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Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationDevelopmentandPropertiesResearchofCaninedistempervirusNproteinmonoclonalantibodyandAnalysisofcanineparvovirusVP2genemutationPh.D.Candidate：YiLiSupervisor：ChengShiPengMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:MolecularimmunologyandvaccinedesignMarch2015 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究王作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。ｄ年６月＾日研究生签名：名心时间：八关于论文使用授权的声明，本人完全了解中国农业科学院有关保留；、使用学位论文的规定即中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容研究生签名：去：Ｌ时间；２＾ｉＳ年＜月玉日时间； 中国农业科学院博壬学位论文评阅人、答辩委员会签名表８犬：癌热病毒Ｎ蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒ＶＰ２１＾古｜５曰細变异分析动分论文作者易立专业预防兽医学研究方向ＩＩ墓Ｉ指导教师程世鹏研巧员培养单位（研究所）特产研巧所姓名职称硕（博）单位专业签名硕导□呀墓导□人硕博导■钱爱东教授吉林农业大学预防兽医学雪謂立案等參王硕导□军事医学科学院军事Ｓ＾Ｕ－＞；＞４龙雜兽医学乂抑帛导■旨医研究所丈高丰教授吉林大学临床兽医学占畫圓２文口傅殿国研究员吉林省畜牧兽医总站预防兽医学痛恃辩—一内口硕导□中国农业科学院特产円亩左成目喜军研九贝私防。医子博导■研充所委肉中国农院特产武华研究员．票競—Ｉ吉林特技术有吴威研究员農諸Ｉ会议记录（秘书）范琳琳论文答辩时间地点２０巧年５月１８日长春所区办公楼韦楼会议室 摘要犬瘟热（CanineDistemper,CD）是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（Caninedistempervirus,CDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒（CanineParvovirus,CPV）引起的以肠炎、腹泻与主的烈性传染病。为了更好的控制与预防上述两种疫病的流行，本研究开展了犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析。首先，本研究以CDV3的RNA为模板，原核表达纯化了带His标签的N蛋白截短片段（aa277-471），免疫BALB/c雌鼠后，将其B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过包被N蛋白截短片段（aa277-471）的ELISA筛选，获得分泌抗CDV的单克隆抗体杂交瘤阳性细胞1株，命名为1N8，亚类鉴定为IgG1a，kappa链，该单克隆抗体间接免疫荧光检测阳性、WB检测阳性。接下来采用噬菌体展示和肽扫描的方法，筛选1N8结合的抗原表位：合成N蛋白（aa277-471）的15肽文库，每条多肽长度15aa，位移5aa，通过结合和筛选，得到一条与单克隆抗体1N8阳性反应的多肽，通过多肽N端和C端的不断缩减，最终证明该抗原表位的最小识别单位：351359NFGRSYFDP。通过3D模拟，发现此表位位于N蛋白的外侧，其与CDV阳性血清具备一定的ELISA反应能力。通过比对，其与CDV同属麻疹病毒、牛瘟病毒，小反刍兽疫病毒一致，并对小反刍兽疫病毒进行了WB验证，其结果为阳性。以杂交瘤细胞1N8为模板，分离出抗体轻链和重链可变区，通过基因工程的方式组装成单链抗体，通过原核表达，获得了重组1N8单链抗体蛋白，经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测，其具备1N8单抗的部分活性。351359以腺病毒为表达载体，研究了NFGRSYFDP表位疫苗的免疫效力：构建含351359NFGRSYFDP表位和肠炎细小病毒VP2基因的表达盒，通过PCR和WB检测，重组腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表达出外源片段。小鼠免疫试验显示：与商品化对照疫苗相比，重组腺病毒的CPV的ELISA效价与之相当，但CDV的ELISA效价比较低。最后，在本研究开展了CPVVP2基因遗传变异研究：历经4年，收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份，分离病毒8株，获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份，其中CPV-2a型20份，CPV-2b型2份，测序结果显示我国CPV存在CPV-2a（Ser297Ala）变异，而且CPVVP2基因序列相似度为99.3-99.9%，系统发育树证明本次分离的大多数CPV毒株为一个大的分支中，与泰国KU143-09株类似，且不呈现地域相关性。关键词：犬瘟热病毒，核蛋白，单克隆抗体，犬细小病毒，遗传变异III AbstractCaninedistemperiscomposedofParamyxoviridaemorbillivirusCaninedistempervirus(CDV)causedanacute,febrile,highlycontagious,viralinfectiousdiseases.CanineparvovirusdiseaseiscausedbyCanineparvovirus(CPV),isoneofsevereinfectiousdiseasesindogs,withthemainsymptomsofenteritisanddiarrhea.Inordertocontrolandpreventthesediseasesbetter,weanalysisofCPVVP2genemutationsandpreparationNproteinofCDVmonoclonalantibody.ThestudyusedtheCDV3virusRNAasthetemplate,constructingCDVNproteintruncated(aa277-471),expressionandpurificationinprokaryoticvector,andimmunedBALB/cfemalemicetoobtaintheBlymphocyte.AfterCDVNproteintruncated(aa277-471)ELISAscreening,weobtainedahybridomacellstrainnamed1N8,whichsubtypeidentificationforIgG1a,kappachainandimmunefluorescenceandWBdetectionpositive.AseriesofsynthesizedpeptidesbasedontheaminoacidsequenceoftheCDVNproteinwere351359screenedonepeptideNFGRSYFDPwasdifinedastheminimallinearpeptideepitoperecognizedbythemab1N8.WeproposethatthismotifisalinearB-cellepitopeoftheNprotein.Thealignmentandcomparisonofthe1N8-definedepitopewithotherMorbillivirussequencesshowedthattheepitopeisconservedamongtheMorbillivirusincludingMeaslesvirus,Rindispestvirus,Peste-des-petits-ruminantsvirus,andRinderpestvirus.Theidentifiedepitopemaybeusefulforclinicalapplications,aswellasutilizedasatoolforfurtherstudyregardingthestructureandfunctionoftheCDVNprotein.Thevariableregionsoftheheavychain(VH)andlightchain(VL)wereamplifiedbyRT-PCRfromthehybridoma1N8,whichsecretesthemonoclonalantibodyagainstCDVNprotein(aa277-471).TheVLandVHCDSswerecombinedusingSOE-PCRbya12aminoacidflexiblelinker(SSGGGGSGGGGS),whichproducedthescFvgene(namedscFv/1N8).Aftersequenceanalysis,thescFv/1N8genewereclonedintotheprokaryoticexpressionvectorPET32awithaHis-tag.TherecombinantscFv/1N8proteinwassuccessfullyexpressedinrecombinantEscherichiacolibyIPTGinduction.Moreover,thebindingactivityandspecificityofthescFvwasdeterminedbyindirectELISA(Histag)andcompetitiveELISA.TherecombinantscFv/1N8proteinreportedherecouldprovidethebasisforfurtherantiviraldrugresearchonthescFvmolecule.351359westudyNFGRSYFDPepitopevaccineimmuneeffectusingexpressionvectorofadenovirus.351359ToconstructtheexpressioncassettecontainingNFGRSYFDPandCPVVP2gene,TherecombinantadenoviruspackagingsuccessbyPCRandWBassay,atDNAandproteinlevel.Afterimmunizationofmice,comparedwithcommercialcontrolvaccine,ELISAtiterofrecombinantCPVVP2equivalent,buttherelativelylowELISAtiterofCDV.Inthepresentstudy,sequenceanalysisiofseveralVP2genesofCPVcontributedtothepredominantCPVstrainasCPV-2a(Ser297Ala),withtwoCPV-2b(Ser297Ala).Sequencecomparisonrevealedhomologiesof99.3–99.9%,99.9%and99.3–99.7%withintheCPV2aisolates,withintheIV CPV2bisolatesandbetweentheCPV2aand2bisolates,respectively.Inaddition,severalnon-synonymousandsynonymousmutationswerealsorecorded.ThephylogenetictreerevealedthatmostoftheCPVstrainsfromdifferentareasinChinawerelocatedintheformationofalargebranch,whichweregroupedtogetheralongwiththeKU143-09strainfromThailandandfollowedthesameevolution.Inthisstudy,weprovideanupdatedmolecularcharacterizationofCPV2circulationinChina.Keyword:CDV,Nprotein,Mab,CPV,GeneticvariationV 目录第一章引言............................................................11.1犬瘟热病毒........................................................11.1.1犬瘟热病毒病原学..............................................11.1.2犬瘟热病毒基因组及N蛋白研究进展..............................31.2犬瘟热病毒单克隆抗体的研究........................................51.2.1犬瘟热病毒单克隆抗体的制备....................................51.2.2犬瘟热病毒B细胞表位..........................................51.2.3犬瘟热病毒单链抗体............................................61.3犬瘟热病毒诊断技术研究............................................71.3.1犬瘟热病毒病原学诊断..........................................81.3.2犬瘟热病毒血清学诊断..........................................81.4犬瘟热病毒疫苗研究进展............................................81.4.1犬瘟热病毒毒株及疫苗..........................................81.4.2犬瘟热病毒新型疫苗............................................91.4.3犬瘟热病毒免疫失败原因........................................91.5腺病毒作为载体在动物疫苗中的研究进展..............................91.6肉食动物细小病毒.................................................101.6.1肉食动物细小病毒概述........................................101.6.2基因组特征..................................................111.6.3犬细小病毒..................................................111.6.4犬细小病毒变异和VP2蛋白氨基酸突变..........................121.6.5我国犬细小病毒流行状况......................................121.7研究的目的和意义.................................................13VI 第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备.....................................142.1材料与方法.......................................................142.1.1主要实验试剂.................................................142.1.2毒株及实验动物...............................................152.1.3主要仪器和耗材...............................................152.1.4N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR.............................152.1.5N蛋白截短蛋白(aa277-471)表达载体构建........................152.1.6pEASY-N表达菌株诱导表达.....................................162.1.7重组CDV-N蛋白表达预处理.....................................172.1.8N蛋白表达Ni-NTA纯化........................................172.1.9N蛋白SDS-PAGE分析..........................................172.1.10CDV-N蛋白免疫程序..........................................172.1.11N蛋白间接ELISA检测方法的建立..............................172.1.12细胞融合试验................................................182.1.13阳性杂交瘤细胞的筛选........................................182.1.14MAbs腹水的制备.............................................182.1.15间接免疫荧光（IFA）鉴定.....................................192.1.16MAb的Westernblot鉴定.....................................192.1.17MAb上清与腹水效价测定以及亚类鉴定..........................192.2结果.............................................................202.2.1N基因的PCR扩增.............................................202.2.2重组供体质粒pEASY-N的鉴定...................................202.2.3pEASY-N重组质粒的表达与纯化.................................202.2.4间接ELISA检测法的建立.......................................21VII 2.2.5阳性杂交瘤细胞株的获得.......................................212.2.6MAb上清与腹水效价测定以及亚型鉴定...........................212.2.7MAb的IFA鉴定...............................................222.2.8MAb的Westernblot鉴定......................................232.2.9MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联.........................232.3讨论.............................................................242.3.1CDV单克隆抗体的制备.........................................242.3.2选择CDVN蛋白的原因........................................242.3.3CDV单克隆抗体国内外应用进展.................................24第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白（AA277-471）B细胞表位...................253.1材料与方法.......................................................253.1.1主要实验试剂.................................................253.1.2单克隆抗体1N8的纯化.........................................253.1.3噬菌体筛选与扩增.............................................263.1.4阳性噬菌体序列测定...........................................263.1.5犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）合成肽的制备....................263.1.6抗原表位的初步鉴定（肽扫描）.................................273.1.7抗原表位的精确鉴定...........................................273.1.8抗原表位的特异性鉴定.........................................273.1.9抗原表位合成多肽与CDV阳性/阴性血清ELISA反应................273.1.10抗原表位的3D位置...........................................273.2实验结果.........................................................283.2.1单抗腹水纯化.................................................283.2.2肽库淘选.....................................................28VIII 3.2.3随机噬菌体的测序结果.........................................283.2.4肽扫描结果...................................................293.2.5抗原表位的精确鉴定...........................................293.2.6抗原表位的比对...............................................303.2.71N8与小反刍兽疫病毒的WB检验................................313513593.2.8抗原表位NFGRSYFDP在N蛋白中的3D位置......................313513593.2.9抗原表位NFGRSYFDP与CDV阳性血清反应能力...................313.3讨论...........................................................323.3.1CDVN蛋白B细胞抗原表位.....................................323.3.2麻疹病毒属N蛋白抗原表位分析.................................32第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定........................344.1材料与方法.......................................................344.1.1细胞与菌株...................................................344.1.2主要实验试剂.................................................344.1.3引物设计.....................................................344.1.4杂交瘤的RNA提取，cDNA合成和基因扩增........................354.1.5单链抗体scFv/1N8gene的合成.................................354.1.6原核表达重组质粒的构建.......................................354.1.7单链抗体基因的序列比对分析...................................354.1.8单链抗体的表达...............................................364.1.9重组蛋白的纯化...............................................364.1.10重组蛋白的复性..............................................364.1.11蛋白浓度的测定..............................................36IX 