禽副粘病毒2的基因组序列测定与分析

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1、中国农业大学博士学位论文禽副粘病毒-2的基因组序列测定与分析姓名：杨爱梅申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：赵继勋2002.6.1英文缩写英文全称AmpbpBSAcDNACPEELISAHNkDaNDVntNTNTR0．D．ORFPJVPMV一2RIPArpmRT-PCRRACESDSSDS—PAGESPF缩略词表ampicilinbasepairBovineserumAlbumincomplementaryDNAcel1pathologyeffectenzyme—linkedimmunosorbentassa

2、yhema991utinin—neuraminidasekilodotonNewcast]ediseasevirusnucleotidenutralizationtestNontranslationalregionOpticaldensityopenreadingregionparainfluenzavirusParamyxovirus一2Radioimmunopreciptionassayroundsperminuterevrerse—transcriDtase—polymerasechairlrapidamplif

3、icationofCDNAendSodiumdodecylSUIfateSDS—polyacrylamidegelelectroDhoresiSspecifiCpathogenfree中文全称氨苄青霉素碱基对牛血清白蛋白互补DNA细胞病变酶联免疫吸附试验血凝素一神经氨酸酶千道而顿新城疫病毒核苷酸中和试验非翻译区光密度值开放阅读框架副流感病毒副粘病毒2型放射性免疫沉淀分析转／分钟反转录一聚合酶链式反应互补朱端的快速扩增十_二烷基磺酸钠SDS一聚内稀酰胺凝胶电泳无特定瘸原体摘要在本实验室已对PMV．2的流行病学、致病性、诊

4、断方法、单抗制备等做了大量研究的基础上，本研究将进行PMV．2基因组的部分基因序列测定与分析，从分子水平上对该病毒做进一步的研究。本实验主要完成了下列工作：，(1)收获四株PMV．2jf标准毒株Yucaipa株，进口七彩文鸟F4株、F6株和北京分离株F8株的接毒鸡胚的尿囊液，经差速、超速离心后，利用蔗糖密度梯度离心纯化。分别制备免疫电镜样品、透射电镜样品和病毒蛋白的SDS．PAGE的上样样品。经电镜观察，各毒株形态结构无明显差别，与发表的文献一致，病毒的SDS-PAGE图谱也与报道基本一致，进～步确证了病毒为PMV-2

5、。为以后PMV．2的分子生物学的研究奠定了基础。／，’。(2)提取4株病毒的RNA，经RT-PCR，获得4株毒株的HN基因，同时首次测得F基因与HN基因之间的序列。f序列分析结果表明，HN基因的ORF全长为1743nt，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白。4株毒株的HN基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为99．89％和99．69％。分析F基因与HN基因间序列发现基因间序列与副粘病毒科其他病毒的基因间序列相似，含有基因起始信号和终止信号。但不含3个碱基的连接序列。通过序列分析，进一步证实所测毒株为PMV．2病毒，并在分

6、子水平上进一步证实赵继勋等分离于同一批进I：l七彩文鸟的F4、F6株是抗原性存在差异的两个毒株。毒株间的血清学关系与分子水平的核苷酸序列、氨基酸序列的比较关系一致。夕‘1(3)我们的研究还从分子水平上进一步论证了分离自猕猴的Murayama病毒与Yucaipa病毒有着非常密切的血清学关系，Mumyama病毒可能是Yucaipa病毒或类Yucaipa病毒感染猕猴后的适应株。(4)在HN基因5’端设计步移引物进行反转录。将反转录产物构建质粒文库，通过点杂交及Southern杂交，筛选阳性克隆。测序产物做BLAST比较，并与

7、本科病毒的L基因的核苷酸序列、氨基酸序列进行了比较。进一步证实我们在国际上首次完成了PMV-2标准毒株的L基因3’端的序列测定。(5)用Pfu保真酶扩增HN基因，连接入PTYB．2表达载体，成功进行了原核表达，为制备针对HN蛋白的单抗工作奠定了一定的基础。关键词l禽副粘病毒．2：电镜观察胎SDS．PAGE图谱：基因测序与骨靖；质粒文库；原核表达J1AbstractOnthebaseofalotofworkwehaddone，wewillsequencethegenomeofPMV一2initiallyintheworl

8、dtostudythisvirusonthemolecularlevel．Theworkwehaddoneareasfollows：(1)Yueaipavirus，whichisthestandardstrainofPMV-2，andotherthreeisolatedstrainsinChinawerepropagatedint