人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备的论文

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1、人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备的论文【摘要】目的：利用hek293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素（canstatin）重组腺病毒载体，扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：pcr法扩增canstatin全长基因，克隆至pgemt载体，经酶切和测序证实后，亚克隆到穿梭质粒pad5cmv中，获得穿梭质粒pad5cmv/canstatin.用paci酶单独酶切穿梭质粒pad5cmv/canstatin和腺病毒e3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载

2、体，采用标准的磷酸钙方法共转染hek293细胞.7~10d后收获细胞裂解物，在hek293细胞中扩增，病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后，分光光度计检测重组病毒滴度.结果：测序证实pegmt/canstatin基因片段与genbank公布的canstatin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/l).结论：成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒，为研究该基因在肿瘤治疗中的

3、作用奠定了基础.【关键词】腺病毒载体；血管能抑素；绿色荧光蛋白质类0引言自folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”概念以来，肿瘤的抗血管治疗一直受到人们的重视.近年的研究［1-2］认为，通过上调抑血管生成因子表达或/和下调促血管形成因子的表达，均可抑制肿瘤血管的新生，从而达到抑制肿瘤生长的目的.目前临床上已有数种抑制新生血管形成的药物用于抗肿瘤治疗，还有许多类似药物处于基础研究之中，并已显示出良好的应用前景［3-4］.血管能抑素(canstatin)是继血管生成抑素(angiost

4、atin)和内皮抑素(endostatin)之后，最新发现的来源于血管基底膜ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制因子.但利用腺病毒研究其抑制血管的研究报道国内外尚少见.本研究克隆canstatin基因序列，并利用我们经过改良的腺病毒载体构建方法，构建表达canstatin基因的腺病毒载体，为进一步研究其抗肿瘤作用提供依据.1材料和方法1.1材料限制性内切酶：salⅰ，speⅰ，ecorⅰ，claⅰ，xhoⅰ，pacⅰ和t4连接酶(美国fermentas公司);taqdna聚合酶(大连takara公司);dnal

5、addermarker(西安hybigen公司);iptg，xgal(上海sangon公司)；pgemt试剂盒(美国promega公司);质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海axygen公司);人cdna文库和宿主菌e.colidh10b由陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室保存；凝胶图像分析仪(上海复日科技公司);高速离心机(美国beckman公司);荧光显微镜及显微荧光摄影系统(德国zeiss公司).引物序列:forin,94℃30s，55℃30s，72℃60s，72℃10min，其中

6、pcr共30个循环.取上述pcr产物20μl在10g/l琼脂糖凝胶上电泳，回收700bp的目的基因.回收产物以4∶1的比例连接入pgemt载体，22℃过夜.转化e.colidh10b大肠杆菌，在amp+lb平板上37℃培养12~14h，挑取阳性克隆，加入5ml含amp的lb培养基中37℃摇菌16~18h.收集菌液并提取质粒，ecorⅰ酶切，电泳鉴定正确后，选一单克隆送公司测序，命名为pgemt/canstatin.1.2.2穿梭质粒载体的构建将pgemt/canstatin质粒dna用claⅰ和

7、speⅰ双酶切，连接到使用同样酶切的带有绿色荧光蛋白（egfp）荧光的穿梭质粒pad5cmv中，转化dh10b,amp+lb平板筛选、挑取阳性克隆、摇菌16~18h后提取质粒，xhoⅰ和salⅰ酶切鉴定，构建成转移载体pad5cmv/canstatin.酶切鉴定后，过柱法中提质粒，200μlddh2o溶解并定量.1.2.3腺病毒的重组、扩增和滴度测定穿梭质粒载体pad5cmv/canstatin经pacⅰ酶切使其线性化后，与同样用pacⅰ酶切的腺病毒骨架载体采用磷酸钙法共转染hek293细胞.2

8、d后用荧光显微镜观察，7～10d后收集细胞，离心沉淀后，在37℃和-80℃反复冻融3次，4℃,2500g离心10min，收集病毒上清，再次使用上清感染hek293细胞以扩增重组病毒、氯化铯密度梯度离心纯化，分光光度计检测重组病毒含量.2结果2.1目的片段的克隆和鉴定pcr扩增产物在琼脂糖凝胶700bp左右显示为1条带，与canstatin基因预计大小(含酶切位点)一致(图1).纯化的pcr产物克隆到载体后经ecorⅰ酶切，琼脂糖电泳上可见1号，3号，6号