猪圆环病毒2型orf2截短基因的原核表达及其单克隆抗体的研制和应用

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1、河南农业大学硕士学位论文猪圆环病毒2型ORF2截短基因的原核表达及其单克隆抗体的研制和应用姓名：马攀攀申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王新卫；王川庆201205河南农业大学2012届硕士毕业论文中文摘要本研究根据GenBank中已经发表猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(ORF2)设计一对引物，扩增出去核定位信号的Cap蛋白基因(ORF2截短基因)，按预定的阅读框架插入表达质粒载体pET-32a(+)中，构建重组表达载体pET-32a-ORF2，将重组表达载体导入宿主菌BL21中进行诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)检测，初步证明PCV2Cap

2、蛋白获得了表达，融合蛋白分子量约为42kDa，WesternBlotting分析表明，融合蛋白具有特异的抗原性。将原核表达的可溶性和包涵体两种形式的重组Cap蛋白分别进行纯化，并以纯化的可溶性Cap蛋白和经PEG20000透析浓缩和羞速离心法纯化的PCV2细胞毒分别建立两种用来检测抗PCV2抗体的间接ELlSA方法。经特异性、敏感性试验表明，两种间接ELISA方法均具有很强的特异性、很高的敏感性。以纯化的PCV2细胞毒免疫BALB／cdx鼠，采用以纯化的Cap蛋白和PCV2分别作为包被抗原建立的两种间接ELISA筛选出两株分泌抗PCV2的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为：1．

3、A1、4一H11。这2株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1：204800、1：102400。两株单克隆抗体亚类均为IgG2b。两株杂交瘤细胞分泌抗PCV2单克隆抗体的稳定性实验表明，经过连续传代10代、20代、25代和两次冻存复苏后，分泌抗体的能力基本不变，说明所获得的杂交瘤细胞株分泌抗体的能力稳定。利J羽获得的单克隆抗体(1．A1株)建立了能够特异敏感检测PCV2的双抗体夹,已,ELISA方法，特异性检测显示与猪蓝耳病病毒(PRRsV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪细小病毒(PPV)，猪乙脑病毒(JEV)，猪圆环病毒1型(PCVI)都无交叉反应性；敏感性试

4、验显示对PCV2的最低检出浓度为234．4ng／mL。并应用双抗体夹,L,ELISA方法对实验室保存的病料进行检测，与普通PCR方法的阳性符合率为92．3％。说明建立的夹。L、ELISA方法能够对PCV2抗原进行特异、敏感的检测。关键词：猪圆环病毒2型；ORF2截短基因；原核表达；Cap蛋白；间接ELISA；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA第1页共74页河南农业大学2012届硕士毕业论文第2页共74页河南农业大学2012届硕士毕业论文EXPRESSION0FDRF2TRUNCATEDGENEOFPCV2INPRoKARYOTICCELLSANDPREPARATIoNANDIDE

5、NTmCATIONoFMoNoCLONALANTIBODIESAGAINSTCAPPRoTEINoFPCV2Supervisor：WangXinweiMasterCandidate：MaPanpanAbstract：Basedonthepublishedcapsidproteingene(ORF2)ofPCV2strain，apairofprimersweredesignedandsynthesized．Thecapsid(cap)proteintruncatedthenuclearlocalizationsignalwasamplifiedbypolymerasechainr

6、eaction(PCR)，insertinexpressionplasmidcarderpET一32a(+)inaccordancewithpredeterminedreadingframe，buildingrecombinationexpressionvectorpET一32a—ORF2，thenthevectorwererestructuredintohostbacteriumBL21forexpressionofinduction，Afterwestern-blotidentification，fusionproteinhasspecificbiologicalactiv

7、itieswas42kda．Thetwoformsofrecombinantproteinprokaryoticexpression(solubleCapproteinsandinclusionbodiesofCapprotein)ofprokaryoticexpressionwerepurified，PCV2cytotoxicitybeconcentratedanddialyzedbyPEG．20000andbedifferentialcentrif}tgedtopurifiedPCV2v