鸡传染性贫血病毒(ciav)vp2和vp3基因真核表达以与vp2蛋白功能的初步研究

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时间:2019-02-02

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1、摘要本研究采用PCR技术从鸡传染性贫血病毒DNA中扩增出VP2和VP3基因,并将二者分别克隆到pMDlg-Tsimplev∞tor中,经测序证实所克隆的VP2和VP3基因与CIAVCUX.1标准株相同。并将VP2和VP3基因分别亚克隆到真核表达载体pcDNA4.0和pEGFP-N1中,构建了重组真核表达质粒pcDNA4.0一VP2和pEGFP.v1)3。将二者各自转染BHK和293T细胞,经Western-blotting证实,转染的真核细胞能够表达VP2蛋白并具有良好的抗原性;经RT-PCR和荧光观察证实,转染的真核细胞能够表达VP3蛋白.为了分析VP2是否对宿主细胞的增殖有影响,用pc

2、DNA4.0.VP2转染293T和BHK细胞,分别在24h、48h、72h、96h和120h后进行细胞计数,与对照组(空载体转染细胞以及未转染的细胞)相比,VP2的瞬时表达对这2种细胞的增殖没有影响,提示鸡传染性贫血病毒的VP2基因可能不影响宿主细胞的分裂周期。为研究VP2对宿主细胞中转录调控因子NF-‘B活化的影响,将pcDNA4.0一VP2与NF-KB的活化报告质粒pNF-xB—Luc共转染293T和BHK细胞,检测报告基因——荧光素酶基因的表达情况。结果发现,与空载体pcDNA4.0对照组相比,peDNA4.0一VP2组的报告基因荧光素酶的表达显著增高,表明VP2的瞬时表达可以活化转

3、录因子NF.‘B。本研究结果表明,鸡传染性贫血病毒VP2基因表达对293T和BHK细胞的增殖没有影响,但可以激活293T和BHK细胞的转录因子NF—IfB。为进一步研究CIAV的致病机制奠定了基础。关键词:鸡传染性贫血病毒(CIAV);VP2基因;VP3基因:NF.KBAbstractinthisresearch,thevP2andVP3genesWereclonedfromtheCM、,DNAbyPCRandthenw∞insertedintothepMDIS-Tsimplevector.11"resultofDNAsequencingshowedthatthesequenceofVP2

4、andVP3genes骶衅thesame笛thatofCUX-1.1kVP2genewasthensub-clonedintotheeukaryoticexpressionvectorpeDNA4.o'whichWB$examinedbytherestrictedenzymaticanalysisandDNAsequencing.Inthesameway,theVP3genewassub-clonedintotheeukuryoticexpressionvectorpEGFP-N1.andthentheeukaryoticexpressionplasmidscarryingbothVP2a

5、ndVP3geneswerealsoconstructed.耵柠pcDNA4.0·VP2andpEGFP—VP3plasmidswcfeWansfecteAintotheBHKand293TcellsfortheexpressionofVP2andVP3.ByWestern-blotting,theVP2genecanbeexpressedinBHKcelland293TcellsToprobeintotheroleofVP2ineellproliferation.293TandBHKcellsweretrailsfectedwithpcDNA4.0-VP2andexaminedbycou

6、ntingcellsafterTrypanbluestaining.Theresultshowedthatover-expressionofVP2in293TorBHKcellsdidnotenhancethecellproliferationascomparedtothecontrols,whichindicatedtheun-involvementoftheviralVP2iIlcenproliferationanddivisions.BycotransfectionofBHKOr293TcellswithpeDNA4.0-VP2andthepNFxB—Lecplasmids,wefo

7、undthatCIAVVP2activatedtranscriptionfactorNF-xB,whichsuggeststhatVP2mighcbeinvolvedininflammatoryresponsesorapoptoticprocesses.Inconclusion,ourresultssuggestthatVP2genehadnoroleintheproliferationof293TandBHKcells

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