sirna真核表达载体阻断hela细胞stathmin基因表达研究(1)

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1、SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究(1)　　作者：王燕，吴冰，苏海川，刘丽，林芳，张惠中　　【关键词】真核表达载体　　BlockingeffectofvectorbasedsiRNAonstathmingeneexpressioninhumanHeLacells　　【Abstract】AIM:ToexploretheblockingeffectofsiRNAontheexpressionofstathmingeneinHeLacelllineusingsiRNAeukaryoticexpressionvecto

2、r.METHODS:TwostathminsiRNAcDNAsweresynthesizedaccordingtothestathmingenesequenceandclonedintothevectorandnamedpSilencerS1andpSilencerS2respectively,whichwerefurtheridentifiedbyrestrictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequencing.HeLacellswerethentransfectedwithpSilencer

3、S1andpSilencerS2.AfterG418selection,thecellswereselectedandtheinterferingeffectwasdetectedbyRTPCR.RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequencingresultsshowedthatthe2targetsegmentswereclonedintoneovectorrespectively.TheresultsofRTPCRindicatedthatbothsiRNAve

4、ctorscouldsuccessfullyknockdownstathmingeneexpression.CONCLUSION:ThevectorbasedsiRNAonstathmingenecaneffectivelyknockdownstathmingeneexpression,whichhasthepotentialofbeingappliedingenetherapyagainstmalignanttumors.　　【Keywords】stathmin;RNA,smallinterfering;eukaryoticexpressi

5、onvector;HeLacells　　【摘要】目的：构建人stathmin基因的siRNA真核表达载体，探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用.方法：将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的neo真核表达载体，酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞，G418筛选后RTPCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果.结果：经酶切及测序鉴定，成功构建siRNA真核表达载体.经脂质体转染HeLa细胞后，RTPCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑

6、制了目的基因的表达，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低.结论：成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencerS1和pSilencerS2，并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用.　　【关键词】stathmin；RNA，小分子干扰；真核表达载体；HeLa细胞　　　0引言　　Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明［1，2］通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达均证

7、实，抑制其表达可使细胞受阻于G2/M期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转.因此，stathmin是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点.RNA干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解与之序列相对应的细胞内mRNA,使基因转录后沉默.许多学者［3-5］认为该技术的出现是基因功能研究及基因治疗研究手段的又一次革命性突破.本试验通过构建针对stathmin基因的siRNA真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内stathmin基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式.　　1材料和方法　　材料　　质粒提取试剂盒（Wizard　plus　Minipr

8、eps　DNA　Purification　System）,pGEMTeasy载体连接试剂盒，逆转录试剂盒ReverseTranscriptionSystem购自Pr