peg10基因sirna真核表达载体的构建及其对肝癌hepg2细胞凋亡的影响论文

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1、PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响论文【关键词】PEG10基因；RNA干扰；表达载体【Abstract】AIM:ToconstructthesiRNAeukaryoticexpressionvectorsofPEG10geneandtoinvestigatetheirapoptosisinducingeffectontransfectedHepG2cellsinvitro.METHODS:ThreespecificsiRNAsofPEG10ine2000.Realtimequantitative

2、PCReasurethePEG10mRNAexpressioninHepG2.Thecellgroetryandconfocalmicroscopy.RESULTS:ThreespecificsiRNAeukaryoticexpressionvectors(siRNA1,siRNA2,siRNA3)targetingPEG10RNAtovaryingdegrees.TheexpressionofPEG10mRNAarkablyinhibitedat48haftertransfection,andsiRNA2resultedinthehi

3、ghestinhibitionrate(93.99%).HepG2groega公司）；optiMEM和转染试剂Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；高纯质粒提取试剂盒（杭州Vgene公司）；DNA凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；人AnnexinVFITC试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）.FACSort流式细胞仪（BactonDickinson公司）；FV500共聚焦显微镜（Olympus公司）；MultiskanMk3酶标仪（ThermoLabsystems公司）.1.2方法1.2.1siRNA靶

4、序列的设计利用GenBank检索PEG10mRNA（录入号：AB049834）全长序列，遵循siRNA的设计原则，通过Invivogen公司提供的siRNAgCl2溶液3μL，10×PCR缓冲液2.5μL，SYBRGreenI6.25μL，去离子水补至25μL.PCR扩增条件94℃变性5min，35个PCR循环（94℃20s；58℃20s；72℃20s），72℃延伸5min，75℃时检测荧光信号，绘制标准曲线.引物序列：PEG10，上游:5′CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA3′，下游:5′GCGTAGTGACCTCCTGTTC

5、CA3′；βactin，上游:5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，下游:5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′.根据绘制的标准曲线得到PEG10基因及βactin表达的相对浓度，以PEG10基因与βactin相对浓度的比值来反映PEG10表达量.每个样品做2个平行管，实验重复3次.使用RotorGene6.0分析软件对实验结果进行分析.PEG10表达抑制率(%)=（1-转染组PEG10表达量/对照组PEG10表达量）×100％.1.2.5MTT法检测细胞增殖取对数生长期HepG2细胞，转染前1日以1×104/孔接

6、种96孔板，将重组质粒和空质粒分别转染细胞中，继续培养24，48，72，96，120h后分别加入5g/LMTT20μL，37℃避光孵育4h，弃去培养基，加入100μLDMSO，避光30min，待其完全溶解后，用酶标仪测定A490nm值.以空质粒转染组作为阴性对照，实验重复3次，细胞生长抑制率(%)＝（1-转染组吸光度值/对照组吸光度值）×100％.1.2.6流式细胞仪检测凋亡率收集转染48h的HepG2细胞，PBS洗涤并重悬细胞，750mL/L冰乙醇固定1h，PBS冲洗后加入终浓度为50mg/L的碘化吡啶(PI)和终浓度为100mg/L

7、的RNaseA，避光30min后，上机检测.1.2.7共聚焦显微镜检测将PBS洗涤转染48h的HepG2细胞，加入250μL结合缓冲液，再加入5μLAnnexinV/FITC，混匀后于室温避光孵育10～15min，加入20mg/L的PI10μL，室温避光孵育5～10min，在共聚焦显微镜下观察并拍照.统计学分析：采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P0.05表示差异有统计学意义.2结果2．1psiRNAhH1neo重组质粒测序鉴定取白色克隆菌液送上海英骏生物公司测序鉴定，结果显示

8、插入的siRNA1，siRNA2和siRNA3片段已正确连入psiRNAhH1neo载体，重组质粒构建成功.2．2siRNA表达载体对PEG10基因mRNA的抑制作用实时定量PCR结果显示，未转染组、空质粒