多药耐药基因-腺病毒重组表达载体构建及鉴定

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1、多药耐药基因-腺病毒重组表达载体构建及鉴定【摘要】目的构建多药耐药（multidrugresistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。【关键词】多药耐药基因；腺病毒载体；转染Constructionandidenti

2、ficationofmulti-drugresistancegene-adenovirusrecombinantexpressionvectorLIUYu-xia,CHENJun,YUHong．JilinProvincialInstituteofCancerResearch,Changchun130012,China【Abstract】ObjectiveConstructionofmulti-drugresistancegene(MDR)-adenoviralrecombinantexpressionvector．M

3、ethodsMDR1genewillbeinsertedintotheadenovirusvector，bycalciumphosphateprecipitationmethodtherecombinantplasmidtransfectinto293cells．Recombinantvirus8suspensionismadeandinfecedtargetcellsandtoindentify．ResultsConstructedMDR1-adenovirusvectorproducesalargenumberi

4、n293cells，thevirustiterisupto109PFU/ml．AftertherecombinantvirusinfectedtargetcellsinthetargetcellshavetheexpressionofMDR1gene．ConclusionMDR1-recombinantadenorirusvectorhasbeensuccessfullyconstructcd．【Keywords】Multi-drugresistancegene(MDR1)；Adenovirusvector；Tran

5、sfection多药耐药性（multidrugresistance，MDR）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。肿瘤组织多药耐药性的产生主要是由于肿瘤细胞内多药耐药基因（MDR1）异常扩增和过渡表达所致，表达产物为分子量170kd的糖蛋白（P-glycoprotein，P-GP）。该蛋白作为一种依赖ATP能量的大分子药物或毒物的溢出泵，可把进入细胞内的药物或异物排出细胞外，使肿瘤细胞产生耐药。利用MDR1的这一特性，本研究使用腺病毒作为载体，构建MDR1基因-腺病毒重组表达载体，并转导入

6、脐血有核细胞，对此重组载体转染靶细胞的有效性进行鉴定。1材料与方法81．1材料PHAMDR质粒,美国国立健康研究院GreegarD．Odegaarden博士惠赠；腺病毒载体试剂盒,DNA修平试剂盒，粘粒载体，TaKaRa公司；RPMI1640,GIBCO公司；FCS，TBD公司；DNA纯化/回收试剂盒，北京鼎国；MDR1包装试剂盒，Novagen公司。HEK293细胞，感受态大肠杆菌DH5α，由吉林省肿瘤防治研究所保存。1．2MDR1的体外扩增将PHAMDR质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α[1]，并将此感受态细菌接种

7、到含氨苄(50μg/ml)的LB培养基中筛选阳性克隆进行扩增，用碱裂解法提取PHAMDR质粒DNA[2]。1．3扩增的PHAMDR质粒的鉴定及回收1．3．1PHAMDR质粒的鉴定将提取的质粒DNA沉淀溶解后用XholI和SacII进行双酶切，然后将质粒DNA及过夜双酶切的质粒DNA同时用0．8%的琼脂糖进行电泳，鉴定MDR1基因扩增效果，结果见图1、2。1．3．2MDR的回收将电泳所见4．5kb附近的泳带切回,按DNA回收试剂盒说明进行回收，将回收的DNA贮存于-20℃冰箱。1．4MDR1-腺病毒重组表达载体的构建将

8、回收的MDR1基因用DNA修平试剂盒修平后（DNA-TPC），与粘粒载体(CosmidDNA)进行连接，用磷酸钙共沉淀法将Cosmid8DNA和DNA-TPC转染到293细胞，2周左右在一些培养孔内可以观察到细胞的病变和死亡，转移这些已经完全死亡培养孔的培养液（含死细胞）到一个消毒的1．5ml的离心管中，反复冻融6次后，5000r/min离心5