人ctla4ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

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1、人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定【摘要】目的：用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒，以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法：双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig，构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackCTLA4Ig；经酶切线性化后的pAdTrackCTLA4Ig与AdEasy1进行同源重组，经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果：卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAdCTL

2、A4Ig,PacⅠ酶切产生30kb和4.5kb2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光，收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒（病毒滴度为1.6×109）.结论：成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体，为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.【关键词】CTLA4Ig基因；腺病毒科；遗传工程　　【Abstract】AIM:Toconstructrebinantadenovirusvectorcarryingthehumancytotoxiclym

3、phocyteantigen4immunoglobulin(CTLA4Ig)geneandamplifytheadenovirusvectorinHEK293cells,andthentoinfectdendriticcellstoblockthesubmissionofantigenfromdendriticcellstoTlymphocytes.METHODS:CTLA4IggeneesitepCDM8CTLA4Igvector,thensubclonedintotheshuttlepla

4、smidpAdTrackCMVafterdigestedbythesameenzyme.TherebinantplasmidpAdTrackCTLA4IglinearizedbyPmeI,icallytransfectedintoE.coliBJ5183cellsthathadbeenchemicallytransfectedidpAdEasy1.Finally,thelinearizedrebinantplasmidycinresistenceandconfirmedbyPacI.Ther

5、estrictiveendonucleaseanalysisconfirmedthatcorrectrebinantadenovirusplasmidentsphocyteantigen4immunoglobulin,CTLA4Ig），与树突状细胞表面分子B7结合，即可阻断T细胞表面分子CD28与B7结合，降低T细胞的活化，则可能阻断过敏反应产生.本研究拟构建可转染树突状细胞的表达CTLA4Ig的腺病毒体系［2-3］.　　1材料和方法　　1.1材料　　质粒pCDM8CTLA4Ig(HindⅢ,

6、XbaⅠ)（第三军医大学烧伤外科研究所罗高兴博士惠赠），穿梭质粒pAdTrackCMV及骨架质粒pAdEasy1（芝加哥大学TC.He博士惠赠），大肠杆菌BJ5183、DH5α（重庆医科大学病毒性肝炎研究所），PCR试剂盒,DNALigationKit试剂盒、限制性内切酶HindⅢ,XbaⅠ,Trizol试剂、小量质粒提取试剂盒,DNA片断纯化试剂盒（TaKaRa公司），限制性内切酶PacⅠ,PmeⅠ（NEB公司），LipofectamineTM2000（Invitrogen公司），PCR引

7、物由上海鼎安生物技术有限公司合成，CTLA4Ig引物序列为上游：5′ATGGGTGTACTGCTCACACAG3′；下游为：5′TCATTTACCCGGAGACAGG3′.　　1.2方法［4］　　1.2.1双酶切法质粒pCDM8CTLA4Ig被在大肠杆菌中扩增后，以HindⅢ和XbaⅠ双酶切获与理论片断相符的CTLA4Ig片断，用凝胶回收试剂盒回收；腺病毒穿梭质粒载体pAdTrackCMV被HindⅢ和XbaⅠ双酶切后呈开环状，在16℃下与回收的CTLA4Ig片断经DNALigationKi

8、t连接.连接后产物被转化至大肠杆菌DH5α，提取的质粒pAdTrackCTLA4Ig以HindⅢ和XbaⅠ双酶切后鉴定.　　1.2.2转化将骨架质粒pAdEasy1转化至BJ5183,并制备BJAdEasy1的感受态，经PmeⅠ单酶切的pAdTrackCTLA4Ig加入BJAdEasy1感受态进行转化，提取的质粒经PacI单酶切鉴定.　　1.2.3转染、包装　　1.2.3.1HEK293细胞的培养HEK293（人胚肾）细胞于含100mL/L胎牛血清的1640培养基，37℃,50mL