鸡斑联蛋白基因真核表达和慢病毒干扰载体的构建及鸡盲肠组织块培养的研究

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1、孙大辉鸡斑联蛋白基因真核表达和慢病毒干扰载体的构建及鸡盲肠组织块培养的研究三鸡斑联蛋白基因真核表达和慢病毒干扰载体的构建及鸡盲肠组织块培养的研究研究生：孙大辉导师：戴国俊教授专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州，225009，扬州)中文摘要斑联蛋白(zyxin)，又名为zyxin2蛋白，是一种胞内蛋白。在有丝分裂期间，斑联蛋白基因通过与其他基因形成一个调节复合物的方式控制有丝分裂的进程。另外，斑联蛋白还会作为转录激活子在细胞核中进行的转录过程中起作用。斑联蛋白可以与其他蛋白

2、协同作用，共同调节有丝分裂的进行以及细胞的运动、肿瘤细胞的迁移和生长。尽管鸡斑联蛋白基因和人斑联蛋白基因只有约60％的序列同源性，但他们却有较高的功能相似性。根据QTL和多态分析已经证明该基因与球虫病的抗性相关。本研究构建斑联蛋白基因真核表达载体和慢病毒干扰载体并筛选其有效干扰靶点，同时探索利用组织块培养法培养鸡盲肠组织细胞的条件，旨在为以后开展从细胞角度进行的斑联蛋白基因对鸡球虫病抗性的验证和机理以及球虫侵染的机制研究奠定基础。利用trizol法提取京海黄鸡胸腺组织的RNA，用反转录试剂盒反转录得

3、到eDNA，以cDNA为模板，利用含有NheI和Sail酶切位点及保护碱基的上下游引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳并切胶回收得到zyxin基因片段。用NheI和Sail对zyxin基因片段及Pex一6进行酶切，之后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，再利用T4DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆测序。将测序正确的菌液大量抽提质粒得到Pex．6．zyxin载体。将Pex．6．zyxin真核表达载体转染293T细胞并用Realtime-PCR方法检测其表达量。以上研究结果

4、表明：1．所设计的PCR扩增引物在55V的退火温度下成功扩增到zyxin基因。电泳结果表明，扩增的目的条带(大小为1629bp)位于DNAMarker的1500．2000分子量之间，符合预期大小；2．用NheI和Sail对zyxin基因片段和pEX．6载体分别进行酶切，然后以T4连接酶连接两酶切产物，转染大肠杆菌，提质粒，经过双酶切鉴定，目的基因条带(大小为1629bp)和线性载体条带(大小为4．88kb)分别位于DNAMarkerl500-2000和4000．5000之间，证扬州大学硕士学位论文明

5、重组质粒是目的载体Pex．6．zyxin，成功构建Pex．6．zyxin真核表达载体；3．重组载体转染293T细胞后，在荧光显微镜下，可见红色荧光，说H猸Pex．6．zyxin成功转染进了293T细胞，且转染效率在80％以上。在重组质粒转染至IJ293T细胞之后的48h和72h分别进行Realtime．PCR检测，结果证明zyxin基因在293T细胞中有表达，柱状图显示，48h时的zyxin基因表达量介于400．00和450．00之间，而72h的zyxin基因表达量为500．00，说明48h到72h

6、时间段内的zyxin基因表达呈上升趋势。利用OligoDesigner3．0设计4条干扰片段，由上海吉玛公司合成模板。将上下游模板退火得到shRNA。利用BamHI和EcoRI将shRNA和Lv3载体双酶切，然后利用T4NDA连接酶将酶切后的干扰片段及Lv3载体进行连接。将lv3-shRNA载体与包装质粒pGag／Pol、pRev、Pvsv。G共转染293T细胞，进行病毒包装。将得到的病毒原液十倍稀释6个梯度，分别转染293T细胞，进行滴度的测定。将构建好的四条慢病毒载体与Pex．6．zyxin真核

7、表达载体共转染293T细胞，运用Realtime．PCR和Western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选。以上研究结果表明：1．Lv3载体经BamHI和EcoRI双酶切后，电泳结果显示大小为8kb，符合预期大小。构建4条针对目的基因zyxin的RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体C01、C02、C03、C04和1个阴性对照质粒，经过EcoRI单酶切和测序鉴定正确，成功构建zyxinLv3．shRNA重组质粒；2．重组慢病毒质粒Lv3．shRNA和包装质粒混合物共同转染293T细胞，在倒置荧光显微镜下，

8、观察各孔细胞，24h后呈绿色荧光，细胞生长状态良好，表明病毒包装成功。共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达l×108TU／ml，适合感染目的细胞，经过筛选，C03对zyxin在293T细胞中的表达干扰效率在RNA水平上为60％，在蛋白水平上为90％，综合比较其他RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体，C03的干扰效果最佳。成功构建了zyxin基因RNA干扰慢病毒表达载体，并进行了有效干扰靶点的筛选，为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础。先用75％的酒精对18天的京海