人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备论文

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1、人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备论文齐宗利李慧瑾王东阳赵俊丽边晔冯真真蒋羽清郑晓晶夏海滨【摘要】目的：利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素（canstatin）重组腺病毒载体，扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：PCR法扩增canstatin全长基因，克隆至pGEMT载体，经酶切和测序证实后，亚克隆到穿梭质粒pAd5CMV中，获得穿梭质粒pAd5CMV/canstatin.用PacI酶单独酶切穿梭质粒pAd5CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体，采用标准的磷酸钙

2、方法共转染HEK293细胞.7~10d后收获细胞裂解物，在HEK293细胞中扩增.freelan提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”概念以来，肿瘤的抗血管治疗一直受到人们的重视.近年的研究［1-2］认为，通过上调抑血管生成因子表达或/和下调促血管形成因子的表达，均可抑制肿瘤血管的新生，从而达到抑制肿瘤生长的目的.目前临床上已有数种抑制新生血管形成的药物用于抗肿瘤治疗，还有许多类似药物处于基础研究之中，并已显示出良好的应用前景［3-4］.血管能抑素(canstatin)是继血管生成抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)之后，最新发现的来

3、源于血管基底膜Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制因子.但利用腺病毒研究其抑制血管的研究报道国内外尚少见.本研究克隆canstatin基因序列，并利用我们经过改良的腺病毒载体构建方法，构建表达canstatin基因的腺病毒载体，为进一步研究其抗肿瘤作用提供依据.1材料和方法1.1材料限制性内切酶：SalⅠ，SpeⅠ，EcoRⅠ，ClaⅠ，XhoⅠ，PacⅠ和T4连接酶(美国Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(大连TaKaRa公司);DNAladdermarker(西安Hybigen公司);IPTG，XGal(上海Sangon公司)；pGEMT试剂盒(美国Promeg

4、a公司);质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海AXYGEN公司);人cDNA文库和宿主菌E.coliDH10B由陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室保存；凝胶图像分析仪(上海复日科技公司);高速离心机(美国Beckman公司);荧光显微镜及显微荧光摄影系统(德国Zeiss公司).引物序列:Forin,94℃30s，55℃30s，72℃60s，72℃10min，其中PCR共30个循环.取上述PCR产物20μL在10g/L琼脂糖凝胶上电泳，回收700bp的目的基因.回收产物以4∶1的比例连接入pGEMT载体，22℃过夜.转化E.coliDH10B大肠杆菌，在Amp

5、+LB平板上37℃培养12~14h，挑取阳性克隆，加入5mL含Amp的LB培养基中37℃摇菌16~18h.收集菌液并提取质粒，EcoRⅠ酶切，电泳鉴定正确后，选一单克隆送公司测序，命名为pGEMT/canstatin.1.2.2穿梭质粒载体的构建将pGEMT/canstatin质粒DNA用ClaⅠ和SpeⅠ双酶切，连接到使用同样酶切的带有绿色荧光蛋白（eGFP）荧光的穿梭质粒pAd5CMV中，转化DH10B,Amp+LB平板筛选、挑取阳性克隆、摇菌16~18h后提取质粒，XhoⅠ和SalⅠ酶切鉴定，构建成转移载体pAd5CMV/canstatin.酶切鉴定后，过

6、柱法中提质粒，200μLddH2O溶解并定量.1.2.3腺病毒的重组、扩增和滴度测定穿梭质粒载体pAd5CMV/canstatin经PacⅠ酶切使其线性化后，与同样用PacⅠ酶切的腺病毒骨架载体采用磷酸钙法共转染HEK293细胞.2d后用荧光显微镜观察，7～10d后收集细胞，离心沉淀后，在37℃和-80℃反复冻融3次，4℃,2500g离心10min，收集病毒上清，再次使用上清感染HEK293细胞以扩增重组病毒、氯化铯密度梯度离心纯化，分光光度计检测重组病毒含量.2结果2.1目的片段的克隆和鉴定PCR扩增产物在琼脂糖凝胶700bp左右显示为1条带，与canstatin基

7、因预计大小(含酶切位点)一致(图1).纯化的PCR产物克隆到载体后经EcoRⅠ酶切，琼脂糖电泳上可见1号，3号，6号克隆在780bp处有一条带(图2).阳性克隆的3号质粒DNA经测序，得到的基因序列与已发表的人canstatin序列基本一致.说明目的基因已成功克隆到pGEMTEasy载体中.M：1.0kbplusDNAladdermarker；1：PCR扩增产物.图1PCR扩增目的canstatin基因产物琼脂糖电泳M：1.0kbplusDNAladdermarker；1～6：pGEMT/canstatin阳性克隆EcoRⅠ酶切产物.