传染性法氏囊病毒vp2基因克隆、表达及elisa抗体检测方法建立论文

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1、传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆、表达及ELISA抗体检测方法的建立摘要本研究用RT-PCR技术成功地从鸡传染性法氏囊病毒(mDV)基因组中克隆出IBDVVP2基因，并实现了在大肠杆菌中的高效表达；以纯化的IBDVP2表达抗原为包被抗原，建立了可检测血清IBD抗体的ELISA方法，为传染性法氏囊病基因工程疫苗、快速诊断试剂的研究奠定了基础。用蛋白酶K消化、酚．氯仿抽提法成功提取出IBDV基因组RNA，用RT-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白基因VP2，并将其克隆到pMDl8．T载体。经序列测定，VP2基因全长1356bp，与GenBank中的IBDV超强毒株VP2基因序列同源性达97％以上

2、；将VP2基因插入大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG，获得重组质粒pKG．VP2，再转化入大肠杆菌BL21plysS，经WIG诱导，受体菌E．coilBI_2．1(DE3)plysS能表达结构蛋白基因VP2，经SDS．PAGE及Westernblot分析，表达产物分子量约40KDa，表达量达到菌体总蛋白的10％，且能与IBDV阳性血清发生特异性的免疫反应。以纯化的IBDVVP2表达蛋白作为包被抗原，建立了一种检测血清中mDV抗体的间接ELISA方法。通过对ELISA反应条件的系列测定，确定了各组分的最适工作条件：IBDVVP2表达抗原最适包被浓度为105ng，孔；被检血清的最佳稀释度为1：8

3、0，达到该稀释度时的P／N值最大，阳性与阴性分界最明显；阴阳性临界点OD450值为O．32。根据已建立的ELISA方法及最佳反应条件，检测了890份血清样品，阳性率为92．8％。结果表明，本试验建立的间接．ELISA法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点，将为我国鸡传染性法氏囊病的免疫监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。关键词：传染性法氏囊病毒；重组蛋白VP2；间接．ELISA华中农业大学2006届硕士学位论文ABSTRA(了rThestructuralproteingeneVP2wasamplifiedfromthegenomeofinfectiousbursaldiseas

4、evirus(roDVlbyRT-PCR．TherecombinantVP2proteinwasexpressedeffectivelyinE．cellBL21(DE3)plysS．UsingthepurifiedVP2proteinascoatingantigen，allindirectELISAmethodwassuccessfullydevelopedfordetectionofanti—IBDVantibodywithinseruHl．TheestablishmentofVP2．ELISAprovidedusthebaseofrapiddiagnosticmethod．Aprotei

5、naseKdigestionandphenol-chloroformextractionmethodwasusedtoextractIBDVdsRNAfrombursaeofinfectedchick衄．TheVP2genewasamplifiedbyRT-PCR,andthenclonedintopMDl8一Tvectorforsequenceanalysis．TheresultsofsequenceanalysisshowedthatVP2genehas1356basepait,andthehomologyofnucleotidesequencetowIBDVwas97％．TheVP2g

6、enewassubclonedintotheexpressionvectorpGEX·KGtoconstructpKG-VP2，andthentransformedintoE．coliBL21(DE3)plysS．VP2proteinexpressionwasinducedbyIPTGTheresultsofSDS-PAGEandWesternblotindicatedthattheyieldofVP2proteinwasabout10％oftotalsolubleproteinundertheoptimumexpressioncondition．ThemolecularweightofVP

7、2proteinwasabout40KDa,andithadstrongimmunologicalactivity．UsingthepurifiedVP2proteinexpressedintheE．coliascoatingantigen,allindirectELISAmethodwasdeveloped．Optimizedconditionswereasfollowing．Theconcentratio