猪细小病毒ppvsd1株vp2基因重组腺病毒表达载体的构建

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1、万方数据第39卷第8期2008年8月东北农业大．学学报JournalofN砷∞mA#culturalUniversity39(8)：100-103Aug．2008文章编号1005—9369(2008)08-0100-04猪细小病毒PPV—SDI株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建王金良，沈志强‘，管宇，曲光刚，唐娜(山东省滨州畜牧■医研究院。山东省畜禽用蜂胶疫苗工程技术研究中心，山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600)摘要：通过细酋内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PlⅣ)¨哩基因的重组腺病毒表达栽体。将y忍基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pS

2、hutth—CMV上，并将重组质粒pShutde-CMV／VP2用PineI线性化后转化至携带有腺病毒骨榘栽体pAOF螂一1的大肠杆茵BJ5183感受态细胞，经细茵内同源重组产生重组腺病毒质粒pAaV邺,一VP2。为进一步研究PPV腺病毒活栽体疫苗奠定了基础。关键词：猪细小病毒；VP2基因；重组腺病毒中图分类号：鼹船；$852．65文献标识码：A猪细小病毒(PorcineParvovirus，PPV)属细小病毒科，可引起猪的繁殖障碍病，给世界各国的养猪业造成了巨大经济损失。我国80年代中后期频繁从国外引种，使该病在我国迅速传播。近几年对我国规模化养猪场造成的

3、危害尤为严重，同其它许多病毒病的防治一样，该病也主要以免疫预防为主【11。目前已有10多个国家研制出了PPV疫苗，包括弱毒疫苗与灭活疫苗。尽管PPV的弱毒苗和灭活疫苗在猪细小病毒病的预防控制中起到了十分重要的作用，但是各种疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗发生重组与毒力返强及圆环病毒污染的潜在威胁，灭活疫苗生产细胞不稳定、生产困难、生产成本高等【2】。因此寻找更为安全有效的疫苗一直是猪细小病毒免疫预防研究的主题。现有研究表明，以腺病毒为表达载体的基因工程疫苗具有良好的应用前景，该载体介导的基因具有转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴度高、易于浓缩和贮存等诸

4、多优点【31。’本试验构建了包含PPVVP2基因的腺病毒质粒，为成功研制安全有效的PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。收稿日期：2008-02—18基金项目：山东省自然科学基金项目(Y2005D10)作者简介：王金良(t97s-)，男，黑龙江人，研究实习员，硕士，主要从事动物分子病毒学与免疫学研究工作。+通讯作者E-mail：bzshenzq@sina．coin1材料与方法I．I质粒及菌株腺病毒穿梭载体pShuttle—CMV、腺病毒骨架．载体'pAclEasy一1、DH5a、BJ5183、及携带有PPV、y挖基因的重组质粒pcDNA3．1(+)一VP2由本实

5、验室保存并提供。’1．2工具酶及其它试剂盒。T4DNA连接酶、KpnI、XbaI、砌酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自大连宝生物公司。PmeI、PacI等限制性内切酶购自NEB公司。1．3鉴定引物鉴定引物为构建pcDNA3．1(+)一VP2重组质粒时设计的，由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：iP1：5’-ACAg丛!盟ACCGCAATGGGTGAAAA一3’(含BarnHI酶切位点)iP2：5’一AAGCGGCCGCAGTI’丌：-I'AT兀'ACAGAGT-3’(含NotI酶切位点)’1．4目的基因获得用KpnI、XbaI限制性内切酶双

6、切携带有PPVVP2基因的重组质粒pcDNA3．1(+)-VP2，回收1．8kb的目的片段。1．5重组腺病毒穿梭载体的构建将回收得到的VP2基因与同时用勋nI、XbaI万方数据第8期王金良等：猪细小病毒PPV-SDI株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建·101·限制性内切酶双切的腺病毒pShuttle-CMV载体用3"4DNA连接酶进行连接。按常规方法将连接产物转化DH5tx感受态细胞中，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，进行克隆，提取质粒。采用酶切、PCR等方法进行鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pShume—CM、WP2。1．6重组腺病毒质粒的构建用骨架载体p

7、AdEasy一1转化大肠杆菌BJ5183，制备携带腺病毒骨架载体的感受态菌。将重组穿梭载pShuttle—CMV／VP2用PineI内切酶线性化，转化至含携带腺病毒骨架载体的感受态菌BJ5183。取适量的细胞涂入含50nag·mL_卡那霉素的培养皿中，于37℃培养16～20h，挑选卡那抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0．8％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析及PacI酶切图谱分析。将所得的重组腺病毒质粒以上述同样条件电转入宿主菌DH5n,，在此宿主菌内可获得大量高质量的质粒，挑选目的克隆，命名为pAdEasy—VP2。2结果与分析2．1VP2基因的获得酶切产物经1

8、％琼脂糖凝胶电泳分析表明，切出了与y挖基因相应的约1