人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

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1、人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备【摘要】目的：利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素（canstatin）重组腺病毒载体，扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：PCR法扩增canstatin全长基因，克隆至pGEMT载体，经酶切和测序证实后，亚克隆到穿梭质粒pAd5CMV中，获得穿梭质粒pAd5CMV/canstatin.用PacI酶单独酶切穿梭质粒pAd5CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体，采用标准的磷

2、酸钙方法共转染HEK293细胞.7~10d后收获细胞裂解物，在HEK293细胞中扩增，病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后，分光光度计检测重组病毒滴度.结果：测序证实pEGMT/canstatin基因片段与GenBank公布的canstatin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论：成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒，为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.【关键词】

3、腺病毒载体；血管能抑素；绿色荧光蛋白质类0引言自Folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”概念以来，肿瘤的抗血管治疗一直受到人们的重视.近年的研究［1-2］认为，通过上调抑血管生成因子表达或/和下调促血管形成因子的表达，均可抑制肿瘤血管的新生，从而达到抑制肿瘤生长的目的.目前临床上已有数种抑制新生血管形成的药物用于抗肿瘤治疗，还有许多类似药物处于基础研究之中，并已显示出良好的应用前景［3-4］.血管能抑素(canstatin)是继血管生成抑素(angiostatin)和内皮抑素(endosta

4、tin)之后，最新发现的于血管基底膜Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制因子.但利用腺病毒研究其抑制血管的研究报道国内外尚少见.本研究克隆canstatin基因序列，并利用我们经过改良的腺病毒载体构建方法，构建表达canstatin基因的腺病毒载体，为进一步研究其抗肿瘤作用提供依据.1材料和方法1.1材料限制性内切酶：SalⅠ，SpeⅠ，EcoRⅠ，ClaⅠ，XhoⅠ，PacⅠ和T4连接酶(美国Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(大连TaKaRa公司);DNAladdermarker(西安Hybigen公司);

5、IPTG，XGal(上海Sangon公司)；pGEMT试剂盒(美国Promega公司);质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海AXYGEN公司);人cDNA文库和宿主菌E.coliDH10B由陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室保存；凝胶图像分析仪(上海复日科技公司);高速离心机(美国Beckman公司);荧光显微镜及显微荧光摄影系统(德国Zeiss公司).引物序列:Forin,94℃30s，55℃30s，72℃60s，72℃10min，其中PCR共30个循环.取上述PCR产物20μL在10g/L琼脂

6、糖凝胶上电泳，回收700bp的目的基因.回收产物以4∶1的比例连接入pGEMT载体，22℃过夜.转化E.coliDH10B大肠杆菌，在Amp+LB平板上37℃培养12~14h，挑取阳性克隆，加入5mL含Amp的LB培养基中37℃摇菌16~18h.收集菌液并提取质粒，EcoRⅠ酶切，电泳鉴定正确后，选一单克隆送公司测序，命名为pGEMT/canstatin.1.2.2穿梭质粒载体的构建将pGEMT/canstatin质粒DNA用ClaⅠ和SpeⅠ双酶切，连接到使用同样酶切的带有绿色荧光蛋白（eGFP）荧光的

7、穿梭质粒pAd5CMV中，转化DH10B,Amp+LB平板筛选、挑取阳性克隆、摇菌16~18h后提取质粒，XhoⅠ和SalⅠ酶切鉴定，构建成转移载体pAd5CMV/canstatin.酶切鉴定后，过柱法中提质粒，200μLddH2O溶解并定量.1.2.3腺病毒的重组、扩增和滴度测定穿梭质粒载体pAd5CMV/canstatin经PacⅠ酶切使其线性化后，与同样用PacⅠ酶切的腺病毒骨架载体采用磷酸钙法共转染HEK293细胞.2d后用荧光显微镜观察，7～10d后收集细胞，离心沉淀后，在37℃和-80℃反复冻

8、融3次，4℃,2500g离心10min，收集病毒上清，再次使用上清感染HEK293细胞以扩增重组病毒、氯化铯密度梯度离心纯化，分光光度计检测重组病毒含量.2结果2.1目的片段的克隆和鉴定PCR扩增产物在琼脂糖凝胶700bp左右显示为1条带，与canstatin基因预计大小(含酶切位点)一致(图1).纯化的PCR产物克隆到载体后经EcoRⅠ酶切，琼脂糖电泳上可见1号，3号，6号克隆在78