人tollip基因真核表达载体的构建及其抗hbv的体外研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文人Tollip基因真核表达载体的构建及其抗HBV的体外研究姓名：陈维英申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：李龙江201205重庆医科大学硕士研究生学位论文人ToIIip基因真核表达载体的构建及其抗HBv的体外研究摘要乙型肝炎病毒(H印ati廿sBⅥms，HBV)的感染在中国高发，其持续感染易导致肝硬化和肝癌，严重危害人类健康，所以防治HBV感染成为我国传染病研究的热点。乙肝疫苗对未感染者具有明显保护作用，但是，HBV感染尤其是慢性感染的治疗仍然面临很大的困难。目前，核

2、苷类药物和干扰素被广泛用于抗HBV治疗，但缺乏切实有效的长期应答效应以及个体耐药等因素制约了疗效，亟需寻找新的治疗靶点和药物。ToU样受体(Tolllikereceptors，TLRs)作为一种重要的病原生物模式识别受体，能够识别HBV等病毒。TL刚IL．1R信号转导通路，在炎症反应和机体天然免疫中起着举足轻重的作用，该通路中的关键信号分子可能成为抗HBV的新靶点。Ton作用蛋白(Toll—i11teractingprotein，Tollip)是TL刚IL一1R信号转导通路中的一个关键接头蛋白，它对HBV的

3、感染有何影响是一个值得探讨的问题。本文通过构建含HA标签蛋白的Tollip真核表达载体pCMV-HA—Tollip，并成功转染人肝癌细胞株H印G2．2．15，通过观察其对HBV抗原的影响，分析TL刚IL．1R信号转导途径中重要分子的表达，以期初步阐明Tollip在抗HBV感染中的作用，为乙肝的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。具体内容如下：目的：构建含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA—Tollip，转染气重庆医科大学硕士研究生学位论文HepG2．2．15细胞，检测其对HBV抗原分泌的影响并探讨其机制。方法

4、：1．构建真核表达载体pCMV-HA．Tollip双酶切及DNA测序鉴定。2．采用脂质体转染法，将质粒pCMV-HA．T01lip转染HepG2．2．15细胞。3．ELISA法检测HBsAg和HBeAg的表达。4．W

5、estemBlot法检测AKT、p—AKT、NF．1①的差异表达。结果：1．成功构建了真核表达载体pCMV-HA—Tollip。2．质粒成功转染H印G2．2．15细胞48h后，3“g空质粒与3肛gpCMV-HA．Tollip共转染组、6肛gpcMV-HA-Tollip转染组中H印G2．2．15

6、细胞的HBsAg和HBeAg分泌量明显低于6烬空质粒转染对照组，对HBsAg的抑制率分别为24％和41％(p

7、5细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分些，其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF—KB的表达有关。关键词：HBVT011ip，HepG2．2．15，机制4重庆医科大学硕士研究生学位论文CONSTRUCTIONANDINVITRoANTI．HBVRESEARCHoFEUKARYoTICEXPRESSIoNVECToRPCMV二HA．ToLLIPABSTACTT}1ereisahi曲incidenceofh印atitisBVims(HBV)infectioninChina，andpersistellti

8、nfectionswithHBVleadtocin．hosisand1iVercancer，whichisseVerelyh枷fhltohumanhealm．Therefore，mepreVentionofHBVinfectionisbecomingahottopicofinfectiousdiseaseresearchinChina．Almou曲h印atitisBVaccinehasasigIlificamlyprotectiVeeffIecton也osewhohasnotbeeninfectedbyHB

9、V血erearestillmaJlydi伍cultiesinthetre砌entofhepatitisB，especiallyforchronicinfection．Atpresent，thenucleotidedmgsandinterferonarewidelyusediIlanti-HBVinfection，butthe1ackofefrectivelong-temresponseea’ectsandindi