA产物一20℃保存备用。1．3．4目的基因PCR扩增与鉴定以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系25．0斗L：10xBuffer(含MgCl2)2。5IxL，2．5mmol／LdNTPs2。0此，上、下游引物各0．5止，TaqDNA合成酶0．25此，cDNA模板5，0斗L，ddn20补足至25．0斗L。扩增程序：94℃预变性5min；94℃50S，56oC50S，72oC50S，进行35个循环；72。C延伸10min。反应结束后以1．o％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1．3．5PCR产物胶回收、测序与分析PCR产物用1．0％琼脂糖凝胶进行电泳，切下含目的条带的凝胶，以DNA回收试剂盒回收PCR产物，并将纯化的PCR扩增产物送至华大基因进行测序。 ·672·南方农业学报47卷2结果与分析2．1猪嵴病毒基因的鉴定结果提取处理样品的总RNA，并利用引物Kobu-U／Kobu．L进行猪嵴病毒检测，其1．0％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：扩增获得约500bp的条带(图1)，与预期结果相符。图I采集样品的猪嵴病毒检测结果Fig．1RT-PCRdetectionofPKVin10samplesl一10：组织样品；+：阳性对照；M：DL2000DNAMarker1-10：Tissuesamples；+：Positivecontrol；M：DL2000DNAMarker2．2VPl基因的扩增结果以携带猪嵴病毒阳性样品的cDNA为模板，用引物VPl．U／VPl．L扩增VPl基因片段，1．O％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增获得约750bp的条带(图2)，与预期结果相符。2．3VPI基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析结果●一2000bp●—一1000bp●一750bp●—一500bp●一250bp●一100bp图2猪嵴病毒阳性样品的VPI基因扩增结果Fig．2AmplificationofVPlgenefromPKVpositivesamples1：猪嵴病毒阳性样品；2：阴性对照；M：DL2000DNAMarker1：PKVpositivesample；2：Negativecontrol；M：DL2000DNAMarker测序结果表明，猪嵴病毒GXPKV．1毒株VPl基因全长762bp，共编码254个氨基酸。运用DNASTAR软件包@Megalign程序对测序获得的VPl基因序列与从GenBaIll【下载的13株参考毒株VPl基因序列进行核苷酸及其推导氨基酸同源性比对，结果表明，GXP．KV．1毒株VPl基因序列与已公布参考毒株VPj基因间的核苷酸同源性为74．1％一85．4％；其中与JSl419毒株的同源性最高，为85．4％；与已公布参考毒株VPl基因的推导氨基酸同源性为81．1·胁93．3％(表2)。表2猪嵴病毒VPl基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对(％)Tab．2HomologyanalysisonnucleotidesequenceofPKVVPIgeneanditsdeducedaminoacidsequence(％)右上方为核苷酸序列同源性，左下方为氨基酸序列同源性ThehomologyofnucleotidesequenceWaSintheupperrightoftable，thehomologyofdeducedaminoacidsequenceWaSinbottomleftoftable2．4系统发育进化分析结果根据VPl基因推导氨基酸序列进行系统发育进化分析，结果发现GXPKV—l毒株与Gansu一2012、JSl419等参考毒株同处于一个分支(图3)，属于同一亚群，说明其亲缘关系较近；而与瑞士分离株Swine—S一1—2007、泰国分离株THA一2008、美国分离株H24—2012．USA及我国四川分离株CHN．SC一2011—02等相距较远，说明其亲缘关系较远。3讨论本研究中，GXPKV．1毒株VPI基因与GenBank已公布13株参考毒株VPl基因间的核苷酸同源性为74．1％～85．4％，推导氨基酸同源性为81．1％～93．3％，其中与JSl419毒株的同源性最高。该结果表明，虽然猪嵴病毒VPI基因核苷酸变异较大，但由于同义翻译，推导氨基酸同源性仍然较高，即碱基突变并未引起蛋白 4期易春华等：猪嵴病毒VPI基因序列测定与分析·673·15．81412108642ONucleotidesubstitutions(x100)T182-2009-JPJapan-2009K-30．．HUN-2008JY-2010}日jIrIS嘲n晦1-2007烈．2012-HenanCHN-SC-2011-02n*2∞8C■P02_oB-TH^H24_20124,1S^JSl419Ga^su-2012GXPKV-1xx-2012-Henan图3基于VPI基因推导氨基酸序列构建的系统发育进化树Fig．3PhylogenetictreebasedondeducedaminoacidsequenceofVPJgene结构的改变。通过系统发育进化分析，发现GXPKV．1毒株VPI基因与Gansu．2012、JSl419等国内参考毒株同处于一个分支，属于同一亚群，说明其具有相似来源的可能性最大；而与瑞士分离株Swine．S．1．2007、泰国分离株THA一2008、美国分离株H24—2012一USA及四川分离株CHN-SC．2011．02等的亲缘关系较远。