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时间:2018-05-01
《hbvx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、HBVx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响 摘要:目的构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体并在肝癌细胞中表达,以研究其对肝癌细胞恶性表型的影响.方法应用PCR、基因克隆等方法构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX,用基因转染的方法将pcD-NA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC-9204,筛选稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞.MTT比色实验、平板集落形成实验检测肝癌细胞恶性表型.结果成功构建了乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX并获得了稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞系HCC-9204细胞克隆,且MTT比色实验、平板克隆
2、形成实验显示稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞恶性度增高.结论乙型肝炎病毒X蛋白具有生长因子样作用,可刺激肝癌细胞生长,在肝癌细胞中稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌细胞恶性表型. Keyacell Abstract:AIMToconstructandexpresstheeukaryoticex-pressionvectorofHBVxgeneandstudyitseffectonthema-lignantphenotypeofhepatocellularcarcinomacells.METHODSPolymerasechainreaction(PCR)andotherm
3、olecularbiologicalmethodsediatedbythelipofectamineanhepatocellularcarcinomacelllineHCC-9204.TheselectivemediumcontainingG418etricanalysisexperimentandagarosecolony-formingalignantphenotypeandgroacells.RESULTSTheeukaryoticexpressionvectorofHBVxgeneediumcontainingG418.Cellsalignantphenotype.CON
4、CLUSIONTheXproteinhasgroulatethegroacellsandenhanceitsmalignantphe-notype. 0引言 乙型肝炎病毒(HBV)相关的原发性肝癌发病率和死亡率都很高,HBV与原发性肝癌之间存在着密切的关系.阐明二者的关系将对探讨HBV相关的原发性肝癌的发生、发展、预防及治疗具有重要意义.为此,本研究首先构建了HBVx基因真核表达载体,并通过基因转染技术转染至人HCC-9204肝癌细胞,经过药物筛选获得稳定表达HBVX蛋白的细胞克隆,观察肝癌细胞在转染外源性HBVx基因后细胞恶性表型的变化. 1材料和方法 1.1材料人肝癌
5、细胞系HCC-9204为病理学教研室建株.肝癌细胞取自60岁男性肝癌患者手术标本,病理诊断为肝细胞肝癌Ⅱ~Ⅲ级.MTT购自Sigma公司,TaqDNA聚合酶、G418购自Promega公司,EcoRI,KpnI,BamHI,T4DNA连接酶为华美公司产品,兔抗HBx多克隆抗体购自美国FoxChase癌症中心,地高辛DNA随机引物标记试剂盒购自德国宝灵曼公司,HBVx基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成. 1.2HBVx基因克隆及序列测定 1.2.1PCR法从质粒pTTHK中扩增HBVx基因模板为含HBVDNA的质粒pTTHK,分别在PCR引物的上游引物和下游引物的5’端加
6、上相应的限制性内切酶KpnI和EcoRI酶切位点,引物顺序如下:上游引物5’ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3’;下游引物5’GGAGAATTCAT-GATTAGGCAGAGGTG3’.应用上述引物对模板DNA进行PCR,按下列条件在PCR自动扩增仪上进行PCR.94℃5min→59℃1min→74℃1min,循环30次后,74℃延伸10min.阴性对照除不含模板DNA外,其他成分与实验组相同. 1.2.2PCR产物与克隆载体pT7Blue连接先用EcoRV将克隆载体pT7Blue切成线性,然后将回收的PCR产物HBxDNA片段接于克隆载体pT7-Blue.取
7、连接产物转化感受态细菌DH5α大肠杆菌,挑选单菌落,筛选重组体. 1.2.3筛选重组体pT7Blue-HBX取上述质粒用EcoRI和KpnI双酶切鉴定. 1.2.4序列测定选择酶切结果正确的细菌菌落,提取质粒DNA并纯化.用紫外分光光度计测定DNA浓度,将5~10μg质粒DNA溶于三蒸水,用DNA自动测序仪进行序列测定. 1.2.5真核表达载体pcDNA3.1-HBX的构建将已经过序列测定的重组质粒pT7Blue-HBX及真核表达载体pcDNA3.1分别用EcoRI和Kpn
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