猪圆环病毒2型orf2基因的克隆与序列分析及其真核表达

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1、猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析及其真核表达CloningandsequenceanalysisoftheORF2geneofPCV2anditsexpressionineukaryoticsystem研究生：何乃珠专业：预防兽医学导师：高崧教授扬州大学兽医学院2012年6月何乃珠：猪圆环病毒2型ORF2基冈的范隆1j序列分析及其真核表达1猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析及其真核表达硕士生：何乃珠导师：高崧教授摘要猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，基因组为单股

2、负链环状DNA，是目前发现的最小的动物病毒。分为PCVl和PCV2两个基因型，PCVl无致病性，是猪源细胞系PK一15的污染物，在健康猪体内可检测到PCVl的抗体；PCV2有致病性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post—weaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)、猪皮炎与1肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome，PDNS)及繁殖障碍等的重要病原。PCV2基因组含有两个主要的开放阅读框，其中ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白Cap蛋白，蛋白的分

3、子量大小约为30kD，是病毒的主要结构蛋白，也是PCV2的主要免疫原。尽管两个基因型ORF2基因的同源性达68％左右，但它们刺激机体产生的抗体没有交叉反应，因此ORF2蛋白在诊断及疫苗研究中具有重要意义，是PCV2的研究热点。1．依据从临床断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)死亡猪病料中分离且己进行基因组测序的PCV2(SD一11株)毒株和本实验室保存的PCV2XSC毒株(GenBank登录号为DQl04422)的基因序列，分别设计合成一对引物，用于扩增ORF2全基因，并分别将其克隆到pMDl8-Tsimple载体上，获得重组质粒pM

4、Dl8-T-ORF2，酶切鉴定并测序。将这两株PCV2ORF2序列与GenBank中公布的国内外10个不同毒株的PCV2ORF2核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较并绘制进化树。结果表明，SD．11毒株的ORF2基因与比较的10个毒株的同源性均较低，其中核苷酸同源性在90．2％～93．2％之间，氨基酸同源性在87．6％～94％之间，与美国毒株(GenBank登录号为DQ397521．1)的同源性最高，可达94％，进化树分析发现，该毒株的ORF2基因形成了一个独立的分支，表明该毒株与所比较的10个毒株的亲缘关系较远；XSC毒株与中国分离株0

5、9GDLB(GenBank登录号为HQ395027．1)及韩国分离株C7155(GenBank登录号为FJ905463．1)ORF2的核苷酸及氨基酸同源性较高，均在98．7％以上，进化树分析表明XSC毒株与韩国C7155分离株形成了一个小分支，以上结果说明SD．11毒株及XSC毒株在我国的流行或与种猪的引进有关。将PCV2SD一11毒株及XSC毒株的全基因组、ORFl及ORF2基因分别与不同基因型的PCV参考毒株(PCVl、PCV2a、PCV2b、PCVl／2a、PCV2c)进行比较，结果表明PCV2SD．11毒株与PCV2a(Gen

6、Bank登录号AJ223185)的同源性最高，推测SD一11毒株为PCV2a基因型；XSC毒株的全基因组、ORFl及ORF2基因与PCV2b(GenBank登录号AY9090041毒株的同源性最高，推测XSC毒株为PCV2b基因型。2．根据PCV2a分离株及GenBank公布的PCV2bXSC毒株基因序列，分别设计合成一对引物，对PCV2a和PCV2b毒株的ORF2基因进行PCR扩增。将ORF2基因分别克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMl中，获得重组转移载体pFast—ORF2a及pFast—ORF2b，分别转化含穿梭载体Ba

7、cmid的感受态细胞DHl0Bac，发生转座作用，经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体reBacmid—ORF2a及reBacmid．ORF2b，用脂质体法将重组穿梭载体质粒转染sf9细胞，获得的重组病毒分别命名为reBacmid—ORF2a—Cap及reBacmid—ORF2b—Cap。感染重组杆状病毒的细胞经RT-PCR检测到了PCV2a和PCV2bORF2基因的mRNA；间接免疫荧光检测结果表明，表达的重组蛋白能够被猪抗PCV2高免血清识别；SDS．PAGE与Westernblotting分析均可见大小约为30kD的特

8、异性条带，表明reBacmid．Cap在sf9细胞中成功表达了PCV2a和PCV2b的ORF2蛋白；用终点稀释法、f自J接免疫荧光法及噬斑法测定病毒滴度，并比较各个方法的优缺点，以期找到一种测定重组杆状病毒滴度的较好方法