4.1.12单链抗体活性检测............................................374.2结果.............................................................374.2.1scFv/1N8gene基因的扩增结果.................................374.2.2scFv/1N8gene基因的序列分析.................................374.2.3scFv/1N8重组蛋白的表达与纯化................................384.2.4scFv/1N8重组蛋白的活性检测..................................384.3讨论.............................................................404.3.1CDV单链抗体的研究...........................................404.3.2CDV单链抗体的构建方式.......................................404.3.3CDV不同蛋白单链抗体的未来展望...............................40351359第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究..................................415.1材料与方法.......................................................415.1.1腺病毒表达载体和试剂.........................................415.1.2含目的基因(表位+VP2)的PCR扩增...............................415.1.3含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建...........................425.1.4重组腺病毒载体菌内重组鉴定...................................425.1.5重组腺病毒质粒转染HEK293细胞................................425.1.6重组腺病毒滴度（TCID50）的滴定................................425.1.7重组腺病毒的形态学观察.......................................425.1.8重组腺病毒的PCR鉴定.........................................425.1.9重组腺病毒的WB鉴定..........................................435.1.10重组病毒免疫小鼠实验........................................435.2结果.............................................................435.2.1PCR扩增结果.................................................43X 5.2.2含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建结果.......................435.2.3重组腺病毒的包装.............................................445.2.4重组病毒滴度（TCID50）的测定..................................445.2.5重组腺病毒的电镜观察.........................................455.2.6重组腺病毒的VP2基因PCR结果.................................455.2.7重组腺病毒的Westernblot检测................................465.2.8重组腺病毒免疫小鼠后CPV抗体效价.............................465.2.9重组腺病毒免疫小鼠后CDV抗体效价.............................465.3讨论.............................................................475.3.1腺病毒载体的优势............................................475.3.2CPVVP2基因的VLP特征......................................475.3.3CDV表位疫苗................................................48第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析...............................496．1材料与方法......................................................496.1.1菌株、载体和试剂.............................................496.1.2CPV基因组提取方法..........................................496.1.3用于CPV毒株遗传进化分析的毒株信息...........................506.1.4CPVPCR扩增.................................................506.1.5CPV特异性片段的PCR扩增与RFLP分析..........................516.1.6CPVVP2基因的克隆...........................................516.1.7利用实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV病毒含量...............516.1.8犬细小病毒分离...............................................526.1.9犬细小病毒系统发育树的构建...................................526.2试验结果.........................................................52XI 6.2.1样品中细小病毒的常规PCR鉴定.................................526.2.2犬细小病毒RFLP分析..........................................525.2.3犬细小病毒病毒分离...........................................536.2.4犬细小病毒VP2基因的克隆.....................................536.2.5实时荧光定量PCR相对定量方法测定细小病毒载量.................546.2.6犬细小病毒VP2基因的序列分析.................................545.2.7犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变.....................556.2.8CPVVP2基因系统发育树分析...................................556.3讨论.............................................................606.3.1我国CPV流行趋势分析.........................................606.3.2VP2蛋白氨基酸变异分析.......................................606.3.3我国CPV免疫保护分析.........................................616.3.4CPV及其他犬科动物感染细小病毒联系...........................61第六章全文结论......................................................62附录................................................................63参考文献..............................................................68致谢................................................................81作者简历..............................................................82XII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AdAdenoviralvector腺病毒载体BFPVBluefoxparvovirus蓝狐细小病毒CDVcaninedistempervirus犬瘟热病毒CDRcomplementaritydeterminingregion抗体互补决定区CPVcanineparvovirus犬细小病毒ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FRframeworkregions框架序列FFusionprotein融合蛋白FPVFelineparvovirus猫泛白细胞减少症病毒Hhaemaglutininprotein血凝蛋白次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧HATHypoxantinaminopterinthymidin啶IPTGIsopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IFAindirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验MabMonoclonalantibody单克隆抗体MEVminkenteritisvirus水貂肠炎病毒NNucleoprotein核蛋白TCID5050％tissuecultureinfectiousdose半数组织感染量PDVPhocinedistempervirus海豹瘟病毒PPRVPeste-des-petits-ruminantsvirus小反刍兽疫病毒RPVRinderpestvirus牛瘟病毒RDPVraccoondogparvovirus貉细小病毒ScfvSinglechainvariablefragment抗体单链可变区SOE-PCRGenesplicingbyoverlapextensionPCR重叠延伸PCRVHVariablegeneofheavychain重链可变区VLVariablegeneoflightchain轻链可变区WBWesternBlot免疫印迹XIII 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言随着我国毛皮动物养殖业（水貂、狐、貉）近年来的养殖规模不断扩大，尤其在经历2008年世界经济危机之后，毛皮市场逐渐走出了低价的阴霾，毛皮产业随经济、市场回温保持高速发展，进入了价格和销量同步持续的增长期。2009～2013年，我国狐、貉、貂三大毛皮动物饲养量出现了大幅度增长的趋势，年均增速高达20%，其毛皮产量、加工量、销售量均处于历史最高水平，产值利税率8%左右，高居轻工行业榜首。目前我国毛皮动物养殖总量约11900万只（其中水貂7200万只、蓝狐1450万只、银狐580万只、貉2670万只）。我国发展历史虽短，但势头迅猛，目前我国已经成为世界毛皮养殖、加工、贸易及消费中心，毛皮动物养殖量已超过丹麦、芬兰、美国等主要饲养大国居于世界首位，亦是全球毛皮行业从业人员最多的国家、最大的原料皮进口国、最大的毛皮服装生产国和出口国、最大的消费国之一（张旭等，2013）。犬瘟热（CanineDistemperVirus,CDV）、细小病毒肠炎和水貂阿留申病并成为世界养貂业的“三大疫病”。随着经济动物养殖量的迅速扩大，犬瘟热的流行呈现出加重的趋势，其极高发病率和致死率，已经造成了巨大的经济损失。与此同时，犬瘟热病毒早期诊断和感染后治疗制剂缺乏，使得该病很难诊断和控制。随着生物诊断试剂产业的迅猛发展，犬瘟热单克隆抗体的问世，无论在治疗或者诊断方面都展现了巨大的优势。另一方面，通过狐貉细小病毒基因分析显示，其与犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）病原体极其类似。CPV病毒的遗传变异分析，可以为包括狐貉在内的肉食动物细小病毒疫病防控提供病原学理论基础。本章将详细阐述CDV核蛋白（犬瘟热单克隆抗体和单链抗体）在诊断和免疫中的应用和肉食动物细小病毒的VP2基因的遗传变异的研究进展，以及重组腺病毒在动物疫苗中的研发前景和应用进展。1.1犬瘟热病毒1.1.1犬瘟热病毒病原学CDV属于副黏病毒科（Paramyxoviridae），副黏病毒亚科（Paramyxovirinae），麻疹病毒属（Morbillivirus），该属的成员除与其亲源关系最近的麻疹病毒（Measlevirus,MV）外，还包括牛瘟病毒（Rinderpestvirus,RPV）、小反刍兽瘟疫病毒（Pestedespetitsruminantspestivirus,PPRV）、海豹瘟热病毒（Phocinedistempervirus,PDV）和海豚瘟热病毒（Porposiemorbillivirus,PMV）。6CDV为负链RNA病毒，分子量为6×10Da，病毒粒子囊膜呈圆形或不规则形，有时也呈长丝状，直径为120～300nm不等。在蔗糖中的浮力密度为1.180～1.218，峰值为1.195。囊膜内含有宽径约15～17nm的螺旋形核衣壳，和被螺旋状核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein,N）包裹的基因组，核衣壳主要由N蛋白组成，此外P蛋白和L蛋白也是核衣壳的成分，且后两者具有聚合酶的活性。可自然感染CDV的动物包括食肉目所有8个科以及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科（NakanoHetal.,2009）。随着我国毛皮动物养殖业的发展壮大，犬瘟热在各地毛皮动物养殖场时有发生，水貂、狐狸、貉是本病的主要自然宿主，各年龄和不同性别的动物都易感染该病，1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言其中尤其以幼小动物的易感性最高，一年四季均可发病。近来还有研究表明，CDV还可以感染大熊猫科的大熊猫以及猕猴属的猕猴、短尾猴（李天松，2012），但CDV感染猴效果不如麻疹病毒严重，也有文献报道CDV来源其实就是麻疹病毒（刘玉秀，2014）。CDV的临床症状以典型的双相热、肺炎、眼睑分泌物等为主，并呈多样性，主要分为肺炎症状、肠炎症状和脑炎症状。其中神经症状是在病程后期出现，并导致犬不可逆转的损害。在病理观察中，肺部出现明显的炎性损伤，出现大量淋巴细胞和炎性渗出物，造成肺气肿，脑部神经细胞肿胀变性，出现噬神经现象等。CDV感染对动物的免疫功能造成损害，其感染后主要损伤在于淋巴组织萎缩、白细胞减少，导致患病动物严重的免疫抑制，严重时可持续几个月。组织病理学研究表明数突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞是犬瘟热病毒主要的靶细胞（PilletSetal.,2009）。A.GroÈne等（A.GroÈneetal.,2005）对临床感染CDV的犬的细胞免疫情况进行研究：测定CDV感染犬只的外周血细胞因子IL-1β，IL-2，IL-6，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，TLR-7，MHCclassI，MHCclassII和IL-8表达水平，表达IL-1分子最多；IL-6和IL-12其次；而几乎所有都表达TNF和TGF，另外有3只试验犬未表达任何细胞因子，推测与CDV免疫抑制有关。利用RT-RCR方法对犬瘟热病毒在实验犬体内分布和分泌物排毒分析（王君伟，2008；王秀东，2010；王乐胜，2013）发现：犬瘟热病毒在脑组织、肺胀、脾脏都能检测到，同时这些部位也是病变最为明显的脏器；在对试验犬体外分泌物检测可知，眼睑分泌物、粪便、尿液、鼻液、唾液均含有犬瘟热病毒，其中粪便含量最高。而养殖场中粪便、尿液的随意堆积，可能是导致犬瘟热病毒在兽群中持续感染的重要原因。图1.1CDV感染后的临床及病理变化Figure1.1CDVClinicalandpathologicalchanges注：左图为CDV感染犬的鼻表皮增厚，右图为CDV感染细胞内出现的包涵体现象（图片来源百度百科）CDV曾经一直被认为仅有一个血清型。然而在过去的研究中，研究发现CDV存在着不同毒力株，而且CDV毒株还分为不同地理型毒株（LanNTetal.,2006;IwatsukiKetal.,1997;MochizukiMetal.,1999）。通过CDVH基因的遗传发育分析可知，目前CDV毒株主要可分为亚洲I型/II型，欧洲型，美洲型，北极型和疫苗型等6个基因型。最新研究表明又有新的基因型出现，如亚洲Ⅲ型（Asia-Ⅲ）、欧洲野生动物型（Europewildlife）和非洲型（Africa），其中犬瘟热弱毒疫苗株绝大多是属于America-1型（Qiaoetal.,2011;Wangetal.,2011;Yietal.,2012）。在我国，CDV野生流行株主要为亚洲I型，同时也有Artic型和Aisa-3型CDV流行毒株的存在（Zhaoetal.,2010;Wangetal.,2011）。CDV的病毒受体---信号淋巴细胞激活因子（SLAM）是一种在激活的淋巴细胞或者成熟的树突状细胞上高表达的糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族之一。已有研究证明表达犬SLAM的细胞能2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言够有效提升CDV病毒的感染细胞能力，如Seki（2003）应用能够稳定表达犬SLAM的Vero-DST细胞系分离到了CDV野毒株。此外在CDV患病犬的体内检测研究表明：当病毒感染动物机体时，SLAM分子的增值可能代表着犬瘟热病毒在体内的复制程度增加（Wenzlowetal.,2007），CD150可能是犬瘟热病毒H蛋白的识别受体。同时，CD46分子也被认为是麻疹病毒的细胞受体，但是仅仅是在犬的肿瘤淋巴细胞（CD150阴性）中检测到（Nussbaumetal.,1995）。CD9分子与犬瘟热病毒介导的细胞融合和多核细胞的产生相关（Schmidetal.,2000），但是目前并没有直接的证据表明病毒能结合这种蛋白分子。1.1.2犬瘟热病毒基因组及N蛋白研究进展1.1.2.1CDV病毒基因组CDV的基因组是单股不分节段、非重叠的负链RNA，大小约由15690个核苷酸组成。其基因组由3’至5’方向的基因顺序依次为N-P-M-F-H-L。而CDV的6个基因分别编码核蛋白（nucleocapsid,N），基质蛋白（Matrix,M），磷蛋白（phosphoprotein,P），融合蛋白（fusion,F），血凝素蛋白（hemagglutinin,H）和大蛋白（largeprotein,L）。其中N、P和L蛋白为髓芯蛋白，与RNA的转录和复制有关，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，与病毒感染相关，是麻疹病毒属中主要的交叉抗原（CurranMDetal.,1991）。N、P和L蛋白形成核糖核蛋白复合体（RNP）包裹病毒RNA，RNP与病毒复制过程相关；M蛋白则嵌合到囊膜内，在糖蛋白与核衣壳连接中起桥连作用，同时与病毒的装配和出芽有关。由H蛋白和F蛋白组成的病毒囊膜纤突是病毒与受体细胞接触并侵入的主要部分，而附属蛋白C蛋白和V蛋白，属于P蛋白内的额外转录单位，与病毒的致病性有着直接的联系。据hamburge等（1991）报道，N蛋白与CDV的毒力相关，因为CDV的单克隆抗体L1与无毒力的CDV的N蛋白结合而不能与CDV强毒结合；而CDV强毒经过传代后，又能与L1单抗反应，推测N蛋白的某些结构是CDV毒力的关键点。图1.2CDV病毒结构及基因组特征Figure1.2TheCDVstructureandcharacteristicsofthevirusgenome1.1.2.2犬瘟热病毒N蛋白CDV所属的副黏病毒科的N蛋白含有489-553个氨基酸，N蛋白以螺旋状-丝状延展长度达到600-800nm，其宽度大约是18-22nm，螺旋直径约为5.5nm（KnipeandHowley,2001）。N蛋白3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言具备2个结构区：C端区和N端区，其中N端区具有一个自由的NH2，该结构组成了N蛋白的80%以上；N端区是极其保守的蛋白，使用胰酶消化Sendai病毒重组的N蛋白，能留下一个约48kD大小的核心蛋白，而消化MV病毒的重组的N蛋白，能留下一个约45kD大小的核心蛋白（Bellinietal,1986;Hummeletal.,1992;Mountcastleetal.,1974）。在电镜下观察，我们能看见N蛋白与病毒核酸紧密的结合在一起（KingsburyandDarlington,1968）。因此N蛋白的核酸结合区和螺旋结构决定区是极其保守的，这种保守特质也是Ｎ蛋白组装所必须的结构。与N端区不同，C端区是极其不保守且高度的疏水性质，高变的C端区可能是N蛋白的球形体尾巴，而C区尾巴包含大量磷酸化和抗原位点（HsuandKingsbury,1982;KnipeandHowley,2001;Ryanetal.,1993）。有趣的是，C端区是核衣壳复制的必须单位，试验证明，在删除了Sendai病毒N蛋白的C端区后，其介导P蛋白形成磷酸化的能力也随之降低了（KnipeandHowley,2001;Ryanetal.,1993）。