犬细小病毒vp2基因的原核表达及鉴定

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：20130695专业硕士学位论文犬细小病毒VP2基因的原核表达及鉴定ProkaryoticExpressionandIdentificationofCanineParvovirusVP2Gene作者姓名：张馨颖学位类别：兽医硕士专业名称：兽医研究方向：动物病毒学指导教师：夏志平研究员所在学院：动物科学技术学院2015年4月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，

2、也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2

3、、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要犬细小病毒（CPV）VP2蛋白是CPV的主要结构蛋白，大约占衣壳蛋白的90%，编码病毒主要的抗原决定簇。它既是主要免疫保护性蛋白，又是良好的诊断抗原。因此，VP2基因的表达及鉴定，不仅为建立犬细小病毒血清抗体检测方法提供了诊断抗

4、原材料，也为长春市犬细小病毒流行株的研究提供了资料。本研究以长春某动物医院临床疑似病犬的粪便为样品，根据GenBank中收录的CPV-VP2基因序列设计了一对特异性引物，扩增出大小为1790bp的基因片段。将此片段克隆至pMD18-T载体上，获得重组克隆载体pMD18-T-VP2，经双酶切鉴定及测序，其同源性和遗传进化分析结果表明，此基因片段与GenBank中收录的10个不同国家的CPV-VP2基因的核苷酸同源性为99.2%～99.9%，氨基酸同源性为99.0%～99.8%，由此确定此基因是CPV-VP2基因。其中与一株新CPV-2a型毒株GQ379042.1

5、亲缘性最高，只有一个碱基不同，因此确定该基因属于新CPV-2a型，并申请GenBank登录号KP686093。再将重组克隆载体上的VP2基因亚克隆至原核表达载体pET-32a上，得到的重组表达载体pET-32a-VP2，经双酶切鉴定、PCR鉴定及测序，表明VP2基因已经成功克隆至pET-32a载体上，且阅读框正确，无移码突变。因此，成功构建了原核重组表达载体pET-32a-VP2。将鉴定正确的原核重组表达载体pET-32a-VP2转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞诱导表达。结果表明：在87kD左右出现明显的目的蛋白条带，且以包涵体形式表达；对诱导条件

6、进行优化发现，当IPTG浓度为2mM、诱导时间为4h、诱导温度为37℃时，蛋白的表达量最大；镍柱纯化后，经蛋白免疫印迹试验(Westernblotting)鉴定，证明VP2蛋白具有反应原性。关键词：犬细小病毒，VP2基因，原核表达，鉴定IAbstractCanineparvovirus(CPV)VP2proteinisthemainstructuralproteinofCPV,accountingforabout90%ofthecapsidproteins,encodingthemainantigenicdeterminant.Itisnotonlythema

7、inimmuneprotectiveprotein,butalsoagooddiagnosticantigen.Therefore,expressionandidentificationofVP2protein,isofgreatsignificanceforthedevelopmentofspecificdiagnosticantigen,meanwhile,providingdatasforstudyingcanineparvoviruspopularstrainsinChangchunCity.Inthisstudy,thesamplewasthedog

8、s'feceswhichwerefro