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1、猪圆环病毒ORF2基因和细小病毒VP2基因真核表达载体的构建及鉴定88HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicineNo102009狺国环病毒ORF2基因柏细病毒VP2基因真核表达载体的构建&鉴定康亚男,李潭清,杨润德,韩新影,吕蔚(河北农业大学动物科技学院,保定河北071001)中图分类号:$852.659.2文献标识码:B文章编号:1004—7034(2009)10—0088～03猪圆环病毒2型的ORF2基因编码主要的结构蛋白(cap蛋白).有研究证明ORF2基因与病毒的毒力密切相关.猪细小病毒的VP2基因编码
2、主要衣壳蛋白,VP2蛋白在细小病毒感染过程起着极为重要的作用.临床上经常见到猪圆环病毒与猪细小病毒等多种病原体混合感染的现象,因此试验对猪圆环病毒和猪细小病毒的主要致病性基因进行基因重组并进行表达,摸索构建出一种能够对圆环病毒病与猪细小病毒病同时进行诊断的多价抗原,为临床上能够做出及时,快速,准确的诊断,进而采取有效的措施控制疫病的发生提供依据.1材料与方法1.1材料PK一15细胞,购自中国兽医药品监察所;猪圆环病毒,猪细小病毒,河北农业大学动物科技学院微生物实验室分离,保存;MEM培养基,购自美国Gibco公司;DNA片段凝胶回收试剂盒,Lipofect转染试剂,购
3、自北京天根生物公司;宿主菌大肠杆菌DH5a,pUC19载体,河北农业大学动物科技学院微生物实验室保存;pUCm—T载体,pCDNA3.1(+)载体,河北农业大学动物科技学院遗传育种实验室馈赠;限制性内切酶,rr4连接酶等,购自宝生物工程(大连)有限公司.1.2方法1.2.1病毒基因组的提取按照常规方法对猪圆环病毒2型和猪细小病毒进行基因组的提取,一20c【=保存,备用.1.2.2引物设计根据相关文献中介绍的猪圆环病毒2型ORF2基因扩增,引用了其特异性引物P1,P2(P1中插入HindIli酶切位点,P2中插人BamHI酶切位点),扩增的片段长约709bp;再根据Ge
4、nBank中猪细小病毒VP2(AY583318)全基因序列,利用收稿日期:2008—12—23;修回日期:2009—0728作者简介:康亚男(1983一),女,硕士研究生.通讯作者:杨润德(1950一),女,教授,本科.Primer5.0自行设计1对特异性引物P3,P4,扩增的靶序列长约1773bp.引列序列P15一ATATG—GATCCATGACGTATCCAAGGAGGC一3:P25一TGT—GAAGCTI'rTAGGG,rITI'AAGTGGGGGG一3:P35一GC,rAAAGGGACATCTAAT一3:P45一TATGGT—TC咖AATATGATC一3.引物
5、由宝生物工程(大连)有限公司合成.1.2.3目的基因的扩增以提取猪圆环病毒2型的全基因组作为模板进行ORF2基因的PCR扩增,反应程序:95oI二5rain;9530S,55cC30s,7250S,共35个循环;72cc10rain.同样以猪细小病毒的全基因组作为模板,扩增VP2基因,反应程序:955min,94℃1rain,40℃1min,72℃2rain,共35个循环;72℃10rain.1.2.4PCR产物的克隆鉴定PCR产物用DNA片段凝胶回收试剂盒回收,按照常规方法分别与pUC19,pUCm—T载体进行连接;将连接产物转化DH5a感受态细胞,提取质粒进行酶切
6、鉴定,筛选出阳性重组质粒送北京三博生物技术有限公司进行序列测定.1.2.5重组质粒pCDNA3.1一ORF2,pCDNA3.1一VP2和pCDNA3.1一ORF2一VP2的构建用Hindm和BamHI对pUC19一ORF2和pCDNA3.1(+)载体分别进行双酶切,回收酶切片段4cc连接过夜,转化DH5a感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定.取鉴定方向正确的pUCm—T—VP2质粒和pCDNA3.1(+)载体进行BamHI,EcoRV双酶切,回收片段,22c(=连接过夜,转化DH5ot感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定.将重组质粒pCDNA3.1一ORF2和pUCm—T—V
7、P2进行BamHI,EcoRV双酶切,回收片段,22℃连接,转化DH5cx细胞,提取质粒进行酶切鉴定.1.2.6转染质粒的制备,纯化及浓度的测定采用碱裂解法和聚乙二醇沉淀法大量制备并纯化重组质粒,利用紫外分光光度计测定OD∞和OD踟值,计算质粒浓度.《黑龙江畜牧兽医》科技版2009年10月(上)891.2.7重组质粒的细胞转染转染前一天准备PK一15细胞,采用10%犊牛血清无抗生素培养基,37℃,5%CO常规培养.待细胞贴壁达到50%～75%融合时进行转染,每孔加入4g待转染质粒,具体操作按照Lipofect转染试剂盒使用说明进行.1.2.8转染细胞