因此，N蛋白是介导RNA基因组衣壳化而避免被RNA酶降解的功能。1.1.2.3基于犬瘟热病毒N蛋白的应用近年来在随着基于CDVN重组蛋白诊断方面的研究也取得了可观的研究进展。GrantRJ等（2010）采用杆状病毒表达系统表达dolphinmorbillivirus(DMV)病毒的N蛋白，发现其能组装为核蛋白样粒子nucleocapsid-likeparticles(NLPs)，形成典型的双螺旋交叉排列形态，这些NLPs直径20-22nm，长度50-100nm。通过纯化后的NLPs蛋白所建立的ELISA方法发现，其与CDV病毒，MV病毒的血清抗体存在交叉反应，此ELISA方法可以用来检测存在DMV病毒的各种海洋动物。WienerD等（2007）证明了CDV的N和M基因协同抑制细胞—细胞间的融合的研究发现：相对与CDV疫苗株，CDV的强毒力株的细胞病变仅能产生小量的细胞融合现象。通过细胞转染M基因和N基因，发现M基因能非常强烈的影响融合活性，而N基因单独加入没有任何影响。有趣的是，同时转染M基因和N基因则最大化的抑制了细胞—细胞间的融合，这说明N基因对M基因有协同作用。LathaD等（2007）根据N基因建立了重组N蛋白（16kDa）的ELISA方法，用于检测CDV的抗体IgG（LathaDetal.,2007a）和早期抗体IgM（LathaDetal.,2007b）。SatoH等（2006）鉴定出麻疹病毒属N蛋白的一个新的细胞核定位信号和非依赖CRM1的细胞核外运信号：nuclearlocalization（NLS）为TGILISIL，位于N蛋白的70-77位；而nuclearexport（NES）为LLRSLTLF，位于N蛋白的4-11位。MasudaM等（2006）则通过一系列的截断的N蛋白克隆，筛选并鉴定了多个单克隆抗体，其中2个单抗能识别N蛋白C端，而另外2个单抗识别N蛋白N端；这些蛋白均能与CDV反应，但是与MV和RV反应的能力不同。Griot-WenkME等（2001）对比了CDV疫苗免疫和CDVN基因DNA疫苗免疫后抗N蛋白的体液免疫效价，免疫DNA疫苗的犬能产生抗N蛋白的血清抗体（IgG），只是比免疫CDV疫苗的效价低；而在IgM方面，DNA疫苗不产生任何抗N蛋白的IgM抗体。在基因CDVN基因DNA疫苗方面：CherpillodP等（2000）证实了CDVDNA疫苗中包含N基因、F基因和H基因能诱导机体（犬）产生中和抗体和细胞免疫，而且免疫后的犬能抵御CDV毒力株的挑战攻毒。YoshidaE等（1998）开展了CDVN蛋白表位和核细胞定位分析研究，通过表达N蛋白的缺失突变株，发现N蛋白的1-80位和337-358位区段是大多数单抗的识别位点，而且1-80位的N端部分是CDV转运N进入细胞核的关键部位。JensenTH等（2015）采用4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言DNA疫苗的方式，比较了仅包含H基因的DNA疫苗和包含NHF基因的DNA疫苗的免疫效力，发现这些疫苗均可以克服母源抗体给动物体造成的干扰，提供水貂完整的保护力，而且pCDV-H显得更有效率。小貂出生后5天即可形成保护，适用于水貂分窝前的免疫。1.2犬瘟热病毒单克隆抗体的研究1.2.1犬瘟热病毒单克隆抗体的制备单克隆抗体（monoclonalantibody，mab），简称单抗，是针对唯一抗原表位的一类抗体，具有极高的特异性，它由可以制造抗体的B淋巴细胞和无限增值能力的瘤细胞融合后的杂交瘤细胞产生，这种融合细胞即有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。自1975年Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术（Kohleretal.,1975），单克隆抗体技术广泛应用于生物医学科学的许多领域。为了深入研究CDV的起源、病原特征、致病机理、以及诊断和防治措施，国内外学者开展了CDV单克隆抗体的研究工作。目前已经报道相关研究有针对CDVN蛋白、H蛋白和P蛋白的单克隆抗体（BiZetal.,2015;SugaiAetal.,2009;MasudaMetal.,2006），以及针对CDV全病毒的单克隆抗体（毕振威，2012；蔺俐仲，2007；苏建青，2009；王铮，2014）。其中全传松（2014）根据昆虫表达系统表达H蛋白（70kD），并以此作为免疫源，筛选得到了抗H蛋白的单抗P5b11，其具备一定的CDV中和能力，为CDV治疗单抗的研发奠定了基础。图1.3单克隆抗体生产流程图Figure1.3Monoclonalantibodyproductionflowchart1.2.2犬瘟热病毒B细胞表位蛋白质抗原表位可以按与不同的受体细胞结合，分成B细胞和T细胞表位；抗原表位是抗原5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言分子中决定抗原特异性的基本单位，血清（多抗）可以识别大量不同的抗原表位，而单克隆抗体仅识别一个抗原表位，YoshidaE等（1999）对CDVN蛋白的表位和细胞核定位区域进行了分析，在构建多个N蛋白缺失突变体后，结果表明：N蛋白N端的80个氨基酸是转运N蛋白进入细胞核所必须的。MasudaM等（2006）分析了针对CDVN蛋白的4个单抗，其中2个识别N蛋白的N端，另外2个识别N蛋白的C端。张海雷等（2014）通过计算预测了犬瘟热病毒N蛋白的B细胞优势抗原表位，潜在的B细胞优势抗原表位为12~18、61~66、243~246、410~415、421~429、434~447、452~456、480~487氨基酸序列。抗原表位的研究为免疫机制分析、表位疫苗的设计、疾病的诊断以及鉴定特异性抗体等提供了十分有用的信息。目前为止，已经有大量动物病毒的B细胞表位被鉴定出来：包括口蹄疫病毒（宋军，2011）、猪圆环病毒（张璐，2014）、禽传染性法氏囊病毒（乔宏兴，2005）、戊型肝炎（李丹丹，2008）、蓝舌病（魏天，2014）等。这些抗原表位的鉴定为表位疫苗的研发奠定了基础。而且事实上，猪瘟病毒表位疫苗（戚昀，2009）、口蹄疫表位疫苗（陈建文，2013）、猪圆环病毒表位疫苗（田晓婷，2012）等已经开发研究出来。1.2.3犬瘟热病毒单链抗体单链抗体又称为基因工程抗体或人造抗体，包括重新组装的原核（真核）系统中高效表达抗体的重链可变区和轻链可变区。基因工程抗体能短时间生产制备大量抗体蛋白，在不需要抗体完整活性的情况下，如诊断制剂；其不失为一个很好的试剂制造方法，大肠杆菌是目前基因工程药物广泛使用的原核表达系统，也是能大规模制备基因工程抗体的有效途径。另外，单链抗体还能连接毒性蛋白质或者化学基团，实现靶目标的定向清除。单链抗体的连接肽可设计为具有特殊功能的位点，可用于单抗的后续研发。图1.4完整抗体和重组抗体示意图Figure1.4StructureofIgGandengineeredantibodyfragments(AzzazyandHighsmithJr,2012)单链抗体是目前研究最多的小分子抗体，世界上最早的单链抗体于1988年被成功构建，其抗体基因来源于鼠的杂交瘤细胞，并与亲本单克隆抗体保持相近的的抗原结合能力(Birdetal.,1988;Hustonetal.,1988)。近年来对单链抗体的研究取得了一定的成果，马云青等（2013）构8建了犬瘟热病毒T7噬菌体单链抗体库，扩增后的文库滴度为5.0×10pfu/ml，并在文库中筛选到了具有活性的克隆子。张晓霞等（2013）构建了抗口蹄疫病毒单链抗体噬菌体展示文库，构建的单链抗体原核表达载体在低温下表达出可溶性蛋白。纯化后蛋白用ELISA检测，表明抗口蹄疫病6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言毒scFv与亚洲1型口蹄疫病毒146S抗原有很好的反应性和特异性。目前已报道在流感病毒、汉坦病毒、鸡传染性支气管炎、传染性法氏囊病、狂犬病毒均成功制备了单链抗体（何芳萍等，2011；罗雯等，2007；陈锐，2008；周兵等，2014；赵蕾，2011；陈继军等，2013）。单链抗体作为一种基因工程抗体，它的基因来源主要是从淋巴细胞中扩增出重链可变区和轻链可变区基因，引物的设计可根据FR1和FR4的碱基组成和顺序分别合成扩增VL和VH基因的PCR引物，并且需要设计一段具备抗体片段折叠的柔性肽基因。图1.5抗体结构示意图Figure1.5Schematicdiagramofthestructureofantibody单链抗体中VH和VL的连接方向可以分为VL-VH和VH-VL类型，不同的连接方式可能会影响单链抗体片段对抗原的亲和力、自身的稳定性和在大肠杆菌中的表达效率。已有研究表明在大肠杆菌表达系统中VL-VH型的单链抗体表达效率是VH-VL型的20倍（Anandetal.,1991），VH和VL片段在没有linker连接的情况下也可以通过两者之间的非共价相互作用形成Fv抗体，但Fv抗体不稳定，当浓度低时VH和VL会发生解离(Glockshuberetal.,1990)。基因工程抗体研制中，经济价值高的动物单链抗体也是未来发展的一个趋势。目前FDA批准的基因工程抗体占生物制剂的30%，早在2004年，FDA批准的17个治疗型抗体中，人鼠嵌合或人源化抗体占12个（莫发荣等，2007），说明该项技术的成熟度已经非常高，应用程度广泛。1.3犬瘟热病毒诊断技术研究随着现代生物技术的不断发展，病毒信息学的不断完善，CDV的诊断方法已经由传统的病原学和血清学诊断，发展为高通量诊断、基因芯片诊断和CDV信号识别颗粒抗体诊断等，当然病毒分离、包涵体检测、RT-PCR检测、免疫胶体金、免疫荧光等病原学诊断方法和病毒中和实验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等血清学诊断方法还在起着重要的作用。7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.3.1犬瘟热病毒病原学诊断目前CDV病原学最经典的方法就是病毒分离，CDV病毒分离一般使用Vero细胞或者MDCK细胞。最近研究表明含有淋巴信号激活因子SLAM（signalinglymphocyticactivationmolecule）的Vero细胞或者MDCK可以显示出更好的病毒嗜性，CDV野毒能在此条件下生长得更快（ZhaoJetal.,2012）。而RT-PCR检测是实验室诊断CDV的最有效方法，具有快速、敏感和数据可分析性等特点。RT-PCR诊断出阳性的样品，其PCR产物可以直接送测序公司开展测序，并能了解到CDV毒株的具体信息（王琛等，2007）。而根据H基因的突变率大的特征，运用RT-PCR手段或者荧光定量PCR方式（FischerCDetal.,2013），建立了鉴别诊断CDV野毒和疫苗毒的各种分子手段，在临床诊断中已广泛运用。苏建青等（2009）建立利用CDV单克隆抗体检测犬瘟热病毒的直接免疫荧光诊断方法。而CDV的免疫胶体金目前已被广泛的应用于宠物犬CDV的诊断上，在各种兽医店和宠物医院均可售，诊断极为方便和快速，一般来说能在1-3min内出结果。近年来也有我国自主研发CDV免疫胶体金的报道，如利用单克隆抗体建立了犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA方法和制备胶体金免疫层析试纸条（王智群等，2012；孙婧等，2013）。CDV环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新颖核酸体外扩增技术，其敏感性和特异性甚至超过了普通PCR方法，而且也能具备CDV疫苗株与野毒株的鉴别诊断能力（LiuDFetal.,2015）。因此LAMP成为CDV诊断方法中可以替代RT-PCR的又一新方法。1.3.2犬瘟热病毒血清学诊断CDV抗体诊断一般使用抗原抗体相互作用的原理，包括血清中和试验（serumneutralization,SN）和间接酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssays,ELISA）。血清中和试验特别是微量血清中和试验（AppelM，1973）可以测定抗体效价细微的差异，精确度很高，而CDVELISA诊断可以用于病毒的检测，也可以用于动物血清抗体的检测（GemmaT，1995）。最近的研究显示竞争ELISA检测方法已应用于海洋动物CD的抗体检测，特别适用于感染多种物种的病原体诊断，如海豹、海狮等（SalikiJTetal.,2001）。在CDV急性感染中，宿主针对N蛋白的抗体是最早出现的，因此检测CDVN蛋白抗体在疾病早期诊断方面具有非常大的优势和应用潜力。vonMesslingV等（1999）使用重组N蛋白为抗原建立了一种捕获夹心ELISA检测血清中抗CDVIgG和IgM技术。LathaD等（2007）使用重组N蛋白的中间保守区域为抗原建立了检测CDV血清抗体的ELISA方法。SalikiJT等（2001）建立了基于单抗的竞争ELISA检测海洋哺乳动物麻疹病毒属病毒的血清学诊断方法。1.4犬瘟热病毒疫苗研究进展1.4.1犬瘟热病毒毒株及疫苗预防CD的有效措施主要是疫苗免疫预防。传统CDV疫苗主要包括灭活疫苗、麻疹病毒异型活疫苗、弱毒疫苗等。CDV应用最为广泛的是弱毒疫苗，其便利的生产方式和低廉的成本是CDV弱毒疫苗成功的关键。CDV疫苗株主要有：Onderstepoort株，SnyderHill株，Rockborn株，Lederle株和Convac株，其中SnyderHill株来自于1950s美国Ithaca岛上一只发病犬的脑组织8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言（Martellaetal.,2007），而Rockborn株由于毒力返强（Appeletal.,1978）该疫苗现在已经很少使用，而且与CDV连用的脑炎疫苗（腺病毒）之间的相互抑制作用影响疫苗效力（Phillipsetal,1989）。1.4.2犬瘟热病毒新型疫苗CDV新型疫苗包括亚单位疫苗、病毒样颗粒、活载体疫苗和DNA疫苗等，其中由CDV囊膜蛋白H或者F蛋白制备亚单位疫苗适合作为CDV亚单位疫苗，而且F蛋白产生更好的保护力和病毒中和效价，可以用于CD的预防（Norrbyetal.,2003）。CDV核酸疫苗的结果显示，免疫带有CDV囊膜蛋白（H+F）的核酸疫苗能产生中和抗体，而且加入N基因的CDV核酸疫苗产生的抗体效价更高，推测是核蛋白诱导了免疫记忆细胞的产生（蒋伟等，2013）。而GM-CSF等细胞因子佐剂能增强CDV核酸疫苗诱导的免疫应答（简子健，2012；李凤琴，2012）。其中核酸疫苗最有特点的地方是其能突破母源抗体的中和作用，能在动物体幼犬产生对CD的免疫保护，达到普通疫苗无法达到的效果，是CD防治中一个非常有效的补充。CDV的病毒活载体疫苗主要是采用重组腺病毒（痘病毒）方式，其中以犬2型腺病毒构建的犬瘟热病毒重组病毒疫苗能同时预防CD和Ad，而且重组腺病毒可以通过口服和肌肉注射等多种途径免疫动物，尤其是对于毛皮动物水貂等采用CDV口服免疫更为方便和有效。（鞠会艳，2013）而CDV本身也能作为病毒载体，通过基因操作，王磊（2012）在成功构建CDV-JP疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建带有双H基因的CDV重组毒（rCDV-JP-2H），以同等TCID50的CDV病毒量免疫犬时，与亲本病毒相比，重组病毒取得了更高的免疫效果。1.4.3犬瘟热病毒免疫失败原因CDV免疫失败既有CDV变异造成免疫逃逸的问题，也有饲养管理的问题。因此对于CD的预防即可从以上几方面来着手：平时注意清洁卫生，坚持疫苗防疫，一旦发生CD，为防止疫情的蔓延，必须立即处死发病动物，并深埋或是焚毁。CDV主要引起机体淋巴细胞和白细胞减少，因此提升动物体自身免疫能力，抵御CDV的侵染就显得非常重要。此外还有来自环境压力，如拥挤的饲养或运输环境都可能抑制机体对疫苗接种产生免疫反应，造成CD的爆发。最后，免疫接种多价疫苗中抗原之间也会产生相互作用，不同抗原之间相互作用可能增强或者降低部分抗原的免疫原性。另外毛皮兽近亲繁殖比较密集，其遗传性免疫缺陷综合症(Inheritedimmunodeficiencysyndromes)比较常见，目前虽然患病率是个未知数，但确实是免疫失败的原因之一。（刘玉秀，2014）1.5腺病毒作为载体在动物疫苗中的研究进展腺病毒作为基因治疗和基因免疫应用较为广泛的一种真核表达载体，目前已经应用于动物疫苗的研发中，自腺病毒自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有240个基因治疗临床试验方案采用腺病毒作载体（韦芳等，2005）而在动物疫苗研发中，腺病毒载体也经常使用。由于腺病毒载体主要为缺失El和E3区基因，其中缺失E1部分的属于复制缺陷型，其必须在表达腺病毒E1基因的293HEK细胞中复制；而缺失E3部分的属于复制型腺病毒，可以在所有细胞中生长，它可以成为一个很好的基因呈递载体，也能诱导粘膜免疫。孙永科等（2007）将猪瘟病9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言毒石门株E0/E2基因克隆到腺病毒载体中，构建重组腺病毒rAd-E0/E2，将该病毒猪，能诱导猪产生特异的体液和细胞免疫，攻毒试验显示此重组病毒能提供75%的免疫保护（对照常规疫苗仅40%），重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。邓素芳等（2015）将猪圆环病毒ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位构建重组腺病毒疫苗，结果表明与其他对照组比较，重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明，rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。谢力等（2015）构建了构建表达地方流行株轮状病毒G1型外壳蛋白VP7的复制缺陷型重组腺病毒，发现表达轮状病毒VP7的重组腺病毒不但能够激发体液及细胞免疫反应，滴鼻免疫途径还可诱导粘膜免疫应答，结果显示ELISA可检测到免疫小鼠血清IgG和滴鼻组肠道IgA抗体的产生。图1.5腺病毒病毒粒子图Figure1.5Adenovirusparticles1.6肉食动物细小病毒1.6.1肉食动物细小病毒概述肉食动物细小病毒包括：犬细小病毒（CPV,Canineparvovirus），猫泛白细胞减少症病毒（FPV,Felineparvovirus），水貂肠炎细小病毒（MEV,Minkenteritisvirus），蓝狐细小病毒（BFPV,Bluefoxparvovirus），浣熊细小病毒（RPV,Raccoonparvovirus），和貉细小病毒（RDPV,Raccoondogparvovirus）。这些病毒属于细小病毒科（Parvoviridate）细小病毒属（ParvovirusGenus）成员，具有细小病毒属典型的形态和结构特征，外形为轴对称的二十面体，直径为20nm-24nm。肉食动物细小病毒对外界环境的耐受力非常强，这与该病毒自身的组成和结构特点有着密切的关系。CPV不含有囊膜，无脂类以及糖类，二十面体的结构坚实紧密，对乙醚、氯仿等有机溶剂有抵抗性。而对福尔马林、氨水、氧化剂等敏感。这种高度抵抗力使其具备高度的感染力，在外界环境中保留相当长的时间。肉食动物细小病毒的另一个特征为血凝性：能促使红细胞凝集，10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言其中猴血的凝集性最为明显，而最常用的是猪血，CPV的血凝特征常常作为病毒滴度或者说是病毒效价来计算病毒含量。反之，CPV阳性血清的血凝抑制作用（抑制效价）常常来判断CPV疫苗的保护能力。图1.7细小病毒病毒粒子3D模拟图Figure1.7Simulationofparvovirusvirusparticles3D1.6.2基因组特征细小病毒基因组为线状单链DNA，大小约为5kb，CPV核衣壳由60个结构亚单位装配而成，病毒核衣壳由VP1（82.3kD），VP2（67.3kD）和VP3（63.5kD）三种蛋白构成。其中VP2构成衣壳蛋白的主要成分，结构亚单位占到54-55个，占总体个数的90%以上，而VP1只占到5-6个，只占10%。CPV核酸包裹在核衣壳二十面体内，分为结构基因和非结构基因。3’端编码非结构蛋白NS1（Non-structuralprotein1）、NS2（Non-structuralprotein）。5’端则编码两种结构蛋白VP1和VP2，这些蛋白的mRNAs共同终止在Poly（A）末端。其中非机构产生的非结构蛋白为细小病毒的复制和组装提供帮助，而结构基因则表达细小病毒核衣壳所具备的VP1、VP2、VP3蛋白，其为病毒的骨架，其中VP3蛋白极为少见。事实上VP1和VP2这2个基因为同一开放阅读框的不同启始位点产物。QingX等（2009）使用晶体结构精化将CPV的衣壳结构的分辨率提高到2.9A的水平。电子密度显示病毒衣壳内部有约87％的氨基端，其余13％则起始于衣壳外部，并且贯通环5重对称轴孔隙，该结构对于解释现有的抗原数据是十分有帮助的。1.6.3犬细小病毒而CPV、FPV和MEV为基因组高度相似的３种细小病毒（98-99％），事实上把他们称为一种病毒也未尝不可，其区别仅仅是感染宿主的不同。而通过限制性酶消化切割基因组，FPV和MEV仅仅只有一个酶切片段的差异。最近的研究发现，通过比对基因组存在着CPV和FPV的中间状况—野生狐狸细小病毒（BFPV）。其拓扑学分类位于CPV和FPV的中间进化位置，可以推测CPV的出现是由其他犬科动物的细小病毒突变进化而来。猫泛白细胞减少症病毒非常古老，最早有资料记录的是Verge于1928年注意到了这种可以过滤的病毒，有记载的第一次大规模爆发是在20世纪30年代。FPV首次分离是从一个约9个月的11 中国农业科学院博士学位论文第一章引言豹的脾脏中分离出来的。浣熊和北极狐（蓝狐）早在20世纪40年代就观察到FPV类似的症状，从病料分离的FPV样（类似FPV病毒）细小病毒粒子分别以各自的宿主命名。1947年，在加拿大的水貂养殖场爆发了急性出血性肠炎，并观察到类似FPV的症状，并把这种病毒命名为水貂病毒性肠炎（MEV），这是MEV首次被发现并分离。自1978年犬细小病毒出现后，该类病毒引起了人们广泛的关注。细小病毒再一次出现了新的宿主—犬。有趣的是，1982年再次发现了犬细小病毒的自然变异株：犬细小病毒2a亚型、犬细小病毒2b亚型。这种自然变异株与1978年犬细小病毒分离株生物学性状有着极其显著的差异，并在世界范围类流行至今。当然，依据现有的血清资料做回溯研究表明，在1970sCPV已经存在了，因为犬的血清呈现出CPV阳性反应。Ikeda等（2000）在豹猫中分离到一种新的细小病毒变异株，通过特异性单抗HI证实该病毒是CPV，但是它不和CPV的另几种单抗反应，因此被认为该病毒是新的抗原型并命名为CPV-2c。对CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c三株细小病毒的VP2进行测序，通过比较发现CPV-2c的VP2氨基酸残基300突变为Asp。1.6.4犬细小病毒变异和VP2蛋白氨基酸突变犬细小病毒衣壳蛋白为其感染宿主的最为重要的“媒介”，事实上病毒核衣壳也是与宿主接触的第一道关卡，已有研究证明这与CPV核衣壳的VP2蛋白相互作用的宿主受体有密切关系。因为CPV的衣壳蛋白的重要作用，特别是占衣壳蛋白最多的VP2蛋白。与1978年首次分离到的CPV毒株相比，在1980年出现的CPV突变株，被称为CPV-2a和CPV-2b，是因为这些突变株脱离了CPV1978年分离株的某些单抗识别范围。同时通过基因测序发现，CPV-2a和CPV-2b在VP2基因的关键位点发生了突变，而CPV的VP2基因突变就成为研究CPV病毒进化的一个重点。流行病学调查发现，犬细小病毒能感染家猫，同时产生了关键氨基酸的突变，如犬细小病毒VP2蛋白上第80位、第93位、第103位、第232位、第564位氨基酸残基等关键位置上的差异，导致了整个核衣壳3级结构的改变，可能导致了CPV核衣壳与宿主受体结合力的变化，其感染宿主范围发生改变。最新的研究表明，犬细小病毒的变异不是完全由于某些位置氨基酸的突变造成的，疫苗毒株与野毒毒株存在着基因片段重组（Wangetal.,2012），这为研究细小病毒的变异带来了新的启示。目前CPV根据VP2基因的不同被分为CPV-2、CPV-2a/2b、新CPV-2a/2b、CPV-2C（a/b）、CPV-2C等5种亚型。