鸡传染性法氏囊病毒的vp2基因原核表达及抗原性分析

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1、河北农业大学硕士学位论文鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因原核表达及抗原性分析姓名：单学强申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：高轩；李明义20120526摘要鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起的3～12周龄雏鸡及青年鸡的一种急性、高度接触性免疫抑制传染病。其通过破坏鸡的中枢免疫器官．法氏囊，使免疫器官和免疫活性细胞功能受到严重损伤，从而出现不同的免疫抑制。该病潜伏期较短，发病率高，给我

2、国养禽业造成巨大的经济损失。IBDV可以编码5种病毒蛋白，分别为VPl、VP2、VP3、VP4、VP5。其中VP2为主要的结构蛋白，暴露在核衣壳的外面，并携带有病毒的主要中和性抗原表位，它能诱导宿主产生针对IBDV的中和性抗体，这种抗体能保护易感鸡使其免受IBDV的感染。近年来，由于超强毒株和变异毒株的出现，导致鸡传染性法氏囊病的防治面临巨大的压力。因此，需要开发更加安全、有效的新型疫苗。本课题主要做了以下几个方面的研究：1．从辽宁省周边地区采集疑似鸡传染性法氏囊病病鸡的法氏囊组织。实验室处理后将含有传染性法氏囊病毒的上

3、清液接种至SPF鸡胚绒毛尿囊膜，分离病毒，用琼脂免疫扩散试验进行检测，并结合动物回归试验，初步鉴定分离的毒株为鸡传染性法氏囊病毒强毒株。2．采用SPF鸡胚接种法增殖IBDV病毒，以收集的尿囊液为材料，使用Trizol试剂法提取病毒的总RNA，参照Genebank上发表的传染性法氏囊病毒VP2基因序列设计相应的引物，运用RT-PCR技术对传染性法氏囊病毒的VP2基因进行克隆和测序。将获得的VP2基因序列与Genebank中已经发表的鸡传染性法氏囊病毒毒株VP2基因序列进行比对其同源性高达99％，表明该分离毒株为鸡传染性法氏

4、囊病毒强毒株。3．将得到的目的基因连接到pET28a原核表达载体中，得到重组质粒pET28a．VP2。经过PCR、酶切及测序分析，确定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确，与预期序列相符。再将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)d8，使用IPTG进行诱导表达，表达产物经SDS．PAGE及WesternBlotting分析，分子量大小约为48l(u，且能与IBDV阳性血清发生特异性的免疫反应。4．将得到的融合蛋白与白油佐剂按照适当的比例进行乳化，制备基因工程亚单位疫苗。5．通过攻毒保护试验对传染性法氏囊病毒VP2蛋白

5、基因工程亚单位疫苗的保护效力进行分析，结果表明疫苗的保护效率可以达到80％。关键词：传染性法氏囊病毒；VP2；原核表达；保护效率ProkaryoticexpressionofinfectiousbursaldiseasevirusVP2geneandthestudyofitsAnti-genicityCandidate：ShanXueqiangMajor：PreventiveVeterinaryMedicineAdvisor：GaoXuan；LiMingyiAbstractInfectiousbursaldisease(

6、IBD)，whichusuallyOccursin3．12weeksoldchickenandyoungchicken，isahighlycontagiOUSandsevereimmunosuppressiondiseasecausedbyinfectiousbursaldiseasevirus(IBDV)．111evirusdestroysthebursaofFabricius．1eadingtoseriOtISdamagetootherimmuneorgansandcellsaswellasconsiderablee

7、conomiclossesinpoultryindustries．IBDVcanencodefivekindsofproteins，whichareVP1，vP2，VP3，VP4andVP5respectively．VP2iSthemainstructuralprotein．Itisontheoutsideofnucleocapsidandcarriesthemainneutralityepitope，whichCaninducehosttogenerateneutralityantibodythatwillprotec

8、tchickenfrominfectingbyIBDVInrecentyears，thepreventionofinfectiousbursaldiseasefacetremendouspressureduetotheemergenceofsuperstrainsandvariantstrains．Soweneedt