ARG1基因真核表达载体的构建及其对细胞抗砷性影响的研究

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1、摘要目的：通过构建ARG1基因真核表达载体PcDNA3.1-IE-ARG1,转染293T细胞来研究ARG1基因的抗砷性。方法：采用脂质体介导的转染方法将PcDNA3.1-IE-ARG1转染入293T细胞中，用激光共聚焦显微镜和real-timePCR方法进行ARG1基因表达鉴定;MTT法检测48小时急性砷中毒时细胞的生存率;原子吸收分光光度法测定不同浓度（1、4、8μmol/L）砷作用于PcDNA3.1-IE-ARG1组、空载体组及未转染组细胞24h后，细胞内砷含量及细胞分别在24小时、48小时的排砷量;用含NaAsO2浓度为0、4

2、、8μmol/L的培养基培养三组细胞48小时，二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法测定细胞内谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽转移酶(GST)活性，蛋白印记法测定细胞内多药耐药相关蛋白2(MRP2)的表达。结果：PcDNA3.1-IE-ARG1成功转入293T细胞中且表达良好；48小时急性砷中毒试验显示各组细胞生存率均明显下降，存在剂量-效应依赖关系，随着砷浓度的增加，各组细胞在各浓度下的生存率都逐渐降低；但PcDNA3.1-IE-ARG1组细胞在低浓度（砷浓度≤8μmol/L）砷作用下，生存率均明显高于其它两组，差异具有统计学意义（P<0

3、.05）；用浓度为1、4、8μmol/L的NaAsO2作用细胞24小时，PcDNA3.1-IE-ARG1组细胞内砷含量明显降低,24小时、48小时的排砷量明显增高，与其它两组相比差异具有统计学意义（p<0.05）；用浓度为0、4、8μmol/L的NaAsO2作用细胞48小时后，PcDNA3.1-IE-ARG1组细胞内GSH与GST的含量及MRP2蛋白表达明显增高，与其它两组相比差异具有统计学意义（p<0.05），且随着砷作用剂量的增加GSH、GST及MRP2表达亦增加。结论：ARG1基因在293T细胞中相对高表达后，提高了293T细

4、胞对砷的耐受性。关键词：ARG1基因；转染；抗砷性；谷胱甘肽；谷胱甘肽转移酶;多药耐药相关蛋白2论文类型：A（基础研究）IAbstractObjective：ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorPcDNA3.1-IE-ARG1andstudythearsenicresistanceofARG1Geneaftertransfecting293Tcell.Methods：293Tcellsweretransfectedwiththerecombinantplasmidbyliposome,th

5、enexaminedbylaserscanningconfocalmicroscopy(LSCM)andtheexpressionofrecombinantARG1genemRNAwasexaminedbyreal-timePCR;48hoursacutearsenitetoxicitytestwasperformedtoassaycellsliveratebyMTT;Threedifferentgroupsofcellswereexposedtosodiumarsenite（1、4、8μmol/L）for24hours,arsen

6、iteaccumulation,todeterminedthearseniteaccumulationandeffluxbyatomicabsorptionspectrophotometry.Thecellswereexposedtosodiumarsenite（0、4、8μmol/L）for48hours,todeterminedtheintracellularconcentrationofGSHandGSTactivitybyDTNB，theexpressionofMRP2wasdeterminedbyWestern-blota

7、nalysis.Results：Thereal-timePCRresultsshowedthattherecombinantplasmidweresuccessfullytransfectedinto293Tcells.48hoursacutearsenitetoxicitytestshowsthattheliverateofthecellswasinhibitedbysodiumarseniteintime-anddose-dependantmanner,butcomparedwithemptyplasmidgroupandunt

8、ransfectedgroup,theliverateoftheARG1genegroupwasmuchhigherwhenthecellswereexposedtolowersodiumarsenite(≤8μmol/L).When