人rhoc基因原核表达载体的构建及其表达

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1、兰州大学硕士学位论文人rhoC基因原核表达载体的构建及其表达姓名：王燕玲申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：王勤20050501原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：燃日期：丝：!：』关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，

2、知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：型啦导师签名日期：超§：f兰州大学碗：t研究生学位论文人_rhoC基因原核表达载体的构建及其表达摘要近年研究发现Rho蛋白家族成员RhoC在肿瘤细胞转移过程中起重要作用，可能

3、是肿瘤转移的分子开关。为研究RhoC蛋白和其他蛋白质的相互作用，更好的理解RhoC在肿瘤细胞浸润和转移过程中的信号转导机制，我们构建了含全长rhoC编码eDNA的原核表达载体，在大肠杆菌中表达GST—RhoC融合蛋白，为该基因的体外GST．pulldown实验及免疫共沉淀实验作准备。目的：构建人拍以基因的原核表达载体，体外诱导表达GST—RhoC融合蛋白及表达产物的纯化。方法：从新鲜人直肠癌组织中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链，以此eDNA为模板经PCR扩增目的片段，连接到pMDl8一T载体。测序结果正确后，再连接到表达载体pET42，IPTG诱导GST—RhoC表

4、达并用亲和层析方法纯化。结果：DNA测序结果证明用RT2PCR扩增得到了全长rhoC基因编码序列：经限制性内切酶酶切图谱分析证明rhoC被重组到表达载体中；用SDS．PAGE证明经IPTG诱导后在体外成功表达了GST．RhoC融合蛋白。结论：成功构建了人rhoC基因原核表达载体，并进行了体外表达。关键词：rhoCRT．PCR基因重组原核表达融合蛋白兰州大学硕士研究生学位论文ConstructionofhumanrhoCgenevectoranditsexpressioninEscherichiacoilA、bstractLotsofstudiesdemonstrateect

5、opicoverexpressionofRhoCincreasesthetumorigenicandmetastaticpropertiesoftumorprogenitorcells．RhoCmaybeamolecularswitchtoregulatemetastasisoftumorcellToinvestigatetheinteractionbetweenRhoCandotherproteinswithGST—pulldownandimmunoprecipitation，andtoelucidatethemechanismofinducinginvasionandm

6、etastasisoftumorcellbyRhoC，weconstructtherecombinantvectorpET42-humanrhoCandexpresstherecombinantproteininEscherichiacoli．0bjeetive：ToconstructtherecombinantvectorpET42一humanrhoCandexpresstherecombinantproteininEcoli．Methods：First．rectumtumortissuewasusedtoextracttotalRNA．Second，thefirst—s

7、trandofcDNAwassynthesizedbyM—MLVreversetranscriptase．Third，PCRwasusedtoampli对humanrhoCgene，which‘wasinsertedintopMDt8一Tvectorandthensequenced；RightrecombinantplamsidwasdigestedwithtwodifferentrestrictedenzymesandinsertedintopET42toconstructprokaryoticexpressio