其主要的区分点为VP2蛋白的氨基酸不同（PhromnoiSetal.,2010）。而新CPV-2a/2b亚型主要流行于东亚和南亚，包括中国、韩国、台湾、越南和印度；CPV-2c主要流行于欧洲，包括意大利，奥地利，德国等和南美阿根廷、巴西等国。其中新CPV-2a/2b亚型和CPV-2c同时流行的有法国、比利时和葡萄牙。1.6.5我国犬细小病毒流行状况我国犬细小病毒流行状况主要以CPV-2a亚型为主，对云南省的7个地级市的13个CPV样品的VP2基因测序后发现，9个样品为CPV-2a，氨基酸序列变异主要集中在297位—518位氨基酸处，其中324位和440位氨基酸变异在犬细小病毒进化过程中扮演着重要角色。遗传进化分析显示10个样品序列形成了一个相对于国内外参考序列独立的遗传进化分支，提示云南省犬细小病毒以CPV-2a基因型流行为主（郑龙龙，2015）。在中国贵州、上海、北京等地的CPV样品检12 中国农业科学院博士学位论文第一章引言测中也得到类似的研究结果。RZZhang等对1983年至2008年由犬分离到的22株CPV开展了详细的VP2基因分析，CPV-2a（with297-Alamutation）为目前我国CPV主要流行株，与其他国家的CPV毒株相比，324位氨基酸由Tyr突变为Ile。通过VP2基因的系统发育树分析，绝大多数CPV中国分离株与CPV韩国分离株位于同一分支，暗示其具有紧密的联系。而最近的研究发现，在大熊猫中分离到的CPV存在VP2蛋白中Q370R的突变（GuoL.,2013）。随着货物贸易和人员交流的越来越频繁，特别是伴侣动物宠物犬的数量大量增加，CPV病毒的流行变得越来越容易，疫病防控越来越难，而且各地的CPV流行株显示出愈来愈趋向于一致的特征，犬细小病毒相关研究的开展亟待解决。1.7研究的目的和意义犬瘟热病和细小病毒肠炎是犬科动物（毛皮动物）的重要病原，已经造成了毛皮产业的巨大的经济损失。随着我国畜牧业的发展，养殖业的不断壮大，CDV和CPV的疫病防控显得尤为重要。CDV方面，随着动物饲养量的扩大，特别是CDV病毒突变株的出现，传统的防控手段难以达到效果，CDV病毒呈现出区域性爆发态势。因此，在本项研究中，我们制备了CDV的单克隆抗体，并期待该抗体在未来CDV早期诊断和病后治疗中产生明显的检测效果。同时本研究以N蛋白为免疫源，筛选到了CDVN蛋白的单克隆抗体，并鉴定一个新的B细胞抗原表位，这为进一步建立CDV的新型、实用的诊断制剂和疫苗学的研究，提供非常有价值的研究参考资料。此外有关CDV抗原表位的鉴定，也为开展CDV同属病毒，如麻疹病毒、小反刍兽疫病毒的抗原表位学研究提供了研究依据。在CPV方面的研究中，本论文开展了CPVVP2基因的遗传变异研究，通过利用荧光定量PCR手段，测定了粪便中CPV的病毒含量，并分析了VP2基因的同源性和基因分型，以及地理位置与病毒毒株的流行病学特征，该项研究为更好的理解CPV的遗传变异、CPV的分布特征，以及开展实施CPV的防控提供了宝贵的理论依据和科研资料。13 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备摘要：CDV的N蛋白为核衣壳蛋白，是CDV病毒蛋白中含量最高的，在犬瘟热病毒感染的早期免疫应答中起着重要作用，与细胞核定位和病毒复制及其相关。不仅如此，N蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白，除了含有B细胞表位和T细胞表位。因此，筛选出抗CDV-N蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，可以为CDV的诊断和治疗试剂的开发提供有力的支持。本研究以CDV3RNA为模板，构建CDVN蛋白截短片段（aa277-471）原核表达载体，经体外诱导表达纯化后，免疫BALB/c雌鼠，取得其B淋巴细胞，将其与SP2/0骨髓瘤细胞后，通过包被CDVN蛋白截短片段（aa277-471）的ELISA筛选，获得杂交瘤阳性细胞1株，其分泌抗CDV的单克隆抗体，并命名为1N8。亚类鉴定为IgG1a，kappa链，该单克隆抗体能与CDV病毒免疫荧光检测阳性、WB检测阳性；而对照细胞为阴性。关键词：犬瘟热病毒，N蛋白，单克隆抗体犬瘟热（caninedistempervirus,CDV）是一种由犬瘟热病毒引起的急性接触性传染病，常呈地方性流行临床症状以体温升高，眼、鼻、呼吸道炎症并偶尔伴发神经症状为特征。本病任何季节都能发生，呈地方性暴发流行。CDV早期诊断和治疗制剂缺乏，使得CD的防治愈加困难；而新型CDV的诊断和治疗制剂的开发，离不开高特异性的单克隆抗体，本研究基于N蛋白保守区截短片段（aa277-471）的体外表达和纯化为抗原，通过单抗制备方法，筛选到了一株CDV单抗，其能与CDV3毒株进行IFA和WB反应，具备很好的诊断试剂开发潜力。2.1材料与方法2.1.1主要实验试剂载体构建类试剂：表达质粒pEASY-E1、ExTaq酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、质粒小量抽提试剂盒、胶回收小量试剂盒购、AMV反转录酶、dNTPs及各种buffer购自北京全式金公司，移液器和移液tip购自上海生工。蛋白表达类试剂：丙烯酰胺、十二水磷酸钠、TrisBase、甘氨酸、溶菌酶、Aprotinin、还原型谷胱甘肽（高纯级）、氧化型谷胱甘肽（高纯级）、巯基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、IPTG、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝G250、TrtionX-100购自Amresco公司，咪唑、脱脂奶粉、PVDF膜购自Millipore公司，Benzonase核酸酶、BCAproteinassay、Ni-NTAPurificationSystem试剂盒购自Merck公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自北京安琪酵母。蛋白电泳所用蛋白分子量标准购自上海英俊公司。单抗制备类试剂：FITC和HRP标记的IgG抗体购自北京康为世纪公司，ELISA显色剂（TMB）和免疫印迹显色夜购自Sigma公司，弗氏佐剂（完全/不完全）、8-氮鸟嘌呤（8-AG）、HAT、HT、聚乙二醇（PEG）、单抗亚型鉴定试剂盒ELISA型均购自Sigma公司。14 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备2.1.2毒株及实验动物SP2/0骨髓瘤细胞、Vero细胞、CDV3株、小反刍兽疫病毒Peste-des-petits-ruminantsvirus（strainNigeria75/1）由特产所提供或购买自商品化疫苗。6-10周龄SPF级BALB/c雌鼠来自长春生物制品所试验动物中心。2.1.3主要仪器和耗材PCR仪为Bio-Rad公司的PT200系列，PCR电泳系列为北京六一仪器厂的DYY-III型电源和电泳槽，凝胶成像系统为英国UVP公司DOC，蛋白电泳和转膜为Bio-Rad公司的biorad小型垂直电泳槽和半干转印仪，细菌细胞壁破碎为宁波新芝生物公司的JY92-2D型超声波仪，离心机为美国Beckman公司的AllegraTM21Rcentrifuge型号高速离心机；纯水产自MilliporeMilli-QII型号的纯水仪。COSTAR公司的细胞培养板、细胞培养瓶和中等结合力的ELISA板；Biotek公司的ELISA洗板机；Bio-tek公司的多功能酶标仪；德国蔡司公司的倒置荧光显微镜；美国热电公司ThermoScientific的CO237℃恒温细胞培养箱。2.1.4N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR通过GenBank中报道的CDVN基因序列（GenBankno.EF375619），在氨基酸aa277-471片段设计一对引物，引物由上海生工合成。其序列为：N-F:5'-GAAACTATGTATCCGGCT-3’N-R:5'-TGACTCACTCCATTCGGA-3’离心收集感染CDV3的Vero细胞沉淀，按照Trizol法提取CDV总基因组RNA（病毒液约750µl），用oligDT15在反转录酶AMV作用下进行反转录（RT）反应，（见附录3：反转录及PCR程序）。PCR结果用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定扩增的目的片段正确后按照胶回收试剂盒说明操作对剩余PCR产物进行回收纯化，于-20℃保存用于连接。2.1.5N蛋白截短蛋白(aa277-471)表达载体构建表达质粒pEASY-E1为北京全式金公司产品，其构建特点为无需酶切位点，由载体端提供的末端突出T，和PCR片段产生的A所进行的连接构建而成（见附录2：pEASY-E1载体图谱）。构建好的质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。步骤一：扩增产物的胶回收纯化1)按照UniversalDNAPurificationKit试剂盒的使用说明，分别对扩增产物进行胶回收纯化，具体过程如下：2)通过凝胶成像系统从浓度大小为1.1%的琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5mL离心管中；3)向胶块中加入3倍凝胶体积的BufferPC；4)50℃孵育10min，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解；15 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备5)将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入200μLBufferPS，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液；6)将从（4）中所得溶液加入到平衡好的吸附柱中，室温放置2min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液；7)向吸附柱中加入650μLBufferPW，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液；8)将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温，晾干；9)将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜中间位置加入30~50μLddH2O，室温放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液；10)用变性琼脂糖胶电泳检测回收产物；11)用紫外分光光度计测定OD260/OD280，检测DNA浓度与纯度；12)-20℃保存DNA备用。步骤二：连接载体，见附录三（连接体系及程序）步骤三：连接产物转化DH5α感受态细胞：1)取1管50μL冰浴上融化的感受态细胞，分别加入连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；42℃水浴中热敷45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；2)向每个离心管中加入500μL无菌的SOC培养基，混匀后置于37℃，200r/min培养1h，使细菌复苏；+3)吸取100μL培养物于Amp抗性的LB琼脂培养板上，涂布均匀后倒置平板置于37℃温箱培养9~16h；4)4℃保存。步骤四：重组质粒的筛选与鉴定：1)无菌条件下，从培养平板上用Tip枪头挑取圆滑的单菌落，每个克隆片段挑取3个单菌+落，分别接种于含有3mLAmp抗性LB液体培养基的无菌试管中；2)将各试管置于37℃恒温振荡培养箱中，200r/min培养12~16h；3)以相应菌液为模板，进行PCR鉴定，PCR反应体系及程序见（见附录3：反转录及PCR程序）4)取5μLPCR产物，用1.1％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出阳性克隆；5)阳性克隆送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序。2.1.6pEASY-N表达菌株诱导表达将鉴定和测序后正确的重组质粒重新转化至表达菌株BL21（DE3）感受态细胞中，转化过程与上阶段描述相同，重组表达菌命名为pEASY-N表达菌。吸取150μLpEASY-N表达菌分别加入到5mL含氨苄的LB培养基中，200r/min摇菌，37°C培养至OD600为0.5～0.8（0.6为最佳）时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续摇菌5h，各取500μL菌液准备SDS-PAGE分析。16 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备2.1.7重组CDV-N蛋白表达预处理取500μL菌液加入1L含氨苄的LB培养基中，200r/min摇菌，37°C培养至OD600为0.5，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续摇菌5h，将诱导的菌液10000g离心10min，弃上清，按照每克菌体沉淀中加入5mL的细菌WashBuffer，室温下充分悬浮菌体沉淀。重复以上步骤3次，将细菌洗净，去除细菌的代谢产物，为了降低菌液的粘度，重悬时按照1:1000的比例在IBWashBuffer中加入Benzonase核酸酶（25u），超声30min破碎悬浮后的细菌至样品不再粘稠，超声过程中应确保菌液冷却避免蛋白热变性；12000g离心5min，取沉淀。将沉淀溶解于8M尿素中，溶解过程保持低温和持续时间，一般至少5h。12000g离心30min取上清，上清液过滤除菌备用。2.1.8N蛋白表达Ni-NTA纯化吸取5mLNi-NTA琼脂糖加入到10mL纯化柱中，通过重力使Ni-NTA琼脂糖完全沉淀，添加6mL去离子水并轻轻反复颠倒重悬Ni-NTA琼脂糖。根据1.5mLNi-NTA琼脂糖捆绑蛋白的能力和蛋白样品中蛋白浓度，计算蛋白样品最大上样体积。加入pEASY-N蛋白表达预处理液，轻轻震动以确保Ni-NTA琼脂糖悬浮于蛋白样品中，孵育30～60min。通过重力使Ni-NTA琼脂糖完全沉淀，用8mLWashBuffer重悬琼脂糖，将未结合的杂蛋白洗净，重复冲洗3次后，加入Elutebuffer溶解结合的His标签蛋白，收集后即为蛋白纯化液，保存于4°C用于SDS-PAGE分析。2.1.9N蛋白SDS-PAGE分析取已诱导表达的菌液500μL，以12000r/min离心lmin，弃上清留菌体沉淀，使用PBS冲洗细菌3次后，加入200μLPBS悬浮菌体和40μL5倍蛋白上样缓冲液（购自北京全式金公司），200μL纯化蛋白液也加入40μL的5倍蛋白上样缓冲液（购自北京全式金公司），取10μL上清进行SDS-PAGE分析。2.1.10CDV-N蛋白免疫程序免疫程序是制备单克隆抗体的重要环节之一，本实验的免疫程序参考于艳玲等（2008）简述如下：腹腔注射纯化的重组N蛋白，剂量约为100μg/只，首免以弗氏完全佐剂1:1比例乳化，二免和三免分别以弗氏不完全佐剂1:1比例乳化，三免后一周对小鼠尾静脉采血，采集的血液经离心机分离出血清后，测定血清效价（间接ELISA法），选用血清效价最高的小鼠在融合前3天以100μgN蛋白（不加佐剂）进行加强免疫，取其脾细胞进行细胞融合。2.1.11N蛋白间接ELISA检测方法的建立按常规间接ELISA操作步骤，经方阵法确定包被抗原和最佳稀释倍数，具体操作步骤为：1)用ELISA包被缓冲液将纯化重组N蛋白分别做倍比稀释，100μl/孔，4℃过夜。2)弃去包被液，加含5%脱脂乳的PBST（含0.05%吐温-20的PBS缓冲液）封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h，PBST洗涤3次。3)将阳性血清、阴性血清分别做倍比稀释，100μl/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次。17 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备4)将HRP标记的羊抗鼠IgG做5000倍稀释，100μl/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次。5)以加入ELISA底物显色液50μl/孔，37℃下避光显色10min，再以50μl/孔加入2MH2SO4终止反应，使用酶标仪测定出OD450nm值。2.1.12细胞融合试验①SP2/0细胞的复苏和培养融合前24～48h，选择生长良好的SP2/0细胞，。融合前将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管内，1000r/min离心5min,弃上清；用不完全培养基重悬细胞沉淀，1000r/min离心5min洗7涤后将细胞重悬至10mL，混匀；取细胞悬液进行细胞计数，每次融合一般取10个SP2/0细胞进行细胞融合试验。②制备饲养层细胞取健康未免疫的小鼠分离腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞，其详细步骤参见（毕振威，2012），5其细胞浓度达到2x10个/mL左右，RPMI-1640中培养。③免疫脾细胞的制备取加强免疫后的小鼠，处死后放置于75%酒精中浸泡消毒5min，在小鼠左侧腹壁剪一小口，撕开皮肤，用灭菌镊子提起腹膜，暴露脾脏，分离结缔组织和脂肪，取出脾脏。将取出的脾脏放入另外一个盛有不完全培养基（200个单位）的平皿中，并置于消毒的200目尼龙网上，用10mL注射器针芯研磨脾脏，使之成浆状，用带有19号针头的10ml注射器分散细胞。轻轻吸取细胞悬液，通过200目尼龙网过滤，移悬液至50mL离心管中，1000r/min离心5min，用20ml的RPMI-1640不完全培养液重复洗2次，20mlRPMI-1640不完全培养液悬浮脾细胞，并做100倍稀释，细胞计数，备用。④细胞融合将分离出的脾淋巴细胞和瘤细胞SP2/0按照1：5的比例进行细胞融合，具体过程参见（席娜，2014）等步骤，细胞融合采用商品化的PEG，细胞融合后用含20%血清的HAT选择培养液培养。2.1.13阳性杂交瘤细胞的筛选经HAT培养基选择后存活的杂交瘤细胞，开展阳性（特异性）筛选，其目的是检测杂交瘤细胞所分泌的抗体是否抗CDV，将杂交瘤细胞的上清按照2.1.11的方法检测其CDV抗体的特异性，一般来说，上清的检测OD值达到1.0以上，即为阳性。可以开展杂交瘤的单克隆化研究。杂交瘤的克隆化采取细胞有限稀释法，将阳性孔中的细胞，稀释到96孔培养板中，其稀释比例大约是每mL含细胞10个左右，加入到培养板中即1个细胞/孔。培养期间，加强细胞培养基的营养，7d左右可见细胞克隆形成，再进行一次CDV抗体的特异性检测。其阳性孔可以开展扩大培养。2.1.14MAbs腹水的制备6取8~10周龄BALB/c雌鼠，腹腔注射石蜡油0.5ml/只。7～10d后腹腔注射浓度为1~2×1018 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备个/ml的细胞悬液，大约1ml/只。待小鼠腹部变大时，收集腹水。10000×g室温离心10min，分装上清液，-20℃保存。2.1.15间接免疫荧光（IFA）鉴定用96孔细胞培养板培养Vero细胞，待细胞长满孔底80%时，接种CDV3毒株并设立未接病毒的正常细胞作为空白对照；待细胞出现病变后去除培养液，以200µl/孔加入预冷的90%乙醇4℃固定30min；用PBST缓冲液洗涤3次；相对应分别加入阳性杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗3次，FITC标记羊抗鼠IgG做200倍稀释，50μl/孔，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗3次，拍干后用荧光显微镜观察，并拍照记录结果。2.1.16MAb的Westernblot鉴定将原核重组N蛋白，CDV3感染的Vero细胞沉淀和未接毒的正常Vero细胞沉淀分别处理后进行SDS-PAGE，转印到NC膜上做Westernblot鉴定，具体方法如下：将转移后的PVDF膜，放入膜封闭液中，封闭过夜；用PBST洗膜3次，每次5min；放入2000倍稀释单克隆抗体后，37°C孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min；放入7500倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37°C孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min；加入显色液直至出现目的条带。2.1.17MAb上清与腹水效价测定以及亚类鉴定6.6566.5用原核纯化重组N蛋白做为检测抗原，将MAbs腹水分别作1×2~1×2倍稀释作为一抗，通过已建立的间接ELISA法测定Mab效价。采用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行MAbs的亚类鉴定。2.1.18MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联偶联原理：利用AlexaFluor488NHSester，与抗体Fc片段上的氨基基团进行反应。利用HRP活化后产生的醛基，与抗体Fc片段上的氨基基团进行反应。①488标记：抗体先进行超滤，用0.05MpH8.6硼酸盐缓冲液复溶，并控制浓度大于2mg/ml。取适量的488NHSester，慢速滴加到抗体溶液中，反应摩尔比例为10:1。反应过夜后，超滤3次，除去未反应的488染料，用0.01MpH7.2PBS缓冲液复溶。②HRP标记：1）取HRP45mg溶于1ml纯水中，加入0.1mol/LNaIO43ml，4℃放置30min；2）加入2.5%乙二醇3ml，室温下轻微搅拌1h；3）按待标记的抗体量，取出等量的HRP活化液，加入抗体，质量比为1:1，并调节反应液pH值至9.0，混匀，置4℃过夜；4）加入硼氢化钠溶液0.3ml，混匀，4℃放置3h；5）滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置30min，6）4000r/min离心15min，去上清，沉淀以适量0.01mol/lpH7.4PBS溶解7）4℃透析过夜，换液3次，即得到酶标记抗体。19 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备2.2结果2.2.1N基因的PCR扩增从接种CDV3出现明显病变的Vero细胞中提取到的CDV总RNA，经RT-PCR方法扩增N基因（aa277–471），扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增片段与预期大小600bp相一致（图2.1）。图2.2CDVN基因的PCRFigure2.2CDVNgenePCRresult注：M，DNA分子量标准；1，PCR扩增阳性；2，阴性对照2.2.2重组供体质粒pEASY-N的鉴定重组质粒pEASY-N经PCR鉴定得到一条与预期的600bp大小相一致的片段（图2.2），测序结果显示pEASY-N携带的N基因与已知序列完全一致。600bp图2.2重组质粒pEASY-N的PCR鉴定Figure2.2PCRofpEASY-Nplasmid2.2.3pEASY-N重组质粒的表达与纯化将重组质粒pEASY-N转化至受体菌BL21中，小量诱导表达后，开展SDS-PAGE分析，结果可知，诱导的重组菌体BL21（pEASY-N）与阴性菌BL21相比较，在25kD区域出现一条表达条带，简单纯化后的表达条带见Lane3（图2.3）。将重组菌pEASY-N大量诱导表达后，提取其细菌包涵体，使用Ni-NTA琼脂进行蛋白的纯化，其纯化结果见图2.4，最终得到了比较纯的N蛋白。