乙肝病毒x基因重组腺病毒载体的构建

《乙肝病毒x基因重组腺病毒载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建作者：史震，李向阳，周峰，李金龙，尤红娟，汤仁仙【摘要】目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系，构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统，首先从质粒pCDNA3.l-HBx中酶切得到HBx基因，插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，得到pAdTrack-CMV-HBx，将其PmeⅠ酶切线性化后，转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中，通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd-HBx，经PacⅠ酶切线性化

2、后转染人胚肾293细胞，产生重组腺病毒颗粒Ad-HBx。结果PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad-HBx构建成功，在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体，为后续研究奠定了基础。【关键词】乙型肝炎病毒;HBx基因;腺病毒载体　　Abstract:ObjectiveToestablisharecombinantadenovirusvectorcarryingHBxgenesoastoexploretherelationshipbetweenHBxge

3、neandthepathogenesisofhepatocellularcarcinoma.MethodsByusingAdEasyTMadenovirusvectorsystem,arecombinedshuttlevectorwasconstructedthroughthecloneofHBxgeneintopAdTrack-CMV,thenthevector7pAdTrack-CMV-HBxwaslinearizedusingPmeⅠandtransformedintoBJ5183cellwi

4、thpAdEasy-1togeneraterecombinedadenovirusplasmidpAd-HBxthroughelectroporation.Subsequently,theplasmidwaslinearizedwithPacⅠandtransfectedinto293cellstopackintorecombinedadenovirusAd-HBx.ResultsPCR,DNAsequenceandrestrictionendonucleasedigestionanalysisin

5、dicatedthattherecombinedadenovirusvectorAd-HBxcarryingHBxgenehadbeensuccessfullyconstructed.Greenfluorescentprotein(GFP)wasobservedunderthefluorescentmicroscope.ConclusionArecombinantadenovirusvectorcontainingHBxgenewassuccessfullyconstructedandlaidbas

6、isforsubsequentstudies.　　Keywords：hepatitisBvirus;HBxgene;adenovirusvector　　原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染与HCC的发生密切相关，而HBVX基因编码的HBx蛋白在HBV相关性肝癌发生发展中起关键作用[1]。本实验采用pAdEasyTM重组腺病毒系统，构建HBx基因重组腺病毒载体(Ad-HBx)，为进一步研究HBx基因对肝癌发展的影响提供可靠的基因转移工具。

7、7　　1材料和方法　　1.1材料真核表达载体质粒pCDNA3.l-HBx由本实验室构建并保存[2]，pAdTrack-CMV腺病毒质粒、含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌、人胚肾293细胞株及空白对照腺病毒Ad由徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心胡书群博士惠赠。PmeⅠ酶、PacⅠ酶购自NEB，其余限制性核酸内切酶及T4DNA连接酶、PCR试剂盒、质粒DNA回收纯化试剂盒为美国Promega公司产品，Effectence转染试剂盒为德国Qiagene公司产品。　　1.2方

8、法　　1.2.1pAdTrack-CMV-HBx重组穿梭质粒的构建用HindⅢ和EcoRⅤ双酶切pcDNA3.1-HBx，获取HBx基因，克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV(同样HindⅢ/EcoRⅤ双酶切)中。得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx。经PCR、酶切验证后送invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司测序。　　1.2.2pAdTrack-CMV-HBX与pAdEasy的同源重组将正确重组的穿梭质粒pAdTrack-CMV-HB