医学毕业论文人ctla4ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

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1、人CTLA4IS基因重组腺病毒载体的构建及鉴定姓名：2014年6月25日人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定【摘要】目的：用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒，以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法：双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackCTLA4Ig；经酶切线性化后的pAdTrackCTLA41g与AdEasy1进行同源重组，经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果：卡那霉素抗性筛选和PacI酶切确证重组腺病毒质粒pAdCTLA4I

2、g,PacI酶切产生30kb和4.5kb2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光，收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6x109).结论：成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体，为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.【关键词】CTLA4Ig基因；腺病毒科；遗传T程【Abstract】AIM:Toconstructrecombinantadenovirusvectorcarryingthehumancytotoxiclymphocyteantigen4immunoglobulin(CTLA41

3、g)geneandamplifytheadenovirusvectorinHEK293cells，andthentoinfectdendriticcellstoblockthesubmissionofantigenfromdendriticcellstoTlymphocytes.METHODS:CTLA4IggenewiththesuitableenzymesitewasdoubledigestedwithrestrictiveendonucleasesHindlllandXbalfrompCDM8CTLA4Igvector，thensubclonedintot

4、heshuttleplasmidpAdTrackCMVafterdigestedbythesameenzyme.TherecombinantplasmidpAdTrackCTLA4IglinearizedbyPmel，waschemicallytransfectedintoE.coliBJ5183cellsthathadbeenchemicallytransfectedwithadenovirusbackboneplasmidpAdEasy1.Finally，thelinearizedrecombinantplasmidwastransfectedintoHEK

5、293cells.RESULTS:RecombinantswereselectedbykanamycinresistenceandconfirmedbyPad.Therestrictiveendonucleaseanalysisconfirmedthatcorrectrecombinantadenovirusplasmidwasconstructed(30kband4.5kbfragmentsweredotainedafterPacldigestion).Twentyfourhoursaftertransfection，thefluorescencewasobs

6、ervedin293cells，andviraltitewascheckedbyGFP(1.6x109).CONCLUSION:TherecombinantadenoviralvectorcontainingCTLA4Iggenehasbeensuccessfullyconstructed,whichoffersabasisforthegenetherapyofCTLA4Iginfectingthedentriticcells.【Keywords】CTLA4Ig;adenoviridae;geneticengineering0引言近年来食物过敏的患病率逐年上升，

7、治疗食物过敏唯一有效的措施是严格避免特定食物抗原的摄入.然而，引起婴儿过敏的食物往往是婴儿食物的主要来源，严格的食物回避可造成婴幼儿营养不良.因此，预防和治疗是研究食物过敏的两个重要方向.食物过敏的发生机制主要是食物抗原到达肠黏膜经树突状细胞递呈至T细胞导致局部T细胞活化.T细胞的活化是第一信号（TCR/MHCAg）及辅助刺激信号共同作用的结果，肠道黏膜内T细胞的异常活化导致特异性IgE产生增多[1].目前食物过敏治疗方法研究包括经典的治疗方法、重组蛋白突变免疫疗法、抗IgE抗体疗法以及基因疗法等，S的均为减少特异性IgE的产生，但并未阻断过敏反应产生.如果能中

8、断食物抗原在肠道树突状细