20 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备图2.3pEASY-N重组质粒的表达Figure2.3ExpressionofpEASY-Nrecombinantplasmid注：M，蛋白分子量标准；1，重组菌未诱导表达对照；2，重组菌诱导表达；3，重组菌纯化结果图2.4pEASY-N重组质粒的纯化Figure2.4PurificationofpEASY-Nrecombinantplasmid注：M，蛋白分子量标准；1，重组菌诱导表达对照；2-8，重组菌纯化结果（不同咪唑浓度）2.2.4间接ELISA检测法的建立经方阵法测定结果为：N纯化重组蛋白最佳包被浓度100ng/孔包被ELISA板，阴阳性血清4000倍稀释，37℃孵育1h，羊抗鼠IgG-HRP二抗1：5000稀释，37℃孵育1h，底物显色时间为10min，可用于阳性杂交瘤细胞的筛选。2.2.5阳性杂交瘤细胞株的获得细胞融合后7~10天，培养液变为微黄，细胞群落约盖满孔底1/3~1/2时，上清液为一抗，用建立的间接ELISA法检测CDV效价。检测的杂交瘤细胞进行多轮亚克隆，直到获得分泌稳定的杂交瘤细胞，本次研究共获得1株CDVMAb，命名为1N8。2.2.6MAb上清与腹水效价测定以及亚型鉴定经间接ELISA测定MAb1N8腹水效价为1：51200左右，其OD大于0.5。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定，1N8亚类为IgG1/κappa链（图2.5；2.6）。21 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备图2.5MAb1N8腹水ELISA效价Figure2.5MAb1N8ELISAtiter图2.6MAb1N8的亚型鉴定Figure2.6MAb1N8ELISAforsubtype2.2.7MAb的IFA鉴定分别用MAb1N8腹水液对接种CDV的Vero细胞及未接种病毒的Vero细胞进行IFA试验，结果显示1N8仅与CDV3发生阳性反应，与Vero细胞呈阴性反应。且在阳性的IFA结果中，其中显色的部位与CDV病变的部位完全一致，见图2.7。图2.7MAb1N8的IFA鉴定Figure2.7MAb1N8IFA注：左图为免疫荧光图，右图为CDV细胞病变图，可见产生CPE的部位与荧光亮点一致22 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备2.2.8MAb的Westernblot鉴定用这株MAb的腹水为一抗进行Westernblot鉴定，结果显示与CDV3均呈阳性反应，在56kD处出现特异性条带，其为CDVN蛋白的大小，证明这株MAb与CDVN蛋白发生良好的特异性反应。图2.8MAb1N8的WB鉴定Figure2.8MAb1N8WesternBlot注：M，蛋白分子量标准；1，CDV病毒；2，细胞对照2.2.9MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联分别将HRP和488标记的偶联物进行紫外鉴定。根据488染料的摩尔吸光系数，以及最终偶联物的抗体浓度，可以计算出偶联比例为2.4:1。按公式计算HRP与抗体的偶联比为2：1。图2.9偶联物的紫外波长鉴定Figure2.9UVwavelengthidentification23 中国农业科学院博士学位论文第二章CDVN蛋白单克隆抗体的制备2.3讨论2.3.1CDV单克隆抗体的制备CDV单克隆抗体一直是研发CDV快速诊断方法的一个有力的试剂，而且在CDV的治疗上也发挥了重要的作用。CDV单克隆抗体制备的难点在于免疫源的选择。通常来说，使用全病毒为免疫源所获得的单抗在多样性和效价上，能取得比较好的效果；而CDV病毒为细胞内繁殖，其纯化后的产物常常带有大量细胞蛋白，而给后续的单抗筛选造成了困难；而本研究采用的是体外表达CDV蛋白的方式，可以避免细胞蛋白作为免疫源所造成的影响。但是此方法所获得的单抗仅仅针对免疫源蛋白，因此显得有些许限制。如我们免疫的是体外重组的N蛋白（aa277–471），所获得的单抗仅是针对N蛋白（aa277–471）的。但是，不能否认，这种方式生产的CDV单抗也具有广泛的应用价值。也从事实上证明了，体外重组蛋白作为免疫源能产生与天然蛋白免疫源同样的效果。原核表达出来的N蛋白，能够产生某些类似于CDVN蛋白的结构；这点也印证了体外表达N蛋白能够作为CDV检测使用抗原。2.3.2选择CDVN蛋白的原因CDV的结构蛋白有N、P、L；囊膜蛋白有M、H、F；目前针对这些蛋白的单抗均有报道，其中F蛋白（焦金波等.,2008）和P蛋白（袁维峰）的单抗制备也是采用体外纯化蛋白免疫的方法；而H蛋白（毕振威，2012）则采取的是CDV全病毒免疫的方式。而在CDV的单抗治疗制剂的选择中，无疑抗H蛋白和F蛋白的单抗更具优势，HirayamaN等（1991）证实抗H蛋白的单抗比抗F蛋白的单抗更具备机体的保护能力。当然从整个CDV病毒成份来讲，CDV的N蛋白是CDV所有蛋白占比最多的；而且N蛋白抗体能够在CDV感染早期检测到（LathaDetal.,2007）；同时它也是CDV核酸的核定位信号，与CDV的复制及其相关，因此，抗CDVN蛋白的单抗CDV的检测和治疗活性的潜力，可惜本研究所筛选到的单抗并没有CDV中和活性，未来很难应用与CDV的治疗，从单抗1N8与CDV的WB结果来看，CDV的N蛋白也是具有相当数量，我们能明显看见56kD左右的条带，也证明了实验设计当初的选择正确。2.3.3CDV单克隆抗体国内外应用进展CDV单抗主要应用于CD病的诊断与治疗，其中由于CD感染动物非常广泛，从大熊猫、猕猴到海狮、海豹；其抗体测定受限于物种而无法大规模测量，因此CDV单抗可以用作于抗体检测中的竞争物（SalikiJTetal.,2001）。而在国内，由于胶体金试纸条的需求扩大，CDV单抗常常用于制备检测抗原的夹心法胶体金试纸条的T线和结合底板（毕振威，2012）。而CD的临床治疗中，犬瘟热病毒单克隆抗体注射液也起到了非常重要的作用。24 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）B细胞表位摘要：核蛋白（Nprotein）是犬瘟热病毒的核蛋白，因其良好的抗原性，成为CDV诊断研究的主要对象。为了寻找一种快速且简单的方法来确定N蛋白的抗原表位，我们以亲和层析纯化的N蛋白（aa277-471）特异性单克隆抗体1N8为靶分子，利用噬菌体随机12肽库对其进行线性B细胞表位的筛选。经过3轮的筛选之后，对5个与N蛋白（aa277-471）特异性单克隆抗体具有结合能力的噬菌体进行了测序，并通过与N蛋白的氨基酸比对分析，结果未能找到与CDVN蛋白所对应的表位。与此同时，本研究开展了使用合成肽筛选B细胞抗原表位的研究，合成N蛋白（aa277-471）的15肽文库，每条多肽长度15aa，位移5aa，通过筛选，得到一条与单克隆抗体1N8阳性反应的多肽，通过多肽N端和C端的不断缩减，最终证明该抗原表位的最小识别单位。从而进一步补充和完善现有的CDV抗原表位研究。关键词：犬瘟热病毒；核蛋白；抗原表位；噬菌体随机12肽库；合成肽N蛋白作为CDV含量最多的蛋白，以及在CDV感染血清中最早出现的现状，成为CDV诊断的首选蛋白。抗原表位（又称为原决定簇）是一类特殊的化学基团或氨基酸序列，它们能够诱导特殊免疫学反应的产生。根据抗原表位研究的细胞对象及特点不同，可分为T细胞表位和B细胞表位（孙雪娇，2013）。B细胞表位一般存在于天然抗原分子表面，可直接被B细胞识别。我们尝试用噬菌体随机肽库和肽扫描方法对N蛋白的单克隆抗体1N8进行筛选，最终通过肽扫描获得了一个新的CDVN蛋白的B细胞抗原表位信息，并对此表位开展详细的研究。开展有关CDV抗原表位的研究对该病的免疫及诊断防治具有重要意义，为建立新型犬瘟热病毒免疫诊断方法奠定基础，也也为研究犬瘟热病毒如何与宿主免疫系统相互作用提供重要的依据。3.1材料与方法3.1.1主要实验试剂抗犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）单克隆抗体1N8由课题组保存。噬菌体随机12肽库（Ph.D.-12）和E.coliER2738宿主菌为NewEnglandBiolabs（NEB）公司产品。HRP标记的兔抗鼠IgG为Sigma公司产品；96孔酶标板为Costar公司产品。3.1.2单克隆抗体1N8的纯化1.试剂及耗材准备：1XPBS、洗脱液、封闭液、中和液、纯化柱。2.孵育腹水。1）取出纯化柱，用10倍柱体积1×PBS分2次冲洗。2）向纯化柱内倒入对应腹水，冲散beads.腹水4℃摇床过夜孵育。3）静置，待beads在纯化柱底部全部沉淀后（大约1ml），放出腹水并收集腹水流穿。4）用1×PBS冲洗纯化柱，直到beads变白为止（少数洗不白的除外）。5）将腹水流穿重新过一遍纯化柱，重复步骤3）和4）至少2遍。3.用10倍柱体积的1×PBS分2次冲洗纯化柱。25 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位4.抗体洗脱。1）10倍柱体积预洗脱液分2次冲洗纯化柱（注意沿纯化柱侧壁缓慢加入）。2）2ml1mMHCL分2次加入纯化柱（注意沿纯化柱侧壁缓慢加入）。3）封闭纯化柱下端，1ml1mMHCL加入纯化柱，冲散beads，待beads全部沉淀于纯化柱底部后（大约1~2min），流出液体，用事先装有中和液的1.5ml离心管收集洗脱液。4）重复步骤上一步骤。5.纯化柱后处理。1）5倍柱体积1mMHCL沿纯化柱侧壁缓慢冲洗。2）10倍柱体积1XPBS冲洗。3）3倍柱体积20%乙醇冲洗。4）3倍柱体积20%乙醇保存beads。3.1.3噬菌体筛选与扩增应用NEB公司噬菌体展示12肽筛选试剂盒对CDVN蛋白单克隆抗体进行配体筛选，共进行3轮筛选，前2轮包括洗脱和扩增；第3轮仅进行洗脱，不进行扩增。详细过程参见NEB说明书和孙雪娇（2013）的操作方法。10简述如下：先包被纯化后的CDVN单克隆抗体，用5%BSA封闭后，加入1.5×10PFU/100µL噬菌体原始文库，结合过程为缓慢震荡10min，静止10min，然后再震荡10min，静止10min，弃去未结合的噬菌体，0.1%TBST洗孔10次，后加入洗脱液，室温缓慢震荡30min，向洗脱液中加入15µL中和洗脱液，收获的洗脱液用于噬菌体扩增及滴度测定。滴度测定：用低盐LB按照10倍连续稀释待测噬菌体，每个稀释度取10µL加入到200µL处于对数生长期的宿主菌ER2378的新鲜菌液中，避光培养过夜；第二天检查平板，蓝色菌斑数小于100的稀释度即为每10µL噬菌体的空斑形成单位滴度。噬菌体扩增：将宿主菌ER2738在LB（四环素抗性）培养板上划线并在37℃过夜培养。第二天挑取单个菌落于LB（四环素抗性）液体培养基中培养4.5h，取200µL宿主菌ER2738的菌液加入到20mLLB（低盐）液体培养基中，并加入每一轮筛选时未扩增的洗脱产物50µL，37℃条件下剧烈震摇扩增4.5h，菌液经10,000r/min离心20min，转移上清并加入1/6体积的20%PEG8000/NaCl，4℃10,000r/min离心15min，小心弃去上清，用200µLTBS重悬沉淀，此溶液为扩增后产物3.1.4阳性噬菌体序列测定按照Ph.D.-12随机肽库操作说明书抽提阳性单克隆噬菌体DNA，用Ph.D.-12提供的引物5-CCCTCATAGTAGCGTAACG-3进行PCR测序，采用DNAstar软件进行比对分析。3.1.5犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）合成肽的制备按照犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）氨基酸序列，为抗原表位的筛选合成15肽，其中每条合成肽的步移为5肽，与前后合成肽各有5个氨基酸重复，多肽纯度达到90%，并经过质谱和液26 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位相色谱检测。共合成多肽38条。表格中阴影部分为多肽重复序列部分。表3.1犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）合成肽信息Table3.1CDVNpepscan1.ETMYPALGLHEFSGE2.ALGLHEFSGELTTIE3.EFSGELTTIESLMML4.LTTIESLMMLYQQMG5.SLMMLYQQMGETAPY6.YQQMGETAPYMVILE7.ETAPYMVILENSVQN8.MVILENSVQNKFSAG9.NSVQNKFSAGSYPLL10.KFSAGSYPLLWSYAM11.SYPLLWSYAMGVGVE12.WSYAMGVGVELENSM13.GVGVELENSMGGLNF14.LENSMGGLNFGRSYF15.GGLNFGRSYFDPAYF16.GRSYFDPAYFRLGQE17.DPAYFRLGQEMVRRS18.RLGQEMVRRSAGKVS19.MVRRSAGKVSSALAA20.AGKVSSALAAELGIT21.SALAAELGITKEEAQ22.ELGITKEEAQLVSEI23.KEEAQLVSEIASKTT24.LVSEIASKTTEDRTI25.ASKTTEDRTIRAAGP26.EDRTIRAAGPKQSQI27.RAAGPKQSQITFLHS28.KQSQITFLHSERSEV29.TFLHSERSEVTNQQP30.ERSEVTNQQPPTINK31.TNQQPPTINKRSENQ32.PTINKRSENQGGDKY33.RSENQGGDKYPIHFS34.GGDKYPIHFSDERFP35.PIHFSDERFPGYTPD36.DERFPGYTPDVNSSE37.GYTPDVNSSEWSES38.PGYTPDVNSSEWSES3.1.6抗原表位的初步鉴定（肽扫描）将N蛋白（aa277-471）截短的连续重叠的38条合成短肽，分别以100ng/孔包被ELISA板，以制备的MAbs1N8腹水稀释液为一抗和HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗通过间接ELISA方法进行检测，根据检测的OD450nm值初步鉴定N蛋白抗原表位。3.1.7抗原表位的精确鉴定根据初步鉴定的抗原表位15aa的序列信息，我们合成了一系列的合成短肽，分别在15aa的N端和C端展开缩减，合成了13aa，11aa，9aa，7aa等。分别以100ng/孔包被ELISA板，以制备的MAbs1N8腹水稀释液为一抗和HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗通过间接ELISA方法进行检测，根据检测的OD450nm值初步鉴定N蛋白抗原表位。3.1.8抗原表位的特异性鉴定对鉴定出的线性表位利用NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库中的Blastp搜索与其相近的序列进行同源性比较。同时将鉴定出的线性表位与CDV同属病毒如麻疹病毒（MV），小反刍兽疫病毒（Peste-des-petits-ruminantsvirus,PPRV）等N蛋白相对应区段进行比对，分析是否是同样的特异性表位。并开展相关病毒的WB鉴定。WB鉴定方法同上。3.1.9抗原表位合成多肽与CDV阳性/阴性血清ELISA反应将合成的抗原表达多肽分别以100ng/孔包被ELISA板，以水貂CDV阳性和阴性血清稀释液为一抗和HRP标记的兔抗水貂IgG为二抗通过间接ELISA方法进行检测，根据检测的OD450nm值初步鉴定N蛋白抗原表位的反应能力。3.1.10抗原表位的3D位置将CDV完整的N蛋白氨基酸输入蛋白质3D显示软件，并将表位多肽信息加亮显示，分析27 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位抗原表达在整个N蛋白中的位置。3.2实验结果3.2.1单抗腹水纯化将1N8单抗的腹水离心去除沉淀后进行亲和纯化，在下图中明显看出抗体的2条蛋白条带，无明显其他杂质，说明纯化的效果很好。图3.1单抗纯化效果图Figure3.1Monoclonalantibodypurificationeffect注：1，单克隆抗体纯化；2，蛋白分子量标准3.2.2肽库淘选经过3轮筛选以后，噬菌体得到了有效的富集，产出投入比（回收率）逐轮升高，第3轮的产出投入比较第1轮提高了15倍左右。表3.23轮筛选的条件及筛选效率Table3.2The3roundofscreeningconditionsandscreeningefficiency轮次抗体包被孵育时间投入量产出量洗涤液吐投入/产出量温浓度116-5125602×104.5×100.2﹪2.25×10115-6220452×106.5×100.3﹪3.25×10115-6315402×103.5×100.4﹪1.75×103.2.3随机噬菌体的测序结果随机挑选8个噬菌体克隆，成功纯化出5个随机噬菌体，其12肽随机克隆测序结果见表3.3。从第3轮筛选到的噬菌体中选择了部分进行了后续的分析，结果发现有5株阳性噬菌体的12肽序列氨基酸RS出现频率高，但是与N蛋白氨基酸195aa区段序列对比后，并未发现有重合序列。28 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位表3.3随机肽库测序结果Table3.3Randompeptidelibrarysequencingresults编号氨基酸序列1LLKIRQIRSITR2KRRSQIIIIMRM3PSRNKPIIPLTM4RRRRKPSLKILT5IKIRHNPTIQKR3.2.4肽扫描结果根据间接ELISA检测的OD450nm值初步鉴定1N8仅与第15个短肽发生反应，而与其它短肽均不发生反应（图3.2），表明1N8的抗原表位位于N蛋白上，初步确定其抗原表位为348362GGLNFGRSYFDPAYF。图3.2肽扫描结果Figure3.2pepscanresult3.2.5抗原表位的精确鉴定将初步鉴定的抗原表位15aa，分别作渐进性的N端和C端同时缩短，分别命名为1N8-1，1N8-2，1N8-3，1N8-4。经过ELISA反应测量后，1N8-1和1N8-2的OD值超过1.5，而1N8-3351359约为0.9，而1N8-4与阴性对照相当。因此我们确定1N8-3的序列NFGRSYFDP为单克隆抗体1N8的最小识别单位。29 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位图3.3抗原表位精确鉴定结果Figure3.3Finemapping3.2.6抗原表位的比对利用NCBI数据库的Blastp对1N8的抗原表位进行保守性分析，结果表明1N8抗原表位351359NFGRSYFDP对于来自不同基因型的CDV毒株是完全保守的。此外，比对结果还显示出1N8的抗原表位与CDV同属病毒MV，牛瘟病毒RinderpestvirusL株，小反刍兽疫病毒Peste-des-petits-ruminantsvirus（strainNigeria75/1）一致。图3.4抗原表位序列比对结果Figure3.4Alignmentforepitope30 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位3.2.71N8与小反刍兽疫病毒的WB检验由于抗原表位一致，为了验证单抗1N8与小反刍兽疫病毒的反应能力，我们开展了1N8与小反刍兽疫病毒的WB检验，相关程序方法与上一章节相同。结果与预期一致，1N8与小反刍兽疫病毒具有阳性反应能力。图3.51N8与小反刍兽疫病毒的WB图Figure3.51N8reactwithPPRVinWesten-blot3513593.2.8抗原表位NFGRSYFDP在N蛋白中的3D位置351359抗原表位NFGRSYFDP在N蛋白中的3D位置见下图，可以发现，其在N蛋白的表面，这也可以解释其为抗原表位的原因。351359图3.6抗原表位NFGRSYFDP在N蛋白中的模拟3D位置351359Figure3.6epitopeNFGRSYFDP3Dmap31 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位3513593.2.9抗原表位NFGRSYFDP与CDV阳性血清反应能力351359ELISA结果显示，抗原表位NFGRSYFDP与CDV阳性血清/阴性血清有一定的差异，OD值差异约在0.2OD内。351359图3.7抗原表位NFGRSYFDP与CDV阳性血清反应351359Figure3.7epitopeNFGRSYFDPreactionwithCDVserum3.3讨论3.3.1CDVN蛋白B细胞抗原表位本研究中，我们采用了噬菌体展示技术和肽扫描这2种方式，开展了1N8单抗的抗原表位研究。其中噬菌体展示随机肽库鉴定结果未能找到合适的抗原表位多肽，可能是因为序列缺乏同源性的模拟肽，肽库的多肽与抗体亲和力较差所致。因此我们又开展了肽扫描筛选抗原表位的研究，通过合成的38条多肽，结果成功筛选到了1N8单抗的抗原表位。N蛋白是CDV占比最大的蛋白，其抗原表位的获得具有非常重要的意义：抗原表位的解析有助于抗原结构的理解，能够明晰抗原和抗体相互结合的最小单位，以及抗原与宿主免疫系统相互作用的深入分析。那么由于N蛋白抗体能在CDV感染早期出现，那么N蛋白抗原表位将来会在CDV的诊断中扮演一个重要的角色。3.3.2麻疹病毒属N蛋白抗原表位分析在本研究中，筛选到了一个新的CDVN蛋白B细胞抗原表位。通过蛋白质氨基酸序列比对，其在麻疹病毒属N蛋白的序列中是相对保守的，与CDV同属麻疹病毒，牛瘟病毒，小反刍兽疫病毒一致。这点结论与引言中所描述的N蛋白1-400位氨基酸为保守区一致，而本研究筛选到的抗原表位，在360位氨基酸附近，因此与麻疹病毒属其他病毒抗原表位相同。虽然制备单抗多用到的蛋白终点471位，但是N蛋白第400以后的序列，是属于CDVN蛋白的内部，并未暴露在蛋白表面，因此很难形成抗原递呈的B细胞表位。我们从N蛋白模拟3D图中，可以发现351359NFGRSYFDP为蛋白的外侧，更容易与抗体结合。在本研究中，筛选到了一个新的CDVN蛋白B细胞抗原表位，其最小识别单位是351359351NFGRSYFDP，在该肽段中，351位的N是最为关键的氨基酸。因为含有N的合成肽15351可以与单抗1N8反应，而不含N的合成肽16不能与单抗1N8反应。同时，我们在做表位的精351细定位时，不含N的肽段1N8-4也不能与单抗1N8反应。因此CDV的第351位氨基酸N是单抗1N8最为重要的识别氨基酸，当然，它也是整个CDVN蛋白诱导机体产生抗体重要的位点。32 中国农业科学院博士学位论文第三章筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)B细胞表位351359由于麻疹病毒属内的各种病毒N蛋白非常保守，NFGRSYFDP均能出现。本研究结果为麻疹病毒属病毒N蛋白的抗原结构及其在免疫应答中的功能，以及为诊断方法的建立奠定了基础，也有利于开展表位疫苗的研制。33 中国农业科学院博士学位论文第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定摘要：单链抗体（singlechainantibodyfragment，scFv）是一种微小的基因工程抗体，它包含抗体重链和轻链的可变区和一段链接肽。目前来说，单链抗体是动物体内清除病毒的强有力的治疗型工具；也能作为一种非常经济而且容易获得的诊断试剂组件。根据上一章节的研究结果，本章节使用分泌抗CDVN蛋白的杂交瘤细胞1N8为模板，分离出其抗体轻链和重链可变区，通过基因工程的方式组装成单链抗体表达载体，通过原核表达，获得了重组1N8单链抗体蛋白，经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测，其具备1N8单抗的部分活性：能与CDV结合并能阻断1N8单抗与N蛋白结合。本研究为未来CDV的新型诊断试剂和治疗试剂奠定了基础。关键词：1N8单抗，抗体可变区，单链抗体基因工程抗体是指继多克隆抗体和单克隆抗体之后第三代抗体，其优点是制备快速、成本低、产量大，为抗体检测技术提供了高质量的抗体（王耘，2012）。单链抗体(singlechainvariablefragment,scFv)是一种小分子抗体，由于低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点被广泛应用于医学诊断、治疗的研究。目前国内外利用针对CDV病毒的scFv进行免疫检测的研究鲜见报道（赵蕾，2011），在此背景下，本论文体外分离出单克隆抗体可变区基因，通过原核表达，获得了重组1N8单链抗体蛋白，经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测，其具备1N8单抗的部分活性。