人白介素24基因重组腺病毒载体构建及鉴定

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1、人白介素24基因重组腺病毒载体构建及鉴定【摘要】目的构建含有人白介素24（hIL-24）基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组，通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A细胞以包装并扩增病毒。采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达，病毒滴度达107pf

2、u/ml。结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。【关键词】hIL-24；腺病毒；病理性瘢痕TheconstructionandIdentificationofRecombinantAdenovirusVectorofhIL-24LIANGJie,HEHai-tianPENGZhi,etal.DepartmentofPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,Guangdong

3、ProvinceChina【Abstract】ObjectiveToconstructandidentifytherecombinantadenovirusvectorofhumanIL-24geneforfuturegenetherapyofpathologicalscartissue.10MethodsThehumanIL-24genefragmentwasclonedintotheshuttleplasmidpAdTrack-CMVtoformthetransfervectorbythemethodo

4、fhomogenousrecombinationinbacteriaofPAdEasysystem.Thentherightrecombinantadenoviruswastransfectedinto293AcellsusingLipofectine2000.Therecombinantadenovirusvectorwasidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandpolymerasechainreaction(PCR).ResultsRestrictionendo

5、nucleaseandPCRanalysisconfirmedthatthehumanIL-24genewassuccessfullyinsertedintotheadenovirusvector.Thetiteroftherecombinantadenoviruswas107pfu/ml.ConclusionTherecombinantadenovirusvectorofhIL-24wassuccessfullyconstructedwithhighlyinfection.【Keywords】HumanI

6、L-24gene;Adenovirus;Pathologicalscar10人白介素24基因（hIL-24）是一种肿瘤抑制基因，通过多种途径抑制、诱导、细胞的生长，对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，并且具有调节免疫系统的功能，是当今人们研究的热点[1]。目前已经在多种肿瘤如前列腺癌、肺癌等的肿瘤基因治疗方面取得实验成功[2]。近年来许多研究表明病理性瘢痕的形成与细胞周期蛋白、细胞因子、癌基因等密切相关。然而hIL-24基因与病理性瘢痕的关系尚未见报道。我们过往的研究表明hIL-24基因在

7、增生性瘢痕内的表达水平与正常皮肤组、普通瘢痕组的相比较明显降低，提示hIL-24基因在增生性瘢痕的形成过程中起着重要作用，可能与IL-24基因在组织中的表达低下有关[3]。本实验拟构建含有hIL-24基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究做基础。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂：PmeI、PacI、BglⅡ及XhoI购自NEB公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒及PCR产物

8、回收试剂盒购自Takara公司；DMEM培养基及胎牛血清购自Hyclone公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。1.1.2菌株、质粒和细胞株：pAdtrack-CMV、AdEasy-1及菌种BJ5183（AdEasier-1细菌）购自Stratrgene公司；DH5a、293A细胞由本研究所保存。1.2方法主要参照文献[4-5]操作。101.2.1目的基因的获取采用Trizol总RNA