peg10基因sirna真核表达载体的构建及其对

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1、PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对【关键词】PEG10基因；RNA干扰；表达载体　　【Abstract】AIM:ToconstructthesiRNAeukaryoticexpressionvectorsofPEG10geneandtoinvestigatetheirapoptosisinducingeffectontransfectedHepG2cellsinvitro.METHODS:ThreespecificsiRNAsofPEG10ine2000.RealtimequantitativePCReasuretheP

2、EG10mRNAexpressioninHepG2.Thecellgroetryandconfocalmicroscopy.RESULTS:ThreespecificsiRNAeukaryoticexpressionvectors(siRNA1,siRNA2,siRNA3)targetingPEG10RNAtovaryingdegrees.TheexpressionofPEG10mRNAarkablyinhibitedat48haftertransfection,andsiRNA2resultedinthehighestinhibit

3、ionrate(93.99%).HepG2groega公司）；optiMEM和转染试剂Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；高纯质粒提取试剂盒（杭州Vgene公司）；DNA凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；人AnnexinVFITC试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）.FACSort流式细胞仪（BactonDickinson公司）；FV500共聚焦显微镜（Olympus公司）；MultiskanMk3酶标仪（ThermoLabsystems公司）.　　1.2方法　　1.2.1siRNA靶序列的设计利用

4、GenBank检索PEG10mRNA（录入号：AB049834）全长序列，遵循siRNA的设计原则，通过Invivogen公司提供的siRNAine2000说明书进行.根据是否进行质粒转染和转染质粒的不同分为6组.即空白对照组(不进行转染的同期培养的HepG2细胞),空质粒组(转染psiRNAhH1neo空质粒),siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组(分别转染3个重组质粒siRNA1，siRNA2和siRNA3),非特异性siRNA组(转染重组的非特异性siRNA质粒).　　1．2．4实时定量PCR检测PEG10表达将重组质

5、粒和空质粒分别转染HepG2细胞并培养48h后用Trizol试剂提取各组1×107细胞总RNA，逆转录成cDNA第1链，然后以cDNA为模板，分别对PEG10基因及βactin进行RealtimePCR反应，反应体系为：cDNA1μL，20μmol/L的上下游引物各0.5μL，dNTP混合液3μL，TaqDNA聚合酶3U，MgCl2溶液3μL，10×PCR缓冲液2.5μL，SYBRGreenI6.25μL，去离子水补至25μL.PCR扩增条件94℃变性5min，35个PCR循环（94℃20s；58℃20s；72℃20s），72℃延伸5

6、min，75℃时检测荧光信号，绘制标准曲线.引物序列：PEG10，上游:5′CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA3′，下游:5′GCGTAGTGACCTCCTGTTCCA3′；βactin，上游:5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，下游:5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′.根据绘制的标准曲线得到PEG10基因及βactin表达的相对浓度，以PEG10基因与βactin相对浓度的比值来反映PEG10表达量.每个样品做2个平行管，实验重复3次.使用RotorGene6.0分析软件对实验结果进行分析.PEG

7、10表达抑制率(%)=（1-转染组PEG10表达量/对照组PEG10表达量）×100％.　　1.2.5MTT法检测细胞增殖取对数生长期HepG2细胞，转染前1日以1×104/孔接种96孔板，将重组质粒和空质粒分别转染细胞中，继续培养24，48，72，96，120h后分别加入5g/LMTT20μL，37℃避光孵育4h，弃去培养基，加入100μLDMSO，避光30min，待其完全溶解后，用酶标仪测定A490nm值.以空质粒转染组作为阴性对照，实验重复3次，细胞生长抑制率(%)＝（1-转染组吸光度值/对照组吸光度值）×100％.　　1.2.

8、6流式细胞仪检测凋亡率收集转染48h的HepG2细胞，PBS洗涤并重悬细胞，750mL/L冰乙醇固定1h，PBS冲洗后加入终浓度为50mg/L的碘化吡啶(PI)和终浓度为100mg/L的RNaseA，避光30min后，上