为未来CDV的新型诊断试剂和治疗试剂奠定了基础。4.1材料与方法4.1.1细胞与菌株分泌抗CDV单抗的杂交瘤细胞1N8由实验室保存，并在上一章节进行了描述；表达菌株EscherichiacoliBL21（DE3）plysS购自北京全式金公司。原核表达载体为pET32a，由实验室保存。4.1.2主要实验试剂Ni-NATHis-BindResin、ExTaq酶、限制性内切酶、dNTPs、DNAMarker购自北京全世金公司；反转录试剂盒、羊抗鼠HRP标记二抗、His单克隆抗体、小量胶回收试剂盒购自北京康为世纪公司；T4连接酶、TrizolRNA提取试剂、购自invitrogen公司。4.1.3引物设计参照参考文献（zhuetal.,2013）和Blast抗体数据库的统计资料用Oligo6.0软件设计扩增杂34 中国农业科学院博士学位论文第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定交瘤细胞1N8的VH和VL基因的引物，引物的Tm值可用如下简化公式计算：Tm=(G+C)+2(A+T)或用软件根据更精确的方法计算。引物的5’端加上KpnIandXhoI限制性内切酶位点，为了连接VL和VH基因，我们在VL和VH的3’端和5’端设计了一段高柔性的Linker，其氨基酸序列为SSGGGGSGGGGS。其引物相关信息见表。表4.1.MAb1N8可变区扩增引物Table4.1PrimersforVHandVLGenesofMAb1N8IgChainsPrimernamesPrimersequencesVH1N8VH-F5’gcGGTACCsaggtsmagctgcagsagtcwgg3’1N8VH-R5’cgagccgccacctccagagccacctccgcctgaggagactatgagagtgg3’VL1N8VL-F5’ggcggaggtggctctggaggtggcggctcggayattgtgmtsacmcarwctmca3’1N8VL-R5’cgCTCGAGttatttgatttccagcttgg3’S=G/C,R=G/A,K=G/T,M=A/C,Y=C/T,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/T/G/C.注：根据（WebServerissue）:W503-8设计引物IMGT/V-QUEST:thehighlycustomizedandintegratedsystemforIGandTRstandardizedV-JandV-D-Jsequenceanalysis.4.1.4杂交瘤的RNA提取，cDNA合成和基因扩增杂交瘤细胞1N8的总RNA由Trizol试剂提取，其方法常见Trizol说明书或者上一章节的描述，cDNA合成使用SuperRTcDNAKit，以提取的RNA为模板，Oligo(dT)15作为反转录引物，反转录体系为25µL，过程见附录3（反转录体系和程序）4.1.5单链抗体scFv/1N8gene的合成使用纯化后的VH和VL基因为模板，采用SOE-PCR的方式将2段基因连接起来，连接含有Linker，50µL体系中含有100ng纯化后的VH和VL基因。VH和VL的PCR扩增体系和PCR程序见附录3（反转录体系和程序）。4.1.6原核表达重组质粒的构建pET32a-scFv/1N8重组表达载体构建，scFv/1N8基因片段和pET32a空载体的酶切及胶回收，用KpnI和XhoI对载体和目的片段进行双酶切，附录3（载体酶切和连接）。转化：加连接产物20μL加入融化后的BL21（DE3）plysS感受态菌液中，冰浴30min，取出后加入到42℃水浴中热击90s，接着继续冰浴3min。加入750μLLB，37℃200r/min活化培养1h，待细菌完全活化后，将其均匀的涂布于含有Amp抗性的LB琼脂培养基上，温箱过夜培养，第二天挑取单个菌落，鉴定正确后即为pET32a-scFv/1N8重组质粒。pET32a-scFv/1N8重组表达质粒经过质粒小量提取试剂盒提取后，将PCR鉴定为阳性的重组质粒，重新活化，将含有10%-20%甘油的菌液送往上海生物工程有限公司测序。35 中国农业科学院博士学位论文第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定4.1.7单链抗体基因的序列比对分析测序比对后，开展单链抗体基因的序列分析，找出抗体基因的框架序列frameworkregions（FR）和互补决定区complementaritydeterminingRegions(CDR）。scFv/1N8基因比对使用的是IMGT/V-QUESTprogramv3.3.1oftheinternationalimmunogeneticsinformationsystem(availableatwww.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes）4.1.8单链抗体的表达选取测序正确的BL（DE3）pLysS表达菌株，按1:100接种于新鲜Amp+LB培养基中，大量培养至细菌生长对数期，此时加入IPTG诱导表达，IPTG的终浓度为1.0mmol/L，继续培养至6-10h，于4℃离心收集细菌培养物，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。蛋白包涵体的提取：将离心后的细菌培养物，用PBS悬起，并再次6000r/min离心，反复重复此程序3次，之后超声破碎细菌细胞壁，释放菌内蛋白，超声处理30min，间隔10s，直到细菌澄清，悬液趋于透明。将超声后的细菌液6000r/min离心，取沉淀，该沉淀即为体外表达的重组蛋白。加32mL包涵体裂解液即含有1%TritonX-100和磷酸盐的8M尿素，12000r/min离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为提取的包涵体蛋白，可以进行蛋白纯化。4.1.9重组蛋白的纯化吸取5mLNi-NTA琼脂糖加入到10mL纯化柱中，通过重力使Ni-NTA琼脂糖完全沉淀，添加6mL去离子水并轻轻反复颠倒重悬Ni-NTA琼脂糖。根据1.5mLNi-NTA琼脂糖捆绑蛋白的能力和蛋白样品中蛋白浓度，计算蛋白样品最大上样体积。加入pET32a-scFv/1N8蛋白表达包涵体，轻轻震动以确保Ni-NTA琼脂糖悬浮于蛋白样品中，孵育30～60min。通过重力使Ni-NTA琼脂糖完全沉淀，用8mLWashBuffer重悬琼脂糖，将未结合的杂蛋白洗净，重复冲洗3次后，加入Elutebuffer溶解结合的His标签蛋白，收集后即为蛋白纯化液，保存于4°C用于SDS-PAGE分析。4.1.10重组蛋白的复性重组蛋白的复性采用PH值和尿素梯度降低的方法，参考S.Dübeletal.1992的方法。简述如下：使用透析袋将蛋白的pH梯度变化至pH（6-8.5），并将尿素的浓度梯度降低为urea(4-1M），复性的Buffer中包含0.01MPBS和0.5mMarginine，最终复性后的蛋白含有1M尿素和0.01MPBS。4.1.11蛋白浓度的测定采用Bradford法测定蛋白浓度：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取10µL样品，加入100µL2×Bradford染色液和90µL的去离子水，混匀后放置5-10min，然后以不含任何蛋白的去离子水为对照，测定样品吸收值A595。根据已知的标准蛋白浓度曲线，测算样品蛋白的浓度。36 中国农业科学院博士学位论文第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定4.1.12单链抗体活性检测分别采用间接法ELISA和竞争法ELISA检测单链抗体活性。间接法ELISA采用稀释后（pH9.6）的CDV抗原包被ELISA板，采用5%脱脂牛乳封闭过夜后，加入倍比稀释后的复性单链抗体，结合1h后，PBST洗3遍；加入1：2000稀释后的anti-HisTag单克隆抗体，结合1h后，PBST洗3遍；再加入1：5000稀释后的HRP-goatanti-mouseIgG二抗，结合1h后，PBST洗3遍；使用TMB显色液最终获得OD值。竞争法ELISA检测，使用采用稀释后（pH9.6）的重组的CDVN蛋白包被ELISA板，采用5%脱脂牛乳封闭过夜后，加入倍比稀释后的50µl复性单链抗体和1N8单抗，混合作用1h后，PBST洗3遍，并设立只加1N8单抗的对照；加入1：5000稀释后的HRP-goatanti-mouseIgG二抗，结合1h后，PBST洗3遍；使用TMB显色液最终获得OD值。4.2结果4.2.1scFv/1N8gene基因的扩增结果使用杂交瘤细胞1N8的cDNA作为PCR模板，扩增出其VH和VL基因，大小约为400bp。SOE-PCR将VH和VL连接成为一段基因，其大小约为750bp。图4.1scFv/1N8gene基因的扩增结果Figure4.1scFv/1N8genePCR注：M，DNA分子量标准；1，VH基因；2，VL基因；3，PCR-SOEscFv4.2.2scFv/1N8gene基因的序列分析序列分析显示我们克隆到了scFv/1N8的轻链和重链的3个FR区域和3个CDS区域，其序列信息显示在Tab4.2中，scFv/1N8基因的重链显示与（Genbankaccessionno.NC_000078.6）的相似度最高，达到86%；而scFv/1N8基因的轻链显示与（Genbankaccessionno.AC_000028.1）相似度最高，达到96%。37 中国农业科学院博士学位论文第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定4.2.3scFv/1N8重组蛋白的表达与纯化scFv/1N8基因被构建到了原核表达载体pET32a中，在诱导表达后发现，该蛋白得到了高效表达，其分子量大约为43kD，重组蛋白使用HisResin纯化后，得到了较为纯净的scFv/1N8蛋白。图4.2scFv/1N8重组蛋白的表达与纯化Figure4.2scFv/1N8expressionandpurification注：1，scFv/1N8未诱导对照；2，scFv/1N8诱导对照；M，蛋白分子量标准；3-11，不同浓度咪唑纯化流出液4.2.4scFv/1N8重组蛋白的活性检测间接ELISA显示，随着scFv/1N8蛋白浓度的提高，其与CDV抗原的结合力也在逐渐提高，提示scFv/1N8蛋白能与CDV发生反应，而通过竞争ELISA实验，随着scFv/1N8蛋白浓度的增加，其抑制单抗1N8的能力是增强的，显示出scFv/1N8蛋白具备单抗1N8的部分活性，可以与其竞争CDV抗原。图4.3scFv/1N8重组蛋白的活性检测Figure4.3scFv/1N8activedetection38 acYtccccatcgQQFTSSPSgcaagacacgctgcctactcacttgactARHAAYSLDcagcagtttactagtatttctgtagcatggc的单链抗体制备与鉴定SMAGEDAATYYCMELSTLTPEDSAAYFC1N8gggtgaagatgctgccacttattactgcaagtacaatgaaaaattcaaggacaaggccacattgactgcggacaaatcctccaccacagtctatatggagcttagtacattgacacctgaagactctgcggcctKYNEKFKDKATLTADKSSTTVYaacctggctcctggagtcccagctcggttcagtggcagtgggtctgggaactcttattccctcacaatcagtNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTIS基于杂交瘤细胞HTScacacatccttttaccctggaagtggtactataFYPGSGTI第四章39EWIGWKLWIYgtggattgggtggactgtggatttat表4.2MAb1N8抗体可变区基因克隆attcactggataaagcagaggtctggacagggtcttgaIHWIKQRSGQGLatatactggtaccagcagaagtcagatgcctcccccaaIYWYQQKSDASPcTable4.2.SequenceAnalysisofGenesVLandVHofMAb1N8tgagtatattSSVKYGYTFTEYIggctacaccttcactcaagtgtaaaata中国农业科学院博士学位论文gcttctggccagtCGGCTCGASVKLSCKASERVTMSCRASaaggtccagctgcagcagtctggagctgggctggtgaaacccggggcatcagtgaagctgtcctgcaagKVQLQQSGAGLVKPGTCCTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGgaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctgggggagagggtcaccatgagctgcagENVLTQSPAIMSASLGntFR1CDR1aaFR2CDR2aaSSGGGGSGGGGSFR1FR3CDR1aaCDR3FR2CDR2FR3CDR3VHntLinkerVLnt 中国农业科学院博士学位论文第四章基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定4.3讨论4.3.1CDV单链抗体的研究CDV单链抗体一般是由CDV的杂交瘤细胞分离抗体的可变区后经过组装形成；与本研究方法一致，而且能进一步鉴定单抗的基因信息。另外也能通过构建抗体可变区文库而获得。目前单链抗体主要应用与病毒治疗制剂的开发（陈继军等，2013），因此本研究根据抗CDV病毒1N8杂交瘤细胞开展了可变区的克隆以及原核表达制备单链抗体，虽然单链抗体无病毒中和活性，但是其具备与CDV反应能力，可以作为诊断制剂使用，也能取得良好的效果。4.3.2CDV单链抗体的构建方式CDV单链抗体的构建方式主要分为原核表达和真核表达，其中原核表达表达量大，是一种十分经济的做法；而真核表达量低，但是抗体活性来说，真核因为有糖基化过程，其活性比原核要好。目前工业化大规模生产的单链抗体已原核表达为主；其次，单链抗体的构建是通过连接抗体轻链可变区和重链可变区形成，因此，有2种构建模式，一种是HL连接，一种是LH连接，我们这次采用的是HL连接。原核表达单链抗体最具活性的是可溶性低温表达，能具备重组蛋白的部分空间结构和活性，其亲和力较高。其次单链抗体的性质与杂交瘤原始模板相关性高，其分泌单抗的亲和力是单链抗体的上限，且抗体可变区决定了单链抗体抗原-抗体结合能力。本研究克隆获得的抗体可变区包含CDR1、CDR2、CDR3和FR1、FR2、FR3，由于扩增引物的原因，未能扩增到完整的FR4，但是根据上述基因片段构建的单链抗体已经产生了足够的反应能力，可以用作于CDV的诊断。4.3.3CDV不同蛋白单链抗体的未来展望CDV的N蛋白、H蛋白和F蛋白是制备单抗的主要靶蛋白，其中N蛋白的单抗最容易获得，OrvellC等（1985）采用纯化后的CDV病毒免疫，获得的149株单抗中，抗N蛋白的有57株，占1/3以上，而抗H蛋白的最少，仅为9株。但是HirayamaN等研究（1991）证实抗H蛋白的单抗能提供CDV完整的保护效果，因此，CDV治疗型单抗最好能筛选到抗H蛋白，并以此作为模板制备经济效益高的单链抗体，具备很强的应用前景。但是，根据CDV的DNA疫苗试验研究结果可知，含有N基因的DNA疫苗比仅含H基因和F基因的疫苗能提供机体更好的保护力。因此，N基因也许在某种程度上，也可以提供一定的病毒抗原中和能力。因此本研究开展了N蛋白单抗的筛选和单链抗体的研究，虽然1N8单抗并无病毒中和能力，但是在抗原/抗体结合力方面，具备类似的效果。可以说也达到了预期的结果。40 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究351359第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究351359摘要：将连接犬瘟热病毒N蛋白表位NFGRSYFDP的犬细小病毒VP2基因全长eDNA(1755bp)插入到腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP，成功构建pAd-N-VP2重组质粒，经PmeI酶切线性化，采用电击法转入到已含Ad-Easy质粒（腺病毒骨架）的电感受态菌BJ5183进行重组。挑选同源重组质粒，PacI酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒，荧光检e测有绿色荧光蛋白表达。经PCR鉴定，pAd-N-VP2重组病毒包含VP2和CDVN表位基因。利用细小病毒多抗检测重组病毒的反应原性：与对照相比WB结果显示VP2蛋白表达条带。将重组病毒免疫小鼠，分时段采取血清测定CDV和CPV效价，结果显示重组病毒与传统疫苗相比，显示出类似的抗体提升趋势，而且CPV抗体ELISA效价几乎与疫苗相当，显示出重组病毒作为CPV疫苗的良好潜力，为以后进一步研究展示犬瘟热表位的细小病毒样颗粒疫苗提供了新途径，研究开发前景潜力巨大。关键词：CDV表位疫苗，腺病毒表达系统，细小病毒VP2基因犬瘟热和细小病毒肠炎是我国毛皮动物的2大重要传染病，也是疫病防控的重点和难点，每年都造成巨大的经济损失。CDV的N蛋白在病毒复制和病毒装配中起重要作用，细小病毒的VP2蛋白是重要的核衣壳保护性蛋白，并能形成病毒样颗粒，本研究利用Adeasy腺病毒表达系统构351359建含犬瘟热病毒N蛋白表位NFGRSYFDP的细小病毒VP2蛋白，并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。以期更好地发挥N蛋白表位作用和VP2蛋白病毒样包装颗粒作用,为CDV和细小病毒的基因工程疫苗的研究开辟新的途径。5.1材料与方法5.1.1腺病毒表达载体和试剂腺病毒表达系统pAdEasy（包括穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP和腺病毒骨架AdEasy-1）和大肠杆菌BJ5183由购自Stratagene公司。转染用293-HEK细胞购自上海细胞库，无类毒素质粒试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶PmeI和PacI，T4DNA连接酶，DNAMarker，转染试剂Lipofectamine2000均购自上海Invitrogen公司。昆明鼠购自长春生物制品所。携带VP2基因的质粒pMD-VP2由本实验室保存。转染试剂为罗氏公司的FuGENEHDTransfectionReagent。5.1.2含目的基因(表位+VP2)的PCR扩增外源基因扩增模板为实验室保存的pMD-VP2基因质粒，合成包含CDVB细胞表位的引物，扩增连接到VP2基因上游，下划线部分为CDV表位基因，PCR扩增体系和程序见附录。Up：GGTGGATTGAATTTCGGTCGTTCTTACTTCGATCCTGCTTATTTCATGAGTGATGGALow：CTAGCCCTAGAAAAATTATATATAA41 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究5.1.3含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建将扩增到的目的基因双酶切后连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP中，构建使用引物中包含的内切酶SalI和XhoI，将PCR产物和穿梭质粒酶切回收后，使用T4连接酶得到包含目的e基因的重组穿梭质粒pShuttle-N-VP2，经PCR鉴定正确后备用。5.1.4重组腺病毒载体菌内重组鉴定e取pShuttle-N-VP2质粒经PmeI酶切完全线性化后，电转化感受态BJ5183菌(已含有AdEasy-1载体)进行同源重组。电转方法参见（杨洋，2013；刘红玉，2013），其条件参数为：将电转杯放在Bio-Rad仪器上用200ohms、25uF、2.5KV脉冲电流电击一次，将电击后的菌株活化接入含卡那霉素的平板中。挑选阳性克隆碱裂法提取质粒，其中大质粒为可能阳性克隆。进一步酶切鉴定：以PacI酶切鉴定，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb）,及一条小片段（约3.0或4.5kb）。取5μL阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为低拷贝且容易发生重组，DH5α为复制缺陷型，e可以稳定复制），扩增细菌并纯化质粒，将得到的重组腺病毒质粒分别命名为pAd-N-VP2，将鉴定正确的质粒放置-80℃冰箱备用。5.1.5重组腺病毒质粒转染HEK293细胞e将鉴定正确的pAd-N-VP2质粒大量提取后，经PacⅠ单酶切线性化腺病毒基因组，经过纯化后将基因组转染至HEK-293细胞中，转染前确保细胞生长70-80%左右，转染采用罗氏公司的FuGENEHDTransfectionReagent试剂，其操作见说明书。将转染后的细胞放入37℃CO2培养箱中培养，每隔2d换一次培养液。转染过程中脂质体与质粒比例约为9：2。5.1.6重组腺病毒滴度（TCID50）的滴定将重组腺病毒按0.1%比例接种HEK293细胞，并按照此方法连续传代，由于该重组腺病毒中带有GFP标签，因此可以通过观察不同稀释孔中产生荧光的最高稀释倍数测定其TCID50。5.1.7重组腺病毒的形态学观察重组腺病毒冻融液取500μL，于5000rpm离心15min，弃掉上清，用残留的上清液重悬沉淀（刘红玉，2013），进行负染电镜观察，放大倍数为40000倍。5.1.8重组腺病毒的PCR鉴定重组腺病毒的F2-F5代冻融液各取100μL，于沸水中煮沸5min，离心后取上清液提取总DNA，另设HEK293细胞对照，用作PCR鉴定的模板，引物序列如下：Ad-VP2-F5’ATCTGCTAGAGATTGTTGGT3’Ad-VP2-R5’TTGACAGTCTAGAGACTTGA3’42 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究5.1.9重组腺病毒的WB鉴定重组病毒蛋白样品的制备：将病变完全的重组腺病毒冻融3次后，离心后取沉淀，沉淀中含有大量蛋白，煮沸变性后形成蛋白样品。将重组病毒蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转印到NC膜上，利用CPV血清作为检测一抗，检测重组病毒表达VP2蛋白的能力。由于重组腺病毒表达量不确定，因此WB检测时应用浓缩纯化后的重组腺病毒蛋白，确保所有蛋白组分均能检测到，而且我们也设立了未变性的蛋白对照。5.1.10重组病毒免疫小鼠实验7将昆明小鼠随机分为2组，每组5只，试验组小鼠分别肌肉注射100μL/只（10TCID50/ml）剂量的重组腺病毒，对照组小鼠肌肉注射商品化（英特威）犬瘟热、细小病毒二联活疫苗（免疫1/10dose每只），各组小鼠分别与7d，14d，48d采血测定CDV和CPV的ELISA效价。其中自制的ELISA包被纯化后的CDV和CPV病毒（对应检测血清），包被后用2%BSA封闭；检测血清ELISA效价时，检测血清按100倍、200倍、400倍等稀释度倍比稀释；之后加入酶标二抗和显色剂显色，相关操作方法见第二章间接ELISA试验。5.2结果5.2.1PCR扩增结果PCR扩增获得携带CDV抗原表位的基因，大小约为1800bp,电泳图显示出其大小位于2000bp下，基本与预计大小相同，测序后比对，本次扩增的PCR产物正确，确定已经携带了CDV抗原表351359位NFGRSYFDP。12M图5.11.5%琼脂糖凝胶电泳图M:Trans2KPlusIIDNAMarker（5μl）Lane1：PCR产物结果（5μl），Lane2：对照（2μl）5.2.2含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建结果将目的基因纯化回收双酶切后，连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP上，获得的阳性43 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究质粒通过PCR检验其与设计的条带大小相吻合，测序后确定真核表达载体构建成功。