特异性沉默eca109细胞系stathmin基因sirna表达载体的构建

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1、特异性沉默Eca109细胞系stathmin基因siRNA表达载体的构建：王峰，王留兴，王瑞林，樊青霞，赵培荣【摘要】目的构建并筛选特异性沉默stathmin基因的pSUPERS逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞克隆。方法用DNA重组技术，将64nt能转录产生靶向stathmin小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列，定向克隆入逆转录病毒载体pSUPEREGFP，应用脂质体将重组逆转录病毒载体pSUPERS转染细胞系Eca109，G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，RTPCR检测转染细胞stathminmRNA的表达。结果重组逆转录病毒载体

2、经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，可见4692nt和285nt条带；测序结果表明插入序列正确；重组载体转染Eca109细胞，可表达绿色荧光蛋白（EGFP），经G418筛选得到抗性细胞克隆，转染细胞stathminmRNA的表达较对照组明显减弱。结论特异性沉默stathmin基因的pSUPERS逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞系构建和筛选成功。【关键词】小干扰RNA；stathmin基因；pSUPEREGFP载体；Eca109细胞　　Abstract：ObjectiveToconstructandidentifyarebinantretroviralvect

3、orpSUPERSthattargetstathmingeneandastablevirusproducingcellline.MethodsThe64ntencodedtargetingstathmingeneshRNAsequenceedigestionandDNAsequencing.ThepackagingcellEca109idusingliposomebasedtransfectionandthestableintergrantedium.TheexpressionofstathminmRNAents,4692ntand285nt,resp

4、ectively.Theresultofsequencedemonstratedthat64nthadbeeninsertedintothevector.Greenfluorescentprotein（EGFP）ingeneingeneandastablevirusproducingpackagingcelllineallinterferingRNA;stathmingene;pSUPEREGFPvector;Eca109cells　　0引言　　食管癌是常见的恶性肿瘤之一。某些基因的异常表达与肿瘤发生、发展密切相关。Stathmin为一种高度保守的细胞内

5、蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明[1,2]通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达，可使细胞受阻于G2／M期，同时使恶性肿瘤表型发生逆转。stathmin成为恶性肿瘤生物治疗的新靶点。RNA干扰是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解相应的细胞内mRNA，使基因转录后沉默[3]。本研究应用含H1启动子的逆转录载体pSUPEREGFP构建了stathmin基因的siRNA表达载体pSUPERS，稳定转染Eca109细胞，以特异性沉默目的基因的表达，观察小干扰RNA（siRNA）

6、对靶基因表达的抑制作用，探讨肿瘤基因治疗的新模式。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞系和质粒人食管癌细胞Eca109、大肠杆菌JM109为郑州大学肿瘤中心保存;pSUPEREGFP质粒由郑州大学基础医学院丁一教授惠赠，靶向stathmin的64ntoligos由上海生物工程公司合成。　　1.1.2试剂限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶和Trizol试剂购自Promega公司;DNAMarker、DNAPurificationkit和RTPCR检测试剂盒购自大连宝信生物工程公司；脂质体转染试剂Lipofecti

7、ne2000和G418购自美国Invitrogene公司。　　1.2方法　　1.2.1靶向stathmin基因寡核苷酸的设计应用美国OligoEngine公司提供的双链RNA（siRNA）设计软件，选择合适的19nt靶序列，通过Blast搜索确认与人的其他基因序列无同源性。该19nt的序列分别为：5′GAAAGACGCAAGTCCCATG3′，5′ACGAGAGCACGAGAAAGAA3′，由上海生物工程公司合成两条64nt的互补单链，序列见表1。　　表1两条64nt的互补单链序列（略）　　1.2.2载体的选择选用pSUPEREGFP质粒为载体，经

8、BglⅡ和HindⅢ两酶切后与合成的64nt的寡核苷