HBVX基因真核表达载体的构建研究

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1、HBVX基因真核表达载体的构建研究【关键词】,,HBV;真核表达载体;pCDNA3.1摘要目的:构建HBVX基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体，为进一步研究HBVX基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBVX基因的引物，从HBVDNA阳性的血清中，PCR扩增得到HBVX基因全序列，将其连接到真核表达载体pCDNA3.1上后，酶切图谱分析PCR检测和扩增产物序列分析等，鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论

2、:成功构建了HBVX基因的真核表达载体，为下一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。关键词HBV;真核表达载体;pCDNA3.1乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）与原发性肝细胞癌（PrimaryHepatocellularCarcinoma，PHCC）密切相关，呈全球流行，严重威胁人类健康［1，2］。至今，HBV的致癌机制仍不清楚。近年来发现，HBVX基因的编码蛋白HBVX蛋白（HBxAg）被认为在慢性HBV感染发展成HCC中起重要作用，可以在多个环节影响HCC形成和发展。我们构建了X基因的表达载体，为了深入

3、系统地研究HBV7X基因对原发性肝细胞癌发生的影响及其作用机制和发展针对该基因的抗HBV及抗肝癌技术奠定实验室基础。　1材料和方法　1.1材料HBVDNA阳性血清样本来自我院门诊和住院病人。1.2主要试剂Trireagent液购自Promega公司;γTaqDNApolymerase，限制性内切酶KpnI和EcoRI购自华美生物工程公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司;质粒DNA小量纯化试剂盒购自TaKaRa公司;质粒pCDNA3.1+和大肠杆菌DH5α购自博士德生物技术公司。　1.3方法1.3.1X基因产物的

4、制备:从GeneBank获取HBVX基因全序列，设计一对特异性X基因扩增的引物，正义引物为5'CATGGTACCATG-GCTGCTAGGCTGTG3'，反义引物为5'CGT-GAATTCTGCATGGTGCTGGTGA3'，下划线部分为KpnI和EcoR7I酶切位点。该引物定义全长约500bp左右的X基因。选取HBVDNA阳性的患者血清，用Trireagent液裂解后，用25∶24∶1（v∶v∶v）的酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀纯化HBVDNA。PCR采用94°C预变性5min，94°C变性1min，53°C退火1min，72°C

5、延伸1min，30次循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。用DNA回收试剂盒回收DNA。1.3.2质粒构建，按参考文献［3］进行:将回收的X基因和pCDNA3.1+载体分别经KpnI和EcoRI双酶切后，用T4DNA连接酶将两者的酶切产物连接。常规技术制备感受态DH5α大肠杆菌，构建好的表达X基因的真核表达载体，命名为pCDNA3.1-X，转化感受态DH5α大肠杆菌中。扩增，保存。1.3.3真核表达载体的鉴定:以重组的真核表达载体为模扳，进行PCR鉴定（条件同前）;用KpnI和EcoRI双酶酶切重组的真核表达载体，电泳进行鉴定;从转

6、化的大肠肝菌提取质粒DNA，电泳鉴定。将重组的真核表达载体测序鉴定。2结果　重组真核表达载体pCDNA3.1-X的鉴定。　2.17以重组表达载体pCDNA3.1-X为模板进行PCR扩增，得500bp左右的片段，与所选取的GeneBank中已知的X基因大小相符合，见图1。　2.2从转化的大肠杆菌中提取质粒DNA，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定得到大约为6kb的特异性片段，即重组质粒已经成功的转化大肠杆菌，见图2。测序结果显示与已知基因一致。3讨论HBV被认为是原发性肝癌发生的高危因素之一，尤其是HBVX基因。已经证明其编码产生的X蛋白与HCC的

7、发生密切相关，但是至今，X基因的致病机制仍不清楚，因此有必要针对X基因与HCC的关系做进一步的研究，对阻断X基因表达的方法和效果进行探讨。X基因是HBV最小的基因开放读码框，定位于1376-1850核苷酸之间，HBVX基因序列是HBV基因内功能重叠最明显的区域。HBVX基因的编码产物HBVX蛋白（HBx蛋白或HBxAg），是由约154个氨基酸残基组成的大小为16.5kD的功能蛋白，它不仅存在于细胞质中，在细胞核中也可以检测出［2］，由此可以推断X蛋白在细胞遗传物质的产生过程中起着重要作用。7近年来在对HCC的研究中发现，HBx蛋白的作

8、用不可忽视。目前已知X蛋白具有反式激活的作用。HBxAg不仅可以激活HBV增强子，核心启动子，S基因启动子等所有HBV的启动子，还能激活猴病毒（SV40）早期启动子，人类免疫缺陷病毒长末端重复序列（HIVLTR），单纯疱