123456789M图5.21.5%琼脂糖凝胶电泳图M:Trans2KPlusПDNAMarker（5μl）Lane1-9：重组质粒PCR结果（5μl）5.2.3重组腺病毒的包装腺病毒骨架质粒和重组穿梭质粒在细菌BJ5183内同源重组后，提取重组质粒，经过纯化和去内毒素后，酶切形成腺病毒基因组，之后转染293细胞包装出毒，转染后6天，转染孔细胞开始出现腺病毒典型细胞病变（噬斑样），并且细胞逐步死亡，正常HEK293细胞没有病变。由于表达盒带有hrGFP标签，成功包装的腺病毒中能在荧光下发出绿色荧光，见下图。AB图5.3转染293HEK细胞成功后hrGFP标签发出的绿色荧光Fig.5.3AppearanceofGFPonHEK293cellaftertransfectionA：重组腺病毒（100×）B：293HEK对照（100×）5.2.4重组病毒滴度（TCID50）的测定将重组病毒的按照10倍倍比稀释接入96孔板中的HEK293细胞，连续观察5d记录不同梯7.0度细胞病变情况和荧光蛋白表达情况，计算病毒滴度（出现荧光）均可达到10TCID50/ml以上。44 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究5.2.5重组腺病毒的电镜观察重组腺病毒经过纯化收集后，去上清进行负染电镜观察，可见典型的腺病毒特征，见图5-4。图中可见典型的腺病毒20面体结构，但是由于放大倍数的原因，无法观察到腺病毒表达内的VLP蛋白，可能需要特殊的染色才能达到目的。图5.4重组腺病毒电镜观察（40000×）Fig5.4Observationofrecombinantadenovirusbyelectronmicroscope(40000×)5.2.6重组腺病毒的VP2基因PCR结果对重组病毒开展腺病毒稳定性试验，取纯化后的腺病毒，提取其核酸用作PCR的模板，用设计的鉴定引物Ad-VP2-F和Ad-VP2-R进行PCR扩增，可见预期片段大小的扩增片段（651bp）。重组病毒的不同代次（2-5代）均能检测是VP2基因，说明其已经稳定整合到腺病毒基因组中，见下图。M12345750bp图5.5重组腺病毒PCR鉴定Fig5.5therecombinantadenovirusesbyPCRM:分子量Marker；1：第2代重组病毒；2：第3代；3：第4代；4：第5代；5：293HEK对照45 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究5.2.7重组腺病毒的Westernblot检测Westernblot显示，经重组腺病毒感染的HEK-293细胞制备的蛋白样品，可见约64KD的目的条带，与文献报道的VP2蛋白大小相符，而HEK-293细胞阴性，对照组未见该条带，说明重组病毒可以表达CPVVP2蛋白。12M64kD图5.6重组病毒WB鉴定64kDFig5.6VP2proteinexpressionanalysisoftherecombinantadenovirusesbyWesternblot1:293细胞对照；2：重组腺病毒；M：marker5.2.8重组腺病毒免疫小鼠后CPV抗体效价用ELISA试验评价小鼠在免疫后不同时间点血清ELISA抗体的水平。其中ELISA抗原为纯化后的CPV病毒。结果如图5.7所示。实验组和对照组CPV抗体提升趋势几乎相同，免疫48d后，重组病毒的抗体效价超过了商品化疫苗。CPVELISA效价测定2.5商品化疫苗免疫7天2.0重组腺病毒免疫7天商品化疫苗免疫14天1.5重组腺病毒免疫14天商品化疫苗免疫48天OD4501.0重组腺病毒免疫48天0.50.000000000012004800204160036128Dilution（X）图5.7小鼠在免疫后不同时间点血清ELISA抗体Fig5.7ThetitersoftheELISAantibodyagainstCPVintheserumofthevaccinatedmice5.2.9重组腺病毒免疫小鼠后CDV抗体效价用ELISA试验评价小鼠在免疫后不同时间点血清ELISA抗体的水平。其中ELISA抗原为纯化后的CDV病毒，结果如图5.8所示。实验组与对照组相比，CDV抗体提升趋势不明显，但是46 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究免疫48d后，重组病毒也产生了一定的CDV抗体ELISA效价。商品化疫苗免疫7天CDVELISA效价测定重组腺病毒免疫7天0.8商品化疫苗免疫14天重组腺病毒免疫14天0.6商品化疫苗免疫48天重组腺病毒免疫48天0.4OD4500.20.000000000000000124862413612800Dilution（X）图5.8小鼠在免疫后不同时间点血清ELISA抗体Fig5.8ThetitersoftheELISAantibodyagainstCDVintheserumofthevaccinatedmice5.3讨论5.3.1腺病毒载体的优势本研究选用的是第三代复制缺陷型人5型腺病毒载体（殷秀辰，2013），重组病毒能感染几乎所有的哺乳动物细胞系，但是不能复制新的病毒粒子,仅能在表达E1蛋白的293细胞系中复制增值。因此，该重组病毒在安全性上具备优势，目前在北美市场已有商品化的腺病毒重组动物疫苗出售，而且至今未有重组病毒免疫后动物感染的报道。商品化的腺病毒载体采用同源臂重组的方式构建感染质粒，分为腺病毒骨架（缺失E1和E3区域）和含有同源臂的穿梭质粒。本研究中的穿梭质粒带有GFP标签，包装成功后能发出绿色荧光，易于观察鉴定。而且本实验利用BJ5183细菌作为操作场所，在菌内将穿梭质粒和腺病毒骨架重组，比转染293进行同源重组简单。腺病毒表达体系是目前优良的真核表达载体，以其安全性好、表达量高而广泛应用，可经口服等多种途径感染靶动物。目前在动物基因工程疫苗中已有广泛的应用，如猪流行性腹泻、高致病性蓝耳病、猪瘟、猪流感等，它为动物新型疫苗的研发提供了一个全新的视角。5.3.2CPVVP2基因的VLP特征VP2基因是CPV病毒的主要结构基因，全长1755bp，其中TA含量较高，结构复杂。据报道，VP2基因在大肠杆菌中表达能形成低分子量形式（64kD，45kD和34kD）；而在昆虫表达系统中能形成病毒样颗粒（XuJetal.,2014），在腺病毒表达体系中，已有VP2基因表达成病毒样颗粒的报道。本研究中，在电镜观察中无法确定病毒样颗粒是否存在，但是在小鼠免疫中，重组病毒的CPVELISA效价提升很快，基本达到了商品化疫苗的水平。说明在腺病毒体系下表达效率高，刺激机体产生与自然病毒感染相近的免疫效果。47 351359中国农业科学院博士学位论文第五章CDVNFGRSYFDP表位疫苗研究目前从文献中可知：猪细小病毒（PanQ,2012）、猪流行性腹泻病毒（焦茂兴等，2012）均能在腺病毒中形成VLP（或其他形式），也证明了腺病毒表达载体良好的外源基因表达能力和保真性。5.3.3CDV表位疫苗CDV的N蛋白是核蛋白，一般认为其在CDV的诊断中具有优势，目前已证明针对N蛋白的抗体IgG能在CDV感染早期检测到。本研究首次开展了CDV表位疫苗的研究，将CDV表位插入到VP2基因的上游，成功在腺病毒中表达，小鼠免疫显示，其能产生一定的CDVELISA抗体，而将其应用疫苗临床免疫，还需要筛选出反应更好、更加合适的CDV抗原表位。根据CDV不同基因核酸疫苗的免疫效果推测，H基因能显示出更好的免疫源性和诱导机体产生保护性抗体的能力。而且CDV病毒的细胞免疫也在机体保护作用中起到一定的作用，那么未来本研究对未来研究CDVT细胞表位疫苗也有重要的意义。在本研究中，N蛋白表位免疫后经过48天，CDV的ELISA效价得到了提升，虽然效果不明显，但是本实验采用的是单次不加佐剂免疫，因此，通过优化改造其免疫程序后，应该会有更好的表现。48 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析摘要：犬细小病毒肠炎是由犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）引起的一种以肠炎和腹泻为主要症状的急性传染病，与水貂肠炎细小病毒有着相似的症状。为了分析我国CPV流行毒株的分子生物学特征，了解其遗传演化规律，查明中国目前CPV流行毒株现状，在本研究中，历经4年，收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份，分离病毒8株，获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份，荧光定量分析确定粪便中CPV含量最高，基因分析可知CPV-2a型20份，CPV-2b型2份，并存在CPV-2a(Ser297Ala)变异。本研究中的犬细小病毒VP2基因与国内参考毒株的序列相似度为99.3-99.9%。系统发育树证明大多数CPV毒株为一个大的分支中与泰国KU143-09株类似，且各个城市之间分散分布。关键词：犬细小病毒，VP2基因，遗传变异犬细小病毒肠炎是一种急性、高感染性传染病，以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征，具有感染率高、发病急、病程短和病死率高等特点。该病毒于1978年首次发现，并且在世界范围内迅速流行。为区别于非致病性犬微小病毒（Minutevirusofcanine,MVC），将这种病毒命名为CPV-2。犬细小病毒（CPV）基因型可分为CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c(a/b)，CPV-2c型，VP2蛋白是犬细小病毒主要的衣壳蛋白并在免疫应答中起重要的作用，CPV和FPV在VP2蛋白上的几个氨基酸位点上的差异决定了两种病毒在犬、猫体内或其细胞培养物上复制能力的区别。本项研究在初步调查我国主要城市的犬细小病毒流行情况的基础上，系统性地分析犬细小病毒VP2基因变异状态，并且参照犬细小病毒参考毒株进行相互比较分析，探索我国犬细小病毒的流行趋势。另外，本研究对我国流行CPV的VP2基因突变的氨基酸位点进行了归纳，总结了VP2基因内同义突变和非同一突变的状况，并开展了CPV的VP2基因系统进化与地理位置相关性研究，为更好的预防和控制犬细小病毒提供基础。6．1材料与方法6.1.1菌株、载体和试剂大肠杆菌JM109由中国农业科学院特产研究所人兽共患病实验室保存。pMD18-T载体、dNTPs、Ex-Taq酶、EcoRΙ、SalⅠ、RsaⅠ限制性内切酶均为大连宝生物公司产品；凝胶回收试剂盒购自天根生化公司。SYBRGreenⅠ荧光定量试剂盒购自北京全式金生物公司。6.1.2CPV基因组提取方法如参考文献（Schuncketal.,1995）所述提取CPV临床分离株和商品化疫苗株的DNA。简而言之，各毒株样品用ddH2O稀释10倍后，煮沸10min，从而使病毒粒子崩解而释放病毒DNA。将煮沸后的样品置于冰上冷却，在4°C，2000r/min离心10min。上清液即为病毒DNA提取物并可以直接用作PCR扩增的模板。血液样品DNA提取参考BloodGenminiKit，提取的DNA用无核酸酶的水溶解，-20℃保存。49 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析6.1.3用于CPV毒株遗传进化分析的毒株信息2009~2013年期间在宠物医院收集的犬细小病毒粪便样品。本次研究所用CPV临床样品的背景资料见表6.1，病毒样本来自武汉市、北京市、上海市和南京市的宠物医院，其中以武汉的为主。病毒样品采自病犬的粪便和血液。表6.1犬细小病毒样品信息，包括序列登陆号，收集地和年份Table6.1Detailsofsamplessequenced,placeofcollection,yearofisolationandtheirGenBankaccessionnumbersS.Sampleno./yearofPlaceofcollectionGenBankaccessionNo.collectionnumbersa1CPV1-1/2013WuhanKJ674806a2CPV1-10/2013WuhanKJ674807a3CPV1-11/2013WuhanKJ674808a4CPV1-12/2013WuhanKJ674809a5CPV1-7/2013WuhanKJ674815a6CPV1-8/2013WuhanKJ674816a7CPVsi/2013WuhanKJ674819a8CPVwu/2013WuhanKJ674820c9CPVSH-3/2011ShanghaiJX121627c10CPVSH-2/2011ShanghaiJX121626c11CPVSH-1/2011ShanghaiJX121625b12CPVBJ-2/2011BeijingJX121624b13CPVBJ-1/2011BeijingJX121623c14CPV1-nj/2009NanjingGQ169550b15CPVbj-5/2010BeijingGQ169549b16CPVbj-3/2010BeijingGQ169547b17CPVbj-2/2010BeijingGQ169546b18CPVbj-1/2010BeijingGQ169545a19CPVwh-8/2009WuhanGQ169544a20CPVwh-6/2009WuhanGQ169542a21CPVwh-3/2009WuhanGQ169539a22CPVwh-1/2009WuhanGQ169537aSouthCentralChinabNorthernChinacEasternChina6.1.4CPVPCR扩增根据GenBank上已发表的犬细小病毒疫苗株CPV-15（GenBankID：M24003）和野毒株k001（GenBankID：EU009200）VP2的基因序列，选择VP2基因的保守区域，利用PrimerPremier设计2对引物，其中一对引物用于检测CPV-2，扩增产物的预期长度是469bp，位于VP2基因第50 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析655-1124位核苷酸；另一对引物用于扩增VP2基因的完整编码区，其理论长度是2058bp。检测引物上游（M1）5′-ATCTGAGACATTGGGTTT-3′检测引物下游（M2）5′-TTTCTAGGTGCTAGTTGA-3′扩增引物上游：E1:5'-CATGAGTGATGGAGCAGCTCAA-3'扩增引物下游：E2:5'-AGTTAATAATTTTCTAGGTGCT-3'PCR反应采用25μL体系：10×Buffer2.5μL、dNTPs2.0μL、上下游引物各1.0μL、Taq酶0.5μL、模板2μL、ddH2O16μL。95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，30个循环；最后72℃延伸8min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。6.1.5CPV特异性片段的PCR扩增与RFLP分析使用检测引物特异性PCR扩增检测CPV，采用25μlPCR反应体系，组成如下：前述DNA提取产物2μl；10×Ex缓冲液2.5μl、2.5mmol/LdNTPs2μl、引物上下游（20mmol/L）各1μl,ExTaq0.5μl（2.5U/μl）,用灭菌纯水补足到总体积25μl。PCR反应条件如下:预变性95℃5min；变性94℃45s，复性54℃1min，延伸72℃1min，35循环；终末延伸72℃10min。取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳并在紫外线下观察扩增结果。将引物M1和M2扩增的469bp的PCR阳性片段利用RsaⅠ内切酶消化，酶切体系组成如下：PCR产物4μl，RsaⅠ0.5μl（2.5U/μl），酶切缓冲液1.0μl，添加灭菌纯水至总体积10μl，37℃消化1h。消化产物在1%琼脂糖电泳分析。这种方法用以区分CPV-2a/2b亚型和MEV/FPV/CPV-2/CPV-2c(a/b)等非CPV-2a/2b亚型的犬细小病毒（易立等，2009）。6.1.6CPVVP2基因的克隆使用扩增引物上下游PCR犬细小病毒阳性样品的完整VP2基因。采用25μlPCR反应体系，组成如下：前述DNA提取产物2μl；10×Ex缓冲液2.5μl、5mmol/LdNTPs2μl、引物E1和E2（20mmol/L）各1μl,ExTaq1.0μl（2.5U/μl）,用灭菌纯水补足到总体积25μl。PCR反应条件如下：预变性95℃5min，变性94℃45s，复性54℃1min，延伸72℃2min，35循环，终末延伸72℃10min。取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳并在紫外线下观察扩增结果。PCR扩增产物经DNA回收试剂盒回收纯化后，按照pMD18-T载体（TaKaKa公司）操作手册进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取目的单菌落并提取质粒，用限制性内切酶EcoRΙ和SalⅠ鉴定目的重组质粒。酶切鉴定初步为阳性的克隆质粒送上海Invitrogen生物公司测序。序列数据的排列、转换、分析比较均利用DNASTAR软件数据包进行。6.1.7利用实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV病毒含量利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV的临床样品，应用Premier5.0设计引，目的基因引物和内参基因引物序列如下（仝明薇等，2014）：VP2上游：5′-TCAACCTGCTGTCAGAAAT-3′51 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析VP2下游：5′-AAGTACCCGTAGAAATCCC-3′β-actin上游：5′-GGCTGTGCTGTCCCTGTAC-3′β-actin下游：5′-CCGGAGTCCATCACGATGC-3′对粪便样品进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR相对定量法检测，选用β-actin作为内参基因，并用PBS做空白对照。PCR反应采用20uL体系：2×ULtraSYBRMixture10µL、VP2/β-actin上游引物1µL、VP2/β-actin下游引物1µL、样品DNA模板2µL、ddH2O6μL。95℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环。6.1.8犬细小病毒分离取病料，用DMEM细胞营养液10倍稀释，上下颠倒充分混匀，5000r/min离心20min，取上清，经0.22μm微孔滤膜过滤后，-20℃冻存备用。将处理好的样品按培养液体积的1/10接种于CRFK细胞系（由本实验室保存），同时设正常细胞对照，37℃吸附30min，加生长液继续于37℃、5％CO2条件下静置培养4d-5d，每天观察细胞贴壁生长情况及有无细胞病变（CPE）。如无病变则于培养的第4d-5d收取上清，细胞继续按常规传代培养，至第５代仍无病变视为分离阴性；出现细胞病变的经-20℃/37℃反复冻融３次收毒，置-20℃保存（仝明薇等，2015）。6.1.9犬细小病毒系统发育树的构建使用MEGA5.1软件绘制进化树，基于Neighbor-joining法构建种系发生树，采用bootstrap=1000trails验证。本研究分析了22株犬细小病毒参考毒株的序列资料，各毒株的编号和GenBank登录号见表6.1。6.2试验结果6.2.1样品中细小病毒的常规PCR鉴定CPV样品DNA常规PCR鉴定显示：5号、6号及12号为阴性；其余样品均为细小病毒阳性，结果如图6.1。500bp图6.1常规PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果Figure6.1ConventionalPCRproduction'sgelelectrophoresis6.2.2犬细小病毒RFLP分析对于PCR检测CPV469bp片段为阳性的全部病毒样品，用RsaⅠ内切酶消化各样品的PCR52 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析扩增产物（易立等，2008）。消化产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，作为对照的猫细小病毒样品产生两条弥散条带，大小分别是约370bp和50bp，而犬细小病毒样品则相应地产生三条弥散条带，大小分别是约220bp、150bp和50bp，结果显示：本次试验所有的犬细小病毒为CPV-2a/2b亚型，部分结果见图6.2。M12345678910←220bp←150bp←50bp图6.2犬细小病毒RFLP分析结果Figure6.2RFLPanalysisofPCRfragmentfromCPV469bp-PCRdetection.注：M，DL2000，1，猫细小病毒酶切片段；2-10，CPV-2a/b酶切片段5.2.3犬细小病毒病毒分离将采集的病料接种于CRFK细胞，应用同步接毒和带毒传代的方法分离犬细小病毒，与正常细胞相比，CPV病毒在细胞连续传代3次即出现明显CPE，表现为细胞肿胀变大，细胞融合成圆形或椭圆形大融合细胞，细胞间隙变大并成“拉网状”（见图6.3）。图6.3正常CRKF细胞（a）和CPV在CRFK细胞上的细胞病变（b）Figure6.3NormalCRFKcells(a)andCPEofCPVisolateinCRFKcells(b)6.2.4犬细小病毒VP2基因的克隆使用扩增引物PCR犬细小病毒阳性样品的完整VP2基因。将阳性PCR产物回收并克隆到pMD18-T载体（TaKaKa公司）上，经过EcoRΙ和SalⅠ双酶切重组质粒，得到约2700bp（pMD18-T载体）片段和2058bp（VP2基因）片段，证实VP2基因克隆成功，部分结果见图6.4。53 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析M1M212345bp5000→2500→←2700bp←2058bp图6.4犬细小病毒VP2基因克隆酶切鉴定Figure6.4TheidentificationofrecombinantplasmiddigestedbySalⅠandEcoRⅠ注：M1，M2：DNAMarker，1-5克隆样品6.2.5实时荧光定量PCR相对定量方法测定细小病毒载量对临床样品进行实时荧光定量PCR检测结果显示，荧光定量PCR检测准确率达100%。粪便中细小病毒含量明显，见图6.5。相对法以6号样品为参照物，其他样品计算其相对含量（见表6.2）。并进行常规PCR鉴定和实时荧光定量PCR鉴定结果显示，实时荧光定量PCR符合率与常规PCR一致。图6.5CPV样品荧光定量相对含量测定Figure6.5CPVloadsinsamplesbyrelativequantificationreal-timePCR注：1-12：CPV粪便样品；1-5：CPV血液样品6.2.6犬细小病毒VP2基因的序列分析本次研究所测序的22株犬细小病毒，其中20株是CPV-2a(Ser297Ala)突变株，另外2株则是CPV-2b(Ser297Ala)突变株；22株犬细小病毒的VP2基因的序列具有高度相似性，CPV-2a分离株之间；CPV-2b分离株之间；CPV-2a和CPV-2b相互比较，其核酸同源百分数分别为99.3-99.9%,99.9%,and99.3-99.7%，见表6.3。54 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析5.2.7犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变的详细信息见表6.4；6.5。6.2.8CPVVP2基因系统发育树分析基于CPVVP2基因系统发育树分析和地理关系分析图，武汉分离株（SouthCentralChina;1-11,wu,si,1-12,1-1,1-7andwh-3）;上海分离株（EasternChina;SH-2;Sh-3）以及北京分离株（NorthernChina;BJ-1andbj-3）为我国CPV流行的第一大群体，其与ThailandKU143-09strain紧密相关。