sirna真核表达载体阻断hela细胞stathmin基因表达研究

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1、SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究作者：王燕，吴冰，苏海川，刘丽，林芳，张惠中【关键词】真核表达载体BlockingeffectofvectorbasedsiRNAonstathmingeneexpressioninhumanHeLacells　　【Abstract】AIM:ToexploretheblockingeffectofsiRNAontheexpressionofstathmingeneinHeLacelllineusingsiRNAeukaryoticexpressionvector.METHODS:TinsiRNAcDNAsingen

2、esequenceandclonedintothevectorpSilencer4.1CMVneoandnamedpSilencerS1andpSilencerS2respectively,entsingeneexpression.CONCLUSION:ThevectorbasedsiRNAonstathmingenecaneffectivelyknockdoingeneexpression,alignanttumors.　　【Keyin;RNA,smallinterfering;eukaryoticexpressionvector;HeLacells　　【摘要】目的：构建人st

3、athmin基因的siRNA真核表达载体，探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用.方法：将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1CMVneo真核表达载体，酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞，G418筛选后RTPCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果.结果：经酶切及测序鉴定，成功构建siRNA真核表达载体.经脂质体转染HeLa细胞后，RTPCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平

4、明显降低.结论：成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencerS1和pSilencerS2，并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用.　　【关键词】stathmin；RNA，小分子干扰；真核表达载体；HeLa细胞　　0引言　　Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明［1，2］通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达均证实，抑制其表达可使细胞受阻于G2/M期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转.因此，stathmin是一个极具吸引力

5、的恶性肿瘤生物治疗新靶点.RNA干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解与之序列相对应的细胞内mRNA,使基因转录后沉默.许多学者［3-5］认为该技术的出现是基因功能研究及基因治疗研究手段的又一次革命性突破.本试验通过构建针对stathmin基因的siRNA真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内stathmin基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式.　　1材料和方法　　1.1材料　　质粒提取试剂盒（inipreps　DNA　Purification　System）,pGEMTeasy载体连接试剂盒，逆转录试剂盒ReverseTranscriptionSystem购自Prome

6、ga公司.pSilencer4.1CMVneo载体及阴性对照pSilencer4.1CMVneonegtivecontrol为Ambion公司产品.限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ为Takara公司产品，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司.TaqDNA聚合酶，DGL2000DNAMarker及琼脂糖凝胶购自鼎国生物技术有限公司.HeLa细胞及宿主菌株大肠杆菌JM109为本实验室保存.　　1.2方法　　1.2.1针对stathmin基因的siRNAcDNA设计和制备根据GenBank中stathmin基因的序列及siRNA设计原则，在编码区内选择两段1

7、9nt(分别位于基因序列中：398417;540559)作为不同的干涉区域，分别进行BLAST分析.根据RNA干涉载体pSilencer4.1CMVneo的要求分别于上、下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点.每段各设计一对55个碱基的序列，由博亚生物技术有限公司合成.两对stathmin基因的siRNAcDNA序列如下：5′GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAATTCAAGAGATTTCTCGTGCTCTCGTTTCAGAAGCTT3′，互补链为：5′AAGCTTC