针对人caspase8基因的sirna的载体的构建及其表达

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1、针对人caspase8基因的siRNA的载体的构建及其表达【摘要】目的构建针对人caspase8基因mRNA的siRNA表达载体，并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用。方法化学合成针对caspase8发夹状的RNA寡核苷酸，将其退火形成双链，连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞，RTPCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果成功地构建了针对人caspase8基因的RNA干涉真核表达载体p

2、SUPERC1和pSUPERC2，并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用，而且pSUPERC1对于caspase8基因的抑制作用要优于pSUPERC2。结论成功地构建了针对人caspase8基因的siRNA载体，转染HeLa细胞后可抑制caspase8基因的表达。【关键词】caspase8；RNA干涉；真核表达载体；HeLa细胞Abstract:ObjectiveToconstructtheeukaryoticexpressionvectorforRNAinterferencing

3、humancaspase8geneanddetectitsinterferenceeffectHeLacellline.MethodsTentsedigestionanalysisandDNAsequencingThenHeLacellsedigestionanalysisandDNAsequencingshoentsega公司产品。逆转录试剂盒、TrizolRNA分离试剂、Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品；RPMI1640、G418均购自GIBCO公司；caspase8鼠抗人Ig

4、G为abcam公司产品；Cy3标记的山羊抗鼠二抗购自博士德公司。1.2针对caspase8基因的寡核苷酸的设计和制备根据Genbank中caspase8基因的序列，在编码区内选择2段19nt(分别位于基因序列中188～207和1168～1187)为不同的干涉区域，分别进行BLAST比较，以避免与其它基因同源。根据RNA干涉载体pSUPER的要求，每段各设计一对长64个碱基的序列，由北京奥科生物公司合成。序列如下：5′GATCCGGAGCTGCTCTTCCGAATTTTCAAGAGAAATTCGGAAGAGCAGC

5、TCCTTTTTTGGAAA3′，互补链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGGAGCTGCTCTTCCGAATTTCTCTTGAAAATTCGGAAGAGCAGCTCCG3′；5′GATCCCGAGATATATCCCGGATGATTCAAGAGATCATCCGGGATATATCTCGTTTTTTGGAAA3′，互补链为5′AGCTTTTCCAAAAAACGAGATATATCCCGGATGATCTCTTGAATCATCCGGGATATATCTCGG3′，划线部分为siRNA引物序列，两端包含HindⅢ和B

6、glⅡ的识别位点。1.3构建siRNA的pSUPER表达载体用HindⅢ和BglⅡ双酶切pSUPER载体，37℃、3h、1％琼脂糖凝胶电泳后，回收载体大片段(上海华舜公司试剂盒)；将合成的互补链分别退火，形成带有黏端的双链，用T4连接酶分别连接入pSUPER载体中HindⅢ和BglⅡ的酶切位点之间。转化大肠杆菌DH5，挑选Amp抗性克隆，培养并制备质粒，用EcoRI、HindⅢ双酶切(因BglⅡ酶切位点已不存在)鉴定。酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序，将测序正确的克隆分别命名为pSUPERC1和pSUPER

7、C2。1.4脂质体介导的HeLa细胞的稳定转染在6孔板内按每孔1×106细胞接种细胞，第2天2个重组质粒及pSUPER载体质粒分别与pcDNA3载体质粒按10∶1的浓度共转染HeLa细胞，操作步骤按Lipofectamine2000说明书进行。转染48h后换为含400mlG418的选择培养基继续培养，10～15d后获得3种质粒，分别与pCDNA3质粒共转染后的HeLa细胞稳定克隆。1.5caspase8基因表达的RTPCR检测从mRNA水平检测caspase8的表达。分别收集3种共转染后的HeLa细胞和未转染的H

8、eLa细胞各5×106，采用TrizolRNA分离试剂提取细胞的RNA。取5μg总RNA，加入1μg的oligo(dT)1218(0．5μg/μl)，按照SuperScriptⅡRT逆转录试剂盒产品说明书操作，合成cDNA第1链。PCR引物由primer5.0软件设计(基因序列中144～1192，片段长958bp，包含了2个干