CPV分离株bj-5,bj-1,BJ-2（Beijing）,wh-6（Wuhan）与我国南方分离株G13关系紧密，形成了一个单独的群体；本研究的其他CPV分离株均散在分布，没有聚集。见图5.5图6.6CPVVP2基因系统发育树分析与地理关系图Figure6.6CPVVP2genephylogeneticrelationshipbetweengeographicmap55 Q-PCRPCR常规Ct基因的遗传变异分析-ᇞᇞVP2犬细小病毒Ct2ᇞᇞ第六章V2aand2bisolatesandreferencestrains56insamplesbyrelativequantificationreal-timePCRloads（内参基因）表6.3CPV分离株的相互同源性比较parvovirus实时荧光定量PCR相对定量法测定样品中细小病毒载量表6.2CtTable6.2DetectionofTable6.3SequencehomologyoflocalChineseCP（目标基因）中国农业科学院博士学位论文125.93224.3139.73323.6936.32-12.9127707.055426.14+37.50-11.1222229.212+525.60+34.68-12.9187737.14+633.19+32.29-7.643199.896+724.31+34.08-5.79455.478826.23+37.96+928.130+35.83-12.7536905.4441028.46+136.90+-8.712419.3611127.66-+37.15-7.869233.8521232.10-++38.04122.26-7.798222.486+34.17+-9.483715.740224.8325.31++-1.1702.25028.01+-1.9733.927-+-2.2864.878-+++Ct血液样品类型粪便 Chinese2bstrains)GU569944基因的遗传变异分析VP2GZ0201(犬细小病毒第六章GenotypesChinese2astrains57CPV-2aChinaCPV-2bChinaCPV-04/08/CN-4(FJ435345)WesternChina）FJ435343CPV-04/08/CN-2（99.399.399.5WesternChina99.0100.099.599.5-99.799.3-99.6100.099.5100.0中国农业科学院博士学位论文)）GU569944FJ435343CPV-04/08/CN-2（WesternChinaCPV-04/08/CN-4(FJ435345)WesternChinaChinese2astrains*GZ0201(Chinese2bstrains***Accessionnumbers:KJ674806,KJ674808,KJ674809,KJ674815,KJ674819,KJ674820,JX121627,JX121626,JX121625,JX121624,JX121623,GQ169550,GQ169549,GQ169547,GQ169546,GQ169545,GQ169544,GQ169542,GQ169539,GQ169537.**Accessionnumbers:KJ674816,KJ67480799.3-99.999.4-99.5 基因的遗传变异分析VP2犬细小病毒第六章58表6.4CPVVP2蛋白的氨基酸非同义变换比较Table6.4AnalysisofNon-synonymousmutationsintheVP2genesequences中国农业科学院博士学位论文 基因的遗传变异分析VP2犬细小病毒第六章59表6.5CPVVP2蛋白的氨基酸同义变换比较Table6.5AnalysisofSynonymousmutationsintheVP2genesequences中国农业科学院博士学位论文 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析6.3讨论6.3.1我国CPV流行趋势分析犬细小病毒属于高度变异的病毒，自发现以来，经历了从CPV-2至CPV-2a与CPV-2b的变异。近年来，犬细小病毒仍然处在变异与进化过程，研究证实犬细小病毒在衣壳蛋白VP2第300和第426位氨基酸残基处存在变异，并导致犬细小病毒生物学特性的差异，如失去某些犬细小病毒单克隆抗体中和能力、以及病毒宿主范围的迁移等：MirandaC等（2014）在家猫体内分离到了犬细小病毒，IkedaY等（2000）报道在越南的犬和家猫中发现在VP2蛋白第426位氨基酸残基处存在变异的CPV-2c(a)和CPV-2c(b)型细小病毒突变株，随后在意大利、英国、西班牙、德国、南美洲也发现在VP2蛋白第426位氨基酸残基处存在变异的CPV-2c型细小病毒突变株（FilipovCetal.,2014;DecaroNetal.,2005）。肉食动物细小病毒不同毒株VP2蛋白关键氨基酸差异位点见表6.6。表6.6肉食动物细小病毒VP2蛋白关键位点氨基酸序列比对（康洪涛，2012）Table6.6ComparisonoftheaminoacidsequenceofVP2ofParvovirusesofcarnivores6.3.2VP2蛋白氨基酸变异分析本研究的犬细小病毒临床分离株均属于犬细小病毒2a/2b亚型，并不存在猫细小病毒感染犬的状况。CPV仅有一个血清型，但存在多个基因型，分析VP2基因的推导氨基酸序列，本研究的大部分犬细小病毒的VP2基因的推导氨基酸序列中存在独特的Ile324变异，部分毒株具有Val139变异，3个毒株具有Tyr267变异，在这3个Tyr267变异株中，2个毒株还具有Ala440变异，这两处位置的变异是否存在连锁还需要进一步研究。在这些变异中，Phe→Tyr（267）的原因可能由于第265至267位氨基酸残基并没有展示在犬细小病毒的衣壳表面，在这些位置上的氨基酸改变可能不会影响病毒的抗原性。而其他位置的变异是否会导致犬细小病毒生物学特性的变化，目前还需要进一步研究。对犬细小病毒流行毒株VP2蛋白氨基酸序列分析显示目前我国主要城市流行犬细小病毒在60 中国农业科学院博士学位论文第六章犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析VP2蛋白氨基酸序列上存在多种变异株，鉴于这种情况，对更多地区的犬细小病毒抗原变异株的分子监测显得尤为重要。本研究提供了犬细小病毒在我国3个主要城市宠物犬中的分子流行病学调查情况，为进行全面深入的研究CPV分子流行病学,阐明CPV主要的流行株的种类和分布提供基础数据，对分析生产实践中免疫失败的原因、有针对性地采取相应的防治措施、最终有效控制该病具有重要的实践意义。6.3.3我国CPV免疫保护分析从本研究的结果上看，CPV阳性率在整个收集样品中相对是非常高的，而且均是CPV-2a亚型，是否暗示着目前CPV的疫苗不能对CPV-2a亚型流行株起到很好的保护？针对该病原，未来应该研发CPV-2a亚型的专用疫苗，可能能更好的控制该病的流行。从CPV分离株的地域分布上来看，不同城市间不存在CPV单独地域特征性毒株群，随着人员、货物特别是宠物种兽的地区间交流频繁，CPV流行株在亚洲（东亚/南亚）能显示出一定的趋向性，其氨基酸突变位点也显得特别一致。因为CPV属于国家3类疫病，目前重视程度不足，而且宠物疫病疫苗基本上被国外公司把控，个人认为应当多支持发展本地的CPV疫苗产品和本地流行株，让CPV的影响降到最低水平。6.3.4CPV及其他犬科动物感染细小病毒联系毛皮动物狐狸和貉属于犬科动物，也能感染细小病毒。研究证实狐狸和貉感染的细小病毒属于CPV-2型，而并非感染我国犬细小病毒流行的CPV-2a型。也从侧面上说明了CPV病毒的高度宿主特异性。当然CPV2a/2b/2c不同基因型之间的差异仅为1～3个氨基酸，这种微小的差异是否能决定CPV对犬科动物的感染特性，也值得进一步深入研究。61 中国农业科学院博士学位论文第六章结论第六章全文结论1.本研究以体外表达并纯化CDV的N截短蛋白片段（aa277-471）为抗原，制备并筛选出一株单克隆抗体1N8，其ELISA效价达到50K，亚类鉴定为IgG1a，kappa链，该单克隆抗体能与CDV病毒免疫荧光检测阳性、WB检测阳性。通过肽扫描，筛选到单抗1N8的最小识别单位：351359NFGRSYFDP。通过比对，其与CDV同属病毒MV，牛瘟病毒RinderpestvirusL株，小反刍兽疫病毒Peste-des-petits-ruminantsvirus(strainNigeria75/1）一致，并对小反刍兽疫病毒进行了验证，其结果为阳性；通过模拟，发现此表位位于N蛋白的外侧，与CDV阳性血清具备一定的反应能力。并以杂交瘤细胞1N8为模板，分离出其抗体轻链和重链可变区，通过基因工程的方式组装成单链抗体表达载体，通过原核表达，获得了重组1N8单链抗体蛋白，经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测，其具备1N8单抗的部分活性：能与CDV结合并能阻断1N8单抗与N蛋白结合。将N蛋白表位结合细小病毒VP2基因，表达于腺病毒体系中，成功构建了CDV表位疫苗，小鼠免疫显示，其能产生强烈的细小病毒抗体和部分犬瘟热抗体。综上所述，本研究证明了体外表达CDVN蛋白是可以做为筛选CDVMabs的免疫源，而且351359其单抗的抗原表位NFGRSYFDP与CDV同属MV病毒，牛瘟病毒RinderpestvirusL株，小反刍兽疫病毒Peste-des-petits-ruminantsvirus(strainNigeria75/1）一致，事实上该研究可以为整个麻疹病毒属大部分病毒的诊断奠定基础。另一方面，也证明了原核表达的CDV的单链抗体具备一定的抗体活性，可以与CDV病毒结合。而且本研究使用的表位筛选方法和抗体可变区基因分离提取、单链抗体的制备都能为未来开发新型病毒诊断和治疗制剂提供帮助和借鉴。最后，本研351359究开展了CDV表位NFGRSYFDP的表位疫苗研究，以腺病毒为载体，CPVVP2基因片段搭载这CDV表位信息为表达盒，研制出重组腺病毒，小鼠免疫实验证明，重组病毒的CPV免疫源性达到商品化疫苗水平，CDV次之。2.为了分析我国CPV流行毒株的分子生物学特征，了解其遗传演化规律，查明中国目前CPV流行毒株现状，在本研究中，历经4年，收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份，分离病毒8株，获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份，其中CPV-2a型20份，CPV-2b型2份，并存在CPV-2a（Ser297Ala）变异。本研究中的犬细小病毒VP2基因与国内参考毒株的序列相似度为99.3-99.9%。系统发育树证明大多数CPV毒株为一个大的分支中，并且其进化/变异分析与泰国KU143-09株类似。另外，本研究对我国流行CPV的VP2基因突变的氨基酸位点进行了归纳，总结了VP2基因内同义突变和非同一突变的状况，并开展了CPV的VP2基因系统进化与地理位置相关性研究，为更好的预防和控制犬细小病毒提供基础。62 中国农业科学院博士学位论文附录附录一、实验用仪器及厂家型号仪器名称厂家型号PCR仪美国Bio-Rad，PTC02000型低温离心机日本HITACHI公司，CF16RXII型电泳仪北京六一仪器厂，DYY-11型电热恒温水浴锅上海景洪实验设备有限公司，DK-8D型凝胶成像系统英国UVITEC，UVIdoc型恒温振荡培养箱江苏培英，HZQ-X100型小型离心机德国Eppendorf，5418D型-80°C超低温冰箱英国NEWBKUNSWICKSCIENTIFIC公司，U570型超净工作台新加坡ESCO公司，classIIBSC型微波炉佛山市格兰仕公司，G80W23CSP-Z型高压蒸汽灭菌锅日本SANYO公司AR5120电子天平美国OHAUS公司单反照相机英国Canon，EOS600D型微量紫外分光光度计美国ThermoFisher，ND-2000HT-150型超声波细胞破碎仪山东济宁横通有限公司蛋白电泳仪及配套电泳槽美国Bio-Rad80型酶联免疫检测仪美国Bio-Rad二、载体图谱1、pEASY-E1表达载体结构图：63 中国农业科学院博士学位论文附录2、pET32a(+)载体结构图2、AdEasy-1载体结构图：64 中国农业科学院博士学位论文附录3、pShuttle-IRES-hrGFP载体结构图：三、反转录、PCR体系和程序1、核酸反转录体系：RNAtemplate5.0µLOligo(dT)15primer2.0µLinhibit酶抑制剂1.0µL5*buffer2.5µLdNTPmixtures0.25µM反转录酶0.5UddH2O补至20µL2、PCR体系：cDNAtemplate1.0µL10*buffer2.5µLforwardprimer1.0µLreverseprimer1.0µLdNTPmixtures0.25µMExTaqDNApolymerase0.5UddH2O补至25µL3、核酸反转录过程：RT过程42℃1h，冰浴5min。PCR反应条件为：95℃5min；94℃45s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。65 中国农业科学院博士学位论文附录4、PCR反应过程：95℃预变性1min3594℃变性45s个循环50℃退火40s72℃延长1min72℃最后延长10min4℃保存∞5、连接体系及程序：试剂剂量（µl）纯化后的基因片段3.5商品化已酶切完毕的载体（含连接酶）1ddH2O补至5µl6、双酶切体系：载体或目的片段4.0µL内切酶11.0µL内切酶21.0µLBuffer2.0µLddH2O补至20µL四、常用液体配制（1）ELISA包被缓冲液：将碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g和碳酸钠（Na2CO3）1.59g充分溶解于800ml去离子水中，混匀后调节pH值至9.6，加去离子水定容至1L，高温高压灭菌后室温保存。（2）ELISA底物缓冲液：将磷酸氢钠Na2HPO4·12H2O71.6g和柠檬酸2.1g充分溶解于800ml去离子水中，混匀后调节pH值至7.0，高温高压灭菌后室温保存。（3）ELISA底物显色液：将TMB5mg和30%H2O215µl充分溶解于10ml底物缓冲液中，现用现配。（4）12%分离胶配方（10mL）：30%丙烯酰胺4mL，Tris-HCl（pH8.8）2.5mL，10%SDS100μL，10%AP100μL，TEMED4μL，去离子水3.3mL，现用现配。（5）5%浓缩胶配方（4mL）：30%丙烯酰胺670μL，Tris-HCl（pH6.8）500μL，10%SDS40μL，10%AP40μL，TEMED4μL，去离子水2.7mL，现用现配。（6）Ni-NTAwashBuffer：100mMTris-HCl，Urea8M，100mMEDTA，1%TritonX-100，去离子水100mL，调pH至7.0。66 中国农业科学院博士学位论文附录（7）Ni-NTAEluteBuffer：100mMTris-HCl，100mMEDTA，1%TritonX-100，Urea8M335μL3MImidazole调pH至7.5。（8）细菌的washBuffer：100mMEDTA，10%TritonX-100，Na2HPO471.6g，1000ml去离子水溶解，pH为7.0，高温高压灭菌，室温保存。（9）20%胎牛血清RPMI-1640培养液(Medium1)：RPMI-164020%FCS1‰双抗1%OPI1%sodiumpyruvate（10）HAT培养液(Medium2)：RPMI-164020%FCS2%HAT选择培养液1‰双抗1%OPI1%sodiumpyruvate（11）HT培养液(Medium3)：RPMI-164020%FCS2%HT选择培养液1‰双抗1%OPI1%sodiumpyruvate（12）4%HAT培养液(Medium4)：RPMI-164020%FCS4%HAT选择培养液1‰双抗1%OPI1%sodiumpyruvate（13）8-AG培养液(Medium5)：2%8-氮鸟嘌呤（8-AG）50ml胎牛血清10%FCS1‰双抗8-氮鸟嘌呤（8-AG）,HAT,HT:10ml1640溶解。67 中国农业科学院博士学位论文参考文献参考文献1.毕振威.犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其应用[博士学位论文].南京农业大学，2012.2.程世鹏，等.犬瘟热病原学研究进展[J].特产研究，2009，01:59-62.3.陈亮.鸡CARP单克隆抗体制备及其在骨骼肌发育中的表达[博士学位论文].黑龙江八一农垦大学，2010.4.邓素芳，等.猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究[J].中国兽医科学，2015，03:253-258.5.高明华.狂犬病毒G，N基因的表达、单克隆抗体制备与胶体金免疫层析检测试纸的研制[博士学位论文].吉林大学，2007.6.陈继军，等.抗狂犬病病毒单链抗体的筛选及鉴定[J].中国生物工程杂志，2013，11:27-317.葛猛，等.利用噬菌体展示技术筛选猪圆环病毒2Cap蛋白的线性B细胞表位[A].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会、解放军军事医学科学院军事兽医研究所.中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会、解放军军事医学科学院军事兽医研究所:，2013:5.8.戈锐，等.犬细小病毒四川株的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2007，11:836-839.9.简中友.犬瘟热病毒N蛋白体外表达与诊断技术应用研究[博士学位论文].吉林农业大学，2008.10.简子健，等.犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达[J].新疆农业科学，2012，03:560-564.11.鞠会艳，等，犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达[J].VirologicaSinica，2006，04:380-384.12.康洪涛.貉细小病毒分离鉴定及免疫原性研究[硕士学位论文].中国农业科学院，2012.13.李河林，等.犬细小病毒病研究进展[J].动物医学进展，2008，05:73-77.14.李倩.犬细小病毒的分离鉴定与VP2基因遗传进化分析[博士学位论文].吉林农业大学，2014.15.李凤琴.犬瘟热病毒N蛋白基因核酸疫苗的构建及大熊猫GM-CSF基因对其免疫效果的影响研究[博士学位论文].四川农业大学，2012.16.李天松.不同宿主来源犬瘟热病毒遗传分析与生物学特性研究[博士学位论文].吉林农业大学，2012.17.刘玉秀.犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究[博士学位论文].吉林大学，2014.18.刘红玉.水禽细小病毒VP3蛋白表位鉴定及重组腺病毒载体构建[硕士学位论文].东北农业大学,2013.19.何学峰.猪细小病毒的分离鉴定及NS1/VP2基因遗传进化分析[博士学位论文].华中农业大学，2012.20.何芳萍，等.抗H5亚型禽流感病毒单链抗体在毕赤酵母中的分泌型表达和生物活性分析[J].68 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中国农业科学院博士学位论文致谢致谢时光如梭，转眼间博士三年的学习即将结束，心中感慨万千，既有课题成功的喜悦，也有课题失败的教训，但更重要的是，这三年辛苦付出，最终收获了回报。值此论文付梓之际，我要感谢这一路上帮助过我、支持过我的师长、朋友和同学。首先谨向我尊敬的导师程世鹏研究员致以最诚挚的敬意和衷心的感谢。感谢老师对我学习上的“传道，授业，解惑”，在生活上的关怀备至，让我有了完成课题的信心和努力学习的动力。在论文的开展中，老师为我提出了建设性的意见，使我顺利完成课题。老师的高尚师德、知识渊博、崇高修养、严谨治学让我受益匪浅，是我学习的楷模。感谢闫喜军研究员和武华研究员给予的宝贵的经验传承和科研能力扩展，感谢中国农业科学院特产研究所提供的良好的学习和工作氛围，各种齐备的实验设施，丰富的人文关怀，在这里我接触到许多朋友，拓宽了我的视野，增长了见识，形成了属于我自己的科学思维。感谢我的师妹仝明薇同学，在犬细小病毒课题中提供的的大力帮助，感谢杨勇博士在课题思路中提供的有益的建议和指导。感谢重点实验室的同事：温永俊研究员、王建科助研、朱洪伟博士、谭斌助研、张淑琴助研、郭利副研究员、杨艳玲副研究员、孙娜博士、王凤雪副研究员、冷雪副研究员、李真光博士对我的帮助和耐心指导。感谢实验室中的同学：赵航博士、刘莹博士、林鹏硕士、王西西硕士对我学习和工作的关系、鼓励与帮助。感谢与我同一届的宋兴超博士、鲍加荣博士、孙成鹤博士、赵海平博士在北京学习生活中给予的支持和帮助。除了上面提到的老师与实验室同仁，我还要感谢特产所科研处的老师们，是他们的辛勤的工作保障了研究生的学习和工作顺利的开展和实施，在此表示真挚的谢意。特别感谢我的家人给予我无私的爱，特别是我的爱人张玲在我人生的道路上的一路支持，使我拥有不断前进的动力。最后，向答辩委员会以及论文评阅人表示衷心的感谢！向所有关心和帮助我的老师和朋友致以深深的谢意！本项目由“农业科技创新工程---特种动物病原与免疫科技创新团队”资助。81 中国农业科学院博士学位论文作者简历作者简历易立，男，1983年生，汉族，中国农业科学院特产研究所副研究员，农业创新工程特种动物病原与免疫团队秘书，2001年毕业于华中农业大学，获学士学位，2008年毕业于中国农业科学院研究生院，获预防兽医学硕士学位，一直从事毛皮动物主要传染病（犬瘟热、细小病毒等）疫病防治、免疫诊断（单抗筛选）和试剂盒研发的研究，目前主持吉林省重点攻关项目、吉林省青年基金和吉林省自然基金等，课题开展犬瘟热病毒单克隆抗体，犬瘟热病毒表位筛选，毛皮动物主要传染病多重诊断等研究。读博期间发表论文如下（2012-2015）1.YiL,ChengS.MonoclonalAntibody1N8AgainstNProtein(aa277-471)ofCanineDistemperVirus，MonoclonalAntibodiesinImmunodiagnosisandImmunotherapy，2014Feb;33(1):52-6.doi:10.1089/mab.2013.0066.2.YiL,TongM,ChengY,SongW,ChengS.PhylogeneticAnalysisofCanineParvovirusVP2GeneinChina.TransboundEmergDis.2014Sep11.doi:10.1111/tbed.12268.3.YiL,ChengS,XuH,WangJ,ChengY,YangS,LuoB.DevelopmentofacombinedcaninedistempervirusspecificRT-PCRprotocolforthedifferentiationofinfectedandvaccinatedanimals(DIVA)andgeneticcharacterizationofthehemagglutiningeneofsevenChinesestrainsdemonstratedindogs,J.Virol.Methods,2012.4.M.W.Tong,L.Yi(共同第一),S.P.Cheng.CompletegenomecharacterizationofacaninedistempervirusisolatedfromChineseraccoondoginChina[J].AsianJournalofAnimalandVeterinaryAdvances,2015,10(1):43-47.5.YiL,ChengS.Preparationandidentificationofasingle-chainvariablefragmentantibodyagainstCanineDistemperVirus，MonoclonalAntibodiesinImmunodiagnosisandImmunotherapy，2015（Accept）82
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