人SCL基因重组腺病毒表达载体的构建

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1、-摘要目的：构建含人SCL基因的pDC315-SCL重组腺病毒载体,为下一步研究SCL基因在ICC样细胞的功能奠定基础。方法：从含有人SCL基因的质粒中，采用PCR方法扩增SCL基因，将目的载体pDC315-EGFP进行酶切后交换，其产物转化细菌感受态细胞，对克隆产物进行菌落PCR鉴定，对阳性克隆产物进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的重组穿梭质粒。pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞，包装产生复制缺陷型重组

2、腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增，纯化后测定病毒滴度。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率。结果：PCR扩增的SCL基因片段长度为1036bp，测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭质粒真核表达载体中。pDC315-SCL重组腺病毒载体通过PCR结果证明和WesternBlot检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功，滴度达到1×1010PFU/mL，对膀胱Cajal样间质细胞的

3、转染率可达95%。结论：成功构建了含人SCL基因真核表达载体pDC315-EGFP-SCL和应用AdMax载体系统成功构建含人SCL基因重组腺病毒载体pDC315-SCL。pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很高的转染效率。关键词：人SCL基因；pDC315-EGFP真核表达载体；PCR；重组腺病毒载体；转染论文类型：A（应用研究）I---AbstractPurpose:RecombinantadenovirusvectorofhumanSCLgenepDC315-SCLwascon

4、structedinordertoresearchSCLgenefunctioninICC-likecellsinhighsugarenvironment.Methods:FromcontainingpurposeoftheSCLgeneofplasmid,UsingPCRmethodforthepurposeoftheSCLgene,theaimvectorpDC315-EGFPtocutwithenzymescarrythroughswitching,theproducttranslateintoth

5、ecellaboutfeelingofstatesbacteria.TogrowingofthebacterialcolonycarryouttoidentifythroughthePCR,thePCRpositiveidentifyoftheclonesneedtoanalysisandsequencing,asequenceofanalysisiscorrect,cloningisasuccessforcontainingpurposeoftheplasmidoftheSCLgene.HEK293ce

6、llswereco-transectedwiththeconstructedrecombinantshuttleplasmidpDC315-EGFP/SCLandlargeadenovirushelperplasmidpBHGlox(delta)E1,3Creinmediationofliposome.Theobtainedreplication-defectiverecombinantadenoviruspDC315-SCLwaspropagatedinHEK293cells,purifiedpDC31

7、5-SCLplasmidanddeterminedforvirustiter.ThedistributionandefficiencyofrecombinantadenovirusmediatedhSCLwasobservedbyexpressionofgreenfluorescenceprotein(GFP)underthefluorescentmicroscope.Results:ThelengthofspecificfragmentamplifiedbyPCRwas1036bp,therecombi

8、nantplasmidpDC315-EGFP-SCLshowedtwocorrectbandsbythePCRpositiveidentifyoftheclonesandsequencingresultswereexpected,suggestingthatSCLgenehadbeenclonedintopDC315-EGFPvector.PCRanalysisandWesternBlotinspectionconfirmed