猪嵴病毒感染已覆盖亚洲、欧洲及美洲，具有广泛的存在性，但目前国内外针对猪嵴病毒的研究时间较短，毒株的序列测定也仅局限于我国及瑞士、泰国、美国等几个国家，有关毒株具体分群尚无统一结论，导致对毒株来源的确定缺乏有力依据。目前，猪群腹泻病发生是各生猪养殖场(户)遇到的棘手问题，尤其是仔猪腹泻可导致其存活率下降，严重影响生猪养殖业的健康发展(李彬等，2014)。近年来，在对猪群进行疫病诊断分析时发现流行性腹泻、传染性胃肠炎、猪嵴病毒等病混合感染较常见(陈蕾等，2012；梁丹洁，2014)，但当前的研究结果并未找到猪嵴病毒与猪群腹泻间存在必然联系的相关依据，因此还有待在今后的研究中对猪嵴病毒各基因片段的功能及作用进行更系统的生物学特性研究与分析。为了有效解决当前的困境，在开展仔猪腹泻研究中不仅要注意流行性腹泻、传染性胃肠炎等常见病的预防，还应加快对猪嵴病毒等不确定因素的探究，为养殖户提供科学依据。4结论猪嵴病毒GXPKV．1毒株起源于国内流行毒株的传播，在新的环境下虽然其VPJ基因核苷酸发生变异，但由于同义翻译，推导氨基酸同源性仍然较高，说明碱基突变并未引起蛋白结构的改变。参考文献：陈蕾，朱玲，李淞，周远成，徐志文．2012．猪嵴病毒忡J基因的克隆及生物信息学分析[J]．中国兽医科学，42(12)：1254-1258．ChenL，ZhuL，LiS，ZhouYC，XuZW．2012．CloningandbioinformaticsanalysisofporcinekobuvirusVPlproteingene[J]．ChineseVeterinaryScience，42(12)：1254—1258．李彬，刘浩飞，孙冰，茅爱华，杜露平，何孔旺，郭容利，温立斌，张雪寒，倪艳秀，周俊明，吕立新，俞正玉，王小敏，胡屹屹，祝吴丹，于洋．2014．猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PeR方法的建立与应用[J]．江苏农业学报，30(1)：125—129．LiB，LiuHF，SunB，MaoAH，DuLP，HeKW，GuoRL，WenLB，ZhangXH，NiYX，ZhouJM，LnLX，YuZY，WangXM，HuYY，ZhuHD，YuY．2014．DevelopmentandapplicationofTaqMan——basedreal-—timePCRassayfordetectionofporcineepidemicdiarrheavirus[J]．JiangsuJou卜halofAgriculturalSciences．30(1)：125一129．梁丹洁．2014．广西猪嵴病毒的感染状况调查与基因序列分析[D]．南宁：广西大学．LiangDJ．2014．TheepidemicsituationresearchandgenomesequenceanalysisofporcinekobuvirusinGuangxiprovince[DJ．Nanning：GuangxiUniversity．BarryAF，RibeiroJ，AlfieriAF，vanderPoelWH，AlfieriAA．2011．FirstdetectionofkobuvirusinfarmanimalsinBrazilandtIleNetherlands[J]．Infection，GeneticsandEvolution，ll(7)：1811-1814．KhamrinP，ManeekarnN，HidakaS，KishikawaS，UshijimaK，OkitsuS，UshijimaH．2010．Moleculardetectionofkobu—virussequencesinstoolsamplescollectedfromhealthypigsinJapan[J]．Infection，GeneticsandEvolution，’10(7)：950—954．KhamrinP，ManeekarnN，KonggkaewA，KongkaewS。OkitsuS，UshijimaH．2009．Porcinekobuvirusinpiglets，Thailand[J]．EmergingInfectiousDiseases，15(12)：2075—2076．ParkSJ，KimHK，MoonHJ，SongDS，RhoSM，HanJY，NguyenVG，ParkBK．2010．MoleculardetectionofporcinekobuvirusesinpigsinKoreaandtheirassociationwithdi—arrhea[Jj．ArchivesofVirology，155(11)：1803—1811．ReuterG，BoldizsarA，KissI，PankovicsP．2008．CandidatenewspeciesofKobuvirusinporcinehosts[J]．EmergingInfec-tionsDiseases，14(12)：1968—1970．SasakiJ，KushharaY，MaenoY，KobayashiN，YamashitaT，SakaeK，TakedaN，TaniguchiK．2001．ConstructionofaninfectiouseDNAcloneofAichivirus(anewmemberofthefamilyPicomaviridae)andmutationalanalysisofastem—loopstructureatthe5’endofihegenome[J]．JournalofVi-rology，75(17)：8021—8030．YuJM，JinM，ZhangQ，LiHY，LiDD，XuZQ，LiJs，CuiSX，YangSH，LiuN，DuanZJ．2009．Candidateporcinekobuvirus，China[J]．EmergingInfectionsDiseases，15(5)：823—825．(责任编辑